CN107179272B - 一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统及方法，涉及膜片钳封接细胞捕捉领域，特别适用于膜片钳实验中在显微镜下快速捕捉符合封接条件的急性分离的神经细胞。该系统包括显微镜电子目镜、计算机、单片机、驱动器、步进电机和膜片钳系统显微镜载物台。本发明提供的系统能够精确捕捉符合封接条件的神经细胞，将不符合封接条件的细胞予以剔除，并自动移动膜片钳系统显微镜载物台，使细胞移至显微镜视野中央，可大大节省膜片钳实验中寻找符合封接条件细胞的时间和精力，并使长时间在显微镜下工作实验人员避免出现头晕、恶心等不良反应，且加装在膜片钳系统中不影响其它任何操作，因此易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及膜片钳封接细胞捕捉领域，具体是一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统及方法。
背景技术
膜片钳技术是用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成 10～100吉欧的密封，然后对该膜片实行电压钳位或电流钳位，可测量因离子通道开放而产生的膜电流或膜电位变化。通过膜片钳系统观测通道开放和关闭导致的膜电流或膜电位变化，可分析它们与诱导通道开放或关闭的电压、电流、药物等之间的关系。膜片钳系统已被广泛应用于生理、药理等研究工作，许多高校都配有该设备。但膜片钳系统本身对细胞有较高的要求，特别是研究急性分离的神经细胞时，分离的神经细胞如表面不光滑、消化过度等都会导致这些细胞不符合封接条件，从而不能顺利完成膜片钳实验。由于一次急性分离的神经细胞数量多，还带有许多杂质，找寻符合封接条件的神经细胞和封接细胞的过程又都必须在显微镜视野下进行，研究人员往往要在显微镜下工作相当长的时间，多数会出现头晕、恶心等不良反应，因此能够自动完成显微镜视野中寻找目标细胞的装置，可以大大节省膜片钳实验中寻找符合封接条件细胞的时间和精力。
目前虽然已有对细胞图像的自动识别技术和可自动移动的膜片钳系统显微镜载物台，但主要针对的都是显微镜用于大批量产品的检测，特别是细胞分类和计数，不需要对细胞进行精确识别和定位。而膜片钳实验则需要精确捕捉符合封接条件的神经细胞，将周围有杂质的细胞，酶消化过度和消化不到位的细胞进行剔除，这就对细胞图像的识别提出了更高的要求。同时膜片钳系统还要对捕捉的细胞进行微操纵器操作下的封接，这就要求对捕捉到的细胞进行精确定位，自动移动膜片钳系统显微镜载物台，使细胞移至显微镜中央视野中可封接的位置。
发明内容
本发明的目的提供一种可用于膜片钳系统的显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统及方法，可自动完成膜片钳实验中寻找符合封接条件的神经细胞这一过程，避免研究人员因要在显微镜下工作相当长的时间而出现的头晕、恶心等不良反应，提高膜片钳实验效率。
为达到上述目的，本发明的采用的技术解决方案是：
一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统，包括显微镜电子目镜、计算机、单片机、驱动器、步进电机和膜片钳系统显微镜载物台，
所述膜片钳系统显微镜载物台，位于所述显微镜电子目镜下方，用于承载待研究的急性分离神经细胞；
所述显微镜电子目镜，与计算机连接，用于获取显微镜下细胞图像，并将获取的细胞图像传送至计算机；
所述计算机与单片机连接，用于对细胞图像进行处理得到单像素图像，识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞，并获取其坐标值，然后将坐标值传输给单片机；
所述单片机与驱动器连接，用于根据获得的坐标值控制驱动器驱动步进电机，使步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台移动，将细胞移动到显微镜的视野中。
进一步的，所述电子目镜采用CMOS型图像传感器。
进一步的，所述步进电机包括横向步进电机和纵向步进电机，为两相四线的双相步进电机。
进一步的，所述计算机对细胞图像进行处理得到单像素图像具体过程为：
将细胞图像转换成计算机视觉图像，对计算机视觉图像进行灰度处理，将彩色图像转换成灰度图像；
将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，得到轮廓完整且细胞与背景分割的单像素图像。
进一步的，所述识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞具体过程为：
