CN109963936A - 自动体液分析 - Google Patents

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Abstract

公开了用于体液样品的自动细胞分析的方法、装置和系统。该方法、装置和系统将分水岭变换应用于通过使体液样品流过流式细胞仪而产生的数据，以确定将用于分析该数据的阈值。

Description

自动体液分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月8日提交的美国临时专利申请No.62/385,055的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
体液分析提供了关于体液组成的重要信息，包括细胞类型、不同类型细胞的计数、异常细胞的存在、感染性颗粒(例如朊病毒、病毒、细菌等)的存在。这些信息对于提供临床诊断和预后至关重要。
多种方法用于分析各种生物流体样品中的细胞。用于细胞分析的方法包括通过光学或荧光显微镜进行视觉和/或自动检查。通常实施细胞检查和这些类型的分析以获得关于样品中细胞谱系、成熟阶段和/或细胞计数的信息。
通过显微镜分析生物样品中的细胞可能是昂贵且耗时的。流式细胞术提供了用于鉴定和区分不同细胞类型和计算生物流体样品中的不同细胞类型的替代方法。在流式细胞仪中，细胞一次通过一个或几乎一次通过一个地通过感应区域，其中每个细胞被能量源照射。通常，单波长光源(例如，激光器等)用作能量源，并且各种检测器中的一个或多个基于细胞与施加的能量的相互作用来记录数据。流式细胞术通常用于血液学，并且已成功用于血液疾病(包括血癌)的诊断。
流式细胞术中的挑战包括捕获粒子事件(events)(例如，细胞事件)，同时去除类似于小细胞事件的不期望的信号(例如，噪声)。对流式细胞术数据的质量产生不利影响的其他因素包括从样品到样品的有核细胞计数的变化，例如，这导致荧光信号的变化，使得与细胞事件相关的信号在不同类型的样品中变化很大。
发明内容
公开了用于体液样品的自动细胞分析的方法、装置和系统。该方法、装置和系统将分水岭变换(watershed transform)应用于通过使体液样品流过流式细胞仪产生的数据，以确定将用于分析该数据的阈值。
在某些实施方案中，公开了一种用于分析含有细胞的体液的方法。该方法可以包括收集由被能量源照射的体液样品发射的信号，其中体液样品用染色荧光染料，其中荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合形成细胞内的染料复合物；对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷(dominant valley)；根据主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并且分析高于该阈值的信号以区分体液中不同类型的细胞。在某些实施方案中，体液样品是未溶解的，即体液中含有的细胞是未溶解的。
在某些实施例中，该方法可以包括迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷，该主谷位于通过将分水岭变换迭代地