对所述单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，提取出细胞的边缘像素点；
利用细胞形态与椭圆的相似性，使用RED算法从提取的边缘像素点中识别可能的椭圆，通过对椭圆点收集来判断是否为真实的椭圆，如果判断结果为是即捕捉到符合封接条件的急性分离的神经细胞。
一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法，其特征在于其采用上述系统进行，所述方法包括如下步骤：
步骤一、电子目镜获取显微镜镜下细胞图像，并将获取的细胞图像传送至计算机；
步骤二、所述计算机对细胞图像进行处理得到单像素图像，识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞，并获取其坐标值，然后将坐标值传输给单片机；
步骤三、所述单片机根据获得的坐标值控制驱动器驱动步进电机，使步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台移动，将细胞移动到显微镜的视野中。
进一步的，所述计算机对细胞图像进行处理具体过程为：
将细胞图像转换成计算机视觉图像，对计算机视觉图像进行灰度处理，将彩色图像转换成灰度图像；
将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，得到轮廓完整且细胞与背景分割的单像素图像。
进一步的，所述识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞具体过程为：
对所述单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，提取出细胞的边缘像素点；
利用细胞形态与椭圆的相似性，使用RED算法从提取的边缘像素点中识别可能的椭圆；
通过对椭圆点收集来判断是否为真实的椭圆，如果判断结果为是即捕捉到符合封接条件的急性分离的神经细胞。
进一步的，将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，得到轮廓完整且细胞与背景分割的单像素图像具体为：
利用公式(1)对灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，这样基本上去除了灰度图像中背景的灰度信息，变为白色背景；
f(x,y)表示原图像在像素点(x,y)处的灰度值，F1(x,y)表示处理后的图像在像素点(x,y)处的灰度值，Th1是阈值；
然后利用公式(2)的高斯函数产生模版，再利用该模版与获得的二值化图像进行卷积运算，即高斯模糊处理；
其中σ表示标准差，G(x,y)表示模版在点(x,y)的值；
之后利用公式(3)对高斯模糊处理后的图像再次进行阈值分割；
f(x,y)表示原图像在像素点(x,y)处的灰度值，F2(x,y)表示处理后的图像在像素点(x,y)处的灰度值，Th2是阈值；
最后对图像中的孔洞部分进行填充处理：设二值化的图像含有的目标区域的边界值为1，非边界为0，边界点集记为A，从边界内的一点P开始，令X0＝P＝1，用公式(4)进行迭代来填充孔洞区域，迭代至Xk＝Xk-1为止，式中B为填充的结构单元，k为迭代的次数，
孔洞填充完成后，得到较完整的细胞与背景分割的单像素图像。
进一步的，对所述单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，提取出细胞的边缘像素点具体步骤为：(1)对单像素图像使用带有指定标准偏差的σ高斯滤波来进行平滑，从而减少噪声；
(2)计算图像中的每一像素点的局部梯度，根据将该像素点的梯度幅度值判定该像素点是否为边缘点；
其中梯度的幅度
梯度的方向角度
g(x,y)表示梯度的幅度，α(x,y)表示梯度的方向角度，Gx表示x方向的梯度幅度，Gy表示y方向的梯度幅度，根据将该像素点的梯度幅度值与其相邻像素点的所有模值(两像素点的距离)比较，若梯度幅度值是最大值，该判定该像素点为边缘点，否则该像素点不是边缘点；
使用RED算法从提取的边缘像素点中识别可能的椭圆具体为：
从边缘点集D中，随机的取出6个不共线的点，并且把它们存入到一个数组P中，然后取出P中的5个点(Pi＝(xi,yi)，i＝1，2，3， 4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：
Ax2+Bxy+cy2+Dx+Ey+1＝0 (5)
解出方程组公式(6)，即可求出曲线参数(A，B，C，D，E) 的值，当且仅当B2-4AC<0时，解出的二次曲线为椭圆，并记作Q1-5，然后将求出的Q1-5参数与没有使用的第6个边缘像素点P6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：
公式(7)求出的是P6点到椭圆Q1-5的距离的绝对值，其结果用 d6表示，当P6点在椭圆Q1-5上时，公式(7)中d6的值应为0，此时认为该椭圆是可能的椭圆并记为Qp；
通过对椭圆点收集来判断是否为真实的椭圆具体为：首先，将计数器清零，使用计数器统计位于椭圆上的边缘点的个数，然后查找边缘点集中的所有点，并计算出这些点到可能椭圆的距离，若求得的距离比设定的阈值小，将计数器加1，并在可能椭圆的边缘点集中加入这个点，同时将它从边缘点集D中去除；反之则继续遍历D中的下一个点，直到D中的点全部检测完，这时统计可能椭圆的边缘点集中的点的个数，若并高于预设的阈值，则判定检测到的椭圆是一个真实的椭圆，反之则将边缘点集中的点返回到边缘点集中，再重新进行检测。
本发明通过对电子目镜获取的显微镜镜下图像进行形状识别，找出符合封接条件的神经细胞，再驱动步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台，将细胞移动到显微镜的视野中央，自动完成膜片钳实验中耗费大量时间和精力寻找符合封接条件的神经细胞这一过程，避免研究人员因要在显微镜下工作相当长的时间而出现的头晕、恶心等不良反应，提高膜片钳实验效率。
本发明可用于膜片钳系统的显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统，可用于急性分离的神经细胞膜片钳实验符合封接条件的目标细胞捕捉，其结合不同种类的细胞识别系统，如培养的三角锥形神经细胞、急性分离的短柱状心肌细胞和长条形骨骼肌细胞等，可应用于不同细胞电生理检测的膜片钳实验，实现符合膜片钳封接条件的目标细胞自动获取。
附图说明
图1是本发明显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统其中一个实施例的结构示意图；
图2是本发明细胞图像处理流程图；
图3是本发明RED算法基本流程图；
图4是本发明捕捉到的符合封接要求的细胞图像。
图中：1—显微镜电子目镜；2—计算机；3—单片机；4—驱动器； 5—横向步进电机；6—纵向步进电机；7—膜片钳系统显微镜载物台。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
图1所示为本发明显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统其中一个实施例的结构示意图，所述系统包括显微镜电子目镜1、计算机2、单片机3、驱动器4、步进电机和膜片钳系统显微镜载物台7，其中步进电机包括横向步进电机5和纵向步进电机6。
所述膜片钳系统显微镜载物台7位于所述显微镜电子目镜1下方，用于承载待研究的急性分离神经细胞；
所述显微镜电子目镜1与计算机2连接，用于获取显微镜下细胞图像，并将获取的细胞图像传送至计算机2。本发明中电子目镜1可采用CMOS型图像传感器，在电池寿命和低成本上具有较大优势，且具有操作简单、价格低廉、方便安装等特点。通过USB线缆，可将显微镜下的光信号转换成电信号(形成能方便处理的数字图像)实时传输至计算机2进行显示。
所述计算机2与单片机3连接，用于对细胞图像进行处理后识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞，并获取其坐标值，然后将坐标值传输给单片机3。
本发明采取抓帧的方式来进行细胞图像的分析。通过编写MFC 上的控件，调用函数cvCreateCameraCapture()来获取电子目镜1上的实时数据，并根据需要对控件进行操作，从视频流中获取需要的某一帧或者某几帧，并把每一帧数据写入到一张图像中，方便后面对图像进行处理和分析，同时也方便后期的检查和处理。
其中对细胞图像进行处理的流程如图2所示，包括如下步骤：
1、将细胞图像转换成计算机视觉图像，对计算机视觉图像进行灰度处理，可避免彩色图像干扰。在本实施例中采用的是bmp格式的图像，它由R(红)、G(绿)、B(蓝)3个分量组成的。将彩色图像转换成灰度图像，采用颜色编码(YUV)的方法来进行，其中“Y”表示的是明亮度(Luminance)，也就是灰阶值，在只需要进行灰度表示时，一幅灰度图用Y分量就能表示出来。从RGB到YUV空间的 Y转换公式如下：
Y＝0.299R+0.587G+0.114B
通过此公式可以直接把包含R、G、B三个分量的彩色图像转换成只包含亮度信息的图像。
2、将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，这样改进后的边缘检测算法获得的轮廓更完整且是单像素。
由于灰度图像存在以下两点对Canny算子边缘检测的干扰较大： 1)大量的背景灰度信息；2)细胞的边缘模糊，存在伪边缘。于是本发明在使用Canny算子进行边缘检测前，采取以下方法对这两点进行处理，首先利用公式(1)对灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，这样基本上去除了灰度图像中背景的灰度信息，变为白色背景。
然后利用公式(2)的高斯函数产生模版，再利用该模版与获得的二值化图像进行卷积运算，即高斯模糊处理。
通常所用的高斯模糊半径r与σ的关系为高斯模糊处理能去除细胞图像的伪边缘，使背景与边缘的分界变得明显。之后利用公式(3)对高斯模糊处理后的图像再次进行阈值分割。
这样就将细胞与背景完全区分。最后对图像中的孔洞部分进行填充处理，孔洞填充的原理如下：设二值化的图像含有的目标区域的边界值为1，非边界为0，边界点集记为A，从边界内的一点P开始，令X0＝P＝1，可用公式(4)进行迭代来填充孔洞区域，迭代至Xk＝Xk-1为止，式中B为填充的结构单元，k为迭代的次数。
孔洞填充完成后，就可以得到较完整的细胞与背景分割的单像素图像。
识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞具体步骤为：
对上述步骤得到的单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，对镜下物质的形状进行识别。具体的，首先采用Canny算子来进行边缘检测，边缘检测的目的是要提取出细胞的边缘像素点，用于椭圆拟合中计算椭圆的参数。Canny算子边缘检测的方法是：
(1)对单像素图像使用带有指定标准偏差的σ高斯滤波来进行平滑，从而减少噪声；
(2)计算图像中的每一像素点的局部梯度，根据将该像素点的梯度幅度值判定该像素点是否为边缘点；
其中梯度的幅度
梯度的方向角度
g(x,y)表示梯度的幅度，α(x,y)表示梯度的方向角度，Gx表示x方向的梯度幅度，Gy表示y方向的梯度幅度，根据将该像素点的梯度幅度值与其相邻像素点的所有模值(两像素点的距离)比较，若梯度幅度值是最大值，该判定该像素点为边缘点，否则该像素点不是边缘点；
在上一步的处理过程中，确定边缘点时，由于处理的原因，梯度图像会出现脊，需要消去不相关的点。首先，找到所有脊的顶部，即最大值，然后把其它值置为零消除掉脊，得出一条细线。在实施过程中，通过设定2个阈值来进行处理，其中T1<T2，强边缘像素指的是大于T2的像素值，而弱边缘像素指的是大于T1并且小于T2的像素值。
在需要对边缘进行链接时(强边缘与弱边缘要进行链接，以保证边缘的顺滑与真实性)，如果缺失部分都是弱像素点，这时可以将8 个连接在一起的弱像素集成到强像素，以此来填补缺失部分。
Canny算子是可以检测出强边缘和弱边缘，并且前述可以边缘链接可得知，弱边缘是可以被包含在输出中的，当需要对边缘进行连接时，弱边缘可以很好的与强边缘进行连接，这种方法不仅能够很好的检测出真正的弱边缘，而且还可以避免弱边缘受到噪声的干扰。
边缘检测后，利用细胞形态与椭圆的相似性，使用RED算法识别可能的椭圆点，再通过对椭圆点收集来进行进一步判断，看是否为真实的椭圆，剔除周围有杂质的细胞，酶消化过度和消化不到位的细胞，从而对符合封接条件的细胞进行查找和定位。本发明对符合封接条件的细胞识别主要采用形态学上的识别方法，急性分离的神经细胞形态上与椭圆相似，周围有杂质的细胞、酶消化过度和消化不到位的细胞均不符合真实椭圆的判别要求，因此计算机2通过寻找真实的椭圆来对符合封接条件的细胞进行识别和确认。
RED算法基本流程图如图3所示。首先，从边缘点集D中，随机的取出6个不共线的点，并且把它们存入到一个数组P中，然后取出P中的5个点(Pi＝(xi,yi)，i＝1，2，3，4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：
Ax2+Bxy+cy2+Dx+Ey+1＝0 (5)
解出方程组公式(6)，即可求出曲线参数(A，B，C，D，E) 的值。当且仅当B2-4AC<0时，解出的二次曲线为椭圆，并记作Q1-5。然后将求出的Q1-5参数与没有使用的第6个边缘像素点P6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：
公式(7)求出的是P6点到椭圆Q1-5的距离的绝对值，其结果用 d6表示。当P6点在椭圆Q1-5上时，那么式(7)中d6的值就应该为0，此时就认为该椭圆是可能的椭圆并记为Qp。在实际的检测过程中，通过给定一个很小的阈值Td，来进行判断。当d6<Td时，就认为P中的6个点是位于同一个椭圆上的，同时确定该椭圆是一个可能的椭圆。
再通过对椭圆点收集来判断真实的椭圆。首先，把计数器清零，用它来统计位于椭圆上的边缘点的个数，然后查找边缘点集中的所有点，并计算出这些点到可能椭圆的距离，如果求得的距离比设定的阈值小，就让计数器加1，并在可能椭圆的边缘点集中加入这个点，同时将它从边缘点集D中去除；反之则继续遍历D中的下一个点，直到D中的点全部被检测完。这时统计可能椭圆的边缘点集中的点的个数，看它是否高于一个设定的阈值，如果高于这个值，就认为检测到的椭圆是一个真实的椭圆，反之则把点集中的点返回到边缘点集中，再重新进行检测。这个方法由于每次都会从点集D中抽取点来进行检测，并且不会重复检测那些已经确定了的点，有效的减少了运算量，也提高了运行的效率。由于存在检测到的边缘可能不是单一像素点组成的情况，让边缘存在一定的厚度，造成在该处检测到多个椭圆，这时就需要对这些椭圆进行拟合，把这些椭圆拟合成为一个椭圆，这个拟合出来的椭圆，就是需要查找的椭圆，即捕捉到符合封接要求的细胞。通过上述方法捕捉到的符合封接要求的细胞图像如图4所示，其中A、B两个圆圈圈住部分即为本发明最终捕捉到的两个符合封接要求的细胞。
通过对比现有技术和采用本发明技术两次Canny算子检测图像明显可以看到改进后的边缘检测算法获得的轮廓更完整且是单像素。以前的方法上边轮廓不完整，下侧轮廓内包含多余的不感兴趣的轮廓，改进后的算法检测的边缘轮廓更完整更好。最终拟合的图像(图4) 也是改进后的要大大优于以前的方法。
所述单片机3与驱动器4连接，用于根据获得的坐标值控制驱动器4驱动步进电机，使步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台7移动，将细胞移动到显微镜的视野中。其中步进电机可与膜片钳系统显微镜载物台7的移动按钮驱动连接，步进电机根据驱动器4下发的指令扭动膜片钳系统显微镜载物台7的移动按钮实现膜片钳系统显微镜载物台7的移动。计算机2与单片机3在RS-232C的标准下进行异步通信中数据的发送和接收，将数据传输给STC90C516RD+系列的单片机，再通过单片机的P1串口，对步进电机驱动器发送数据或脉冲驱动其移动。
所述驱动器4可采用ZD-6209-V2C驱动器，2个两相四线的步进电机(横向步进电机5和纵向步进电机6)直接和驱动器4相连，选用齿数为40齿的同步带轮，采用外部调速下的16细分方式驱动，所述的步进电机的步距角为0.28°，即步进电机每步走0.28°。
计算机2能够计算出确认的目标细胞的X轴和Y轴坐标值，并通过角度计算公式求出X轴和Y轴步进电机所应该走的步数，处理完成的数据通过串口线被所述的计算机2逐级传输给单片机3和步进电机驱动器4，通过驱动器4驱动步进电机转动，带动传动带，传动带的另一边的膜片钳系统显微镜载物台7做出相应的移动，使符合封接条件的目标细胞自动出现在显微镜的视野中央，从而实现了细胞的捕捉和跟踪过程。
本发明还提供一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法，利用上述系统进行，包括如下步骤：
步骤一、电子目镜1获取显微镜镜下细胞图像，并将获取的细胞图像传送至计算机2；
步骤二、所述计算机2对细胞图像进行处理后识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞，并获取其坐标值，然后将坐标值传输给单片机3；
其中，所述计算机2对细胞图像进行处理具体过程为：
1)将细胞图像转换成计算机视觉图像，对计算机视觉图像进行灰度处理，将彩色图像转换成灰度图像；本实施例中计算机视觉图像采用bmp格式，从RGB到YUV空间的Y转换公式如下：
Y＝0.299R+0.587G+0.114B
通过此公式可以直接把包含R、G、B三个分量的彩色图像转换成只包含亮度信息的图像。
2)将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，得到轮廓完整且细胞与背景分割的单像素图像。
具体的，利用公式(1)对灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像
然后利用公式(2)的高斯函数产生模版，再利用该模版与获得的二值化图像进行卷积运算，即高斯模糊处理。
之后利用公式(3)对高斯模糊处理后的图像再次进行阈值分割
对图像中的孔洞部分进行填充处理具体为：
设二值化的图像含有的目标区域的边界值为1，非边界为0，边界点集记为A，从边界内的一点P开始，令X0＝P＝1，可用公式(4) 进行迭代来填充孔洞区域，迭代至Xk＝Xk-1为止，式中B为填充的结构单元，k为迭代的次数。
孔洞填充完成后，就可以得到较完整的细胞与背景分割的单像素图像。
所述识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞具体过程为：
1)对所述单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，提取出细胞的边缘像素点；具体的，对单像素图像使用带有指定标准偏差的σ高斯滤波来进行平滑，计算图像中的每一像素点的局部梯度，根据将该像素点的梯度幅度值判定该像素点是否为边缘点。
2)利用细胞形态与椭圆的相似性，使用RED算法从提取的边缘像素点中识别可能的椭圆，通过对椭圆点收集来判断是否为真实的椭圆，如果判断结果为是即捕捉到符合封接条件的急性分离的神经细胞。具体的，从边缘点集D中，随机的取出6个不共线的点，并且把它们存入到一个数组P中，然后取出P中的5个点(Pi＝(xi,yi)，i＝1，2， 3，4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：
Ax2+Bxy+cy2+Dx+Ey+1＝0 (5)
解出方程组公式(6)，即可求出曲线参数(A，B，C，D，E) 的值。当且仅当B2-4AC<0时，解出的二次曲线为椭圆，并记作Q1-5。然后将求出的Q1-5参数与没有使用的第6个边缘像素点P6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：
公式(7)求出的是P6点到椭圆Q1-5的距离的绝对值，其结果用 d6表示。当P6点在椭圆Q1-5上时，那么式(7)中d6的值就应该为0，此时就认为该椭圆是可能的椭圆并记为Qp。
再通过对椭圆点收集来判断真实的椭圆。首先，把计数器清零，用它来统计位于椭圆上的边缘点的个数，然后查找边缘点集中的所有点，并计算出这些点到可能椭圆的距离，如果求得的距离比设定的阈值小，就让计数器加1，并在可能椭圆的边缘点集中加入这个点，同时将它从边缘点集D中去除；反之则继续遍历D中的下一个点，直到D中的点全部被检测完。这时统计可能椭圆的边缘点集中的点的个数，看它是否高于一个设定的阈值，如果高于这个值，就认为检测到的椭圆是一个真实的椭圆，反之则把点集中的点返回到边缘点集中，再重新进行检测。
步骤三、所述单片机3根据获得的坐标值控制驱动器4驱动步进电机，使步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台7移动，将细胞移动到显微镜的视野中。
本发明通过显微镜电子目镜1获取显微镜下细胞图像，再通过计算机2对细胞进行识别和精确定位，然后将定位后的坐标支传输给单片机3，通过步进电机驱动器控制与膜片钳系统膜片钳系统显微镜载物台7相连接的双相步进电机，移动膜片钳系统显微镜载物台7，使符合封接条件的神经细胞自动出现在显微镜视野中央，辅助进行膜片钳实验，提高实验效率，避免实验不良反应。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法，其特征在于其采用显微镜下急性分离神经细胞捕捉系统进行，所述捕捉系统包括显微镜电子目镜(1)、计算机(2)、单片机(3)、驱动器(4)、步进电机和膜片钳系统显微镜载物台(7)，所述膜片钳系统显微镜载物台(7)，位于所述显微镜电子目镜(1)下方，用于承载待研究的急性分离神经细胞；所述显微镜电子目镜(1)，与计算机(2)连接，用于获取显微镜下细胞图像，并将获取的细胞图像传送至计算机(2)；所述计算机(2)与单片机(3)连接，用于对细胞图像进行处理得到单像素图像，识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞，并获取其坐标值，然后将坐标值传输给单片机(3)；所述单片机(3)与驱动器(4)连接，用于根据获得的坐标值控制驱动器(4)驱动步进电机，使步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台(7)移动，将细胞移动到显微镜的视野中；所述方法包括如下步骤：
步骤一、电子目镜(1)获取显微镜镜下细胞图像，并将获取的细胞图像传送至计算机(2)；
步骤二、所述计算机(2)对细胞图像进行处理得到单像素图像，识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞，并获取其坐标值，然后将坐标值传输给单片机(3)；
步骤三、所述单片机(3)根据获得的坐标值控制驱动器(4)驱动步进电机，使步进电机带动膜片钳系统显微镜载物台(7)移动，将细胞移动到显微镜的视野中；
所述步骤二中识别和精确定位细胞，找出符合封接条件的急性分离的神经细胞具体过程为：
对所述单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，提取出细胞的边缘像素点；
利用细胞形态与椭圆的相似性，使用RED算法从提取的边缘像素点中识别可能的椭圆；
通过对椭圆点收集来判断是否为真实的椭圆，如果判断结果为是即捕捉到符合封接条件的急性分离的神经细胞。
2.如权利要求1所述的显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法，其特征在于：所述步骤二中计算机(2)对细胞图像进行处理得到单像素图像具体过程为：
将细胞图像转换成计算机视觉图像，对计算机视觉图像进行灰度处理，将彩色图像转换成灰度图像；
将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，得到轮廓完整且细胞与背景分割的单像素图像。
3.如权利要求2所述的显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法，其特征在于：将灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，接着进行高斯模糊处理和再次阈值分割，之后再进行孔洞填充处理，得到轮廓完整且细胞与背景分割的单像素图像具体为：
利用公式(1)对灰度图像进行阈值分割，得到对应的二值化图像，这样基本上去除了灰度图像中背景的灰度信息，变为白色背景；
f(x,y)表示原图像在像素点(x,y)处的灰度值，F1(x,y)表示处理后的图像在像素点(x,y)处的灰度值，Th1是阈值；
然后利用公式(2)的高斯函数产生模版，再利用该模版与获得的二值化图像进行卷积运算，即高斯模糊处理；
其中σ表示标准差，G(x,y)表示模版在点(x,y)的值；
之后利用公式(3)对高斯模糊处理后的图像再次进行阈值分割；
f(x,y)表示原图像在像素点(x,y)处的灰度值，F2(x,y)表示处理后的图像在像素点(x,y)处的灰度值，Th2是阈值；
最后对图像中的孔洞部分进行填充处理：设二值化的图像含有的目标区域的边界值为1，非边界为0，边界点集记为A，从边界内的一点P开始，令X0＝P＝1，用公式(4)进行迭代来填充孔洞区域，迭代至Xk＝Xk-1为止，式中B为填充的结构单元，k为迭代的次数，
孔洞填充完成后，得到较完整的细胞与背景分割的单像素图像。
4.如权利要求1所述的显微镜下急性分离神经细胞捕捉方法，其特征在于：对所述单像素图像使用Canny算子进行边缘检测，提取出细胞的边缘像素点具体步骤为：
(1)对单像素图像使用带有指定标准偏差的σ高斯滤波来进行平滑，从而减少噪声；
(2)计算图像中的每一像素点的局部梯度，根据将该像素点的梯度幅度值判定该像素点是否为边缘点；
其中梯度的幅度
梯度的方向角度
g(x,y)表示梯度的幅度，α(x,y)表示梯度的方向角度，Gx表示x方向的梯度幅度，Gy表示y方向的梯度幅度，根据将该像素点的梯度幅度值与其相邻像素点的所有模值(两像素点的距离)比较，若梯度幅度值是最大值，该判定该像素点为边缘点，否则该像素点不是边缘点；
使用RED算法从提取的边缘像素点中识别可能的椭圆具体为：
从边缘点集D中，随机的取出6个不共线的点，并且把它们存入到一个数组P中，然后取出P中的5个点(Pi＝(xi,yi)，i＝1，2，3，4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：
Ax2+Bxy+cy2+Dx+Ey+1＝0 (5)
解出方程组公式(6)，即可求出曲线参数(A，B，C，D，E)的值，当且仅当B2-4AC<0时，解出的二次曲线为椭圆，并记作Q1-5，然后将求出的Q1-5参数与没有使用的第6个边缘像素点P6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：
公式(7)求出的是P6点到椭圆Q1-5的距离的绝对值，其结果用d6表示，当P6点在椭圆Q1-5上时，式(7)中d6的值应为0，此时认为该椭圆是可能的椭圆并记为Qp；
通过对椭圆点收集来判断是否为真实的椭圆具体为：首先，将计数器清零，使用计数器统计位于椭圆上的边缘点的个数，然后查找边缘点集中的所有点，并计算出这些点到可能椭圆的距离，若求得的距离比设定的阈值小，将计数器加1，并在可能椭圆的边缘点集中加入这个点，同时将它从边缘点集D中去除；反之则继续遍历D中的下一个点，直到D中的点全部检测完，这时统计可能椭圆的边缘点集中的点的个数，若高于预设的阈值，则判定检测到的椭圆是一个真实的椭圆，反之则将边缘点集中的点返回到边缘点集中，再重新进行检测。
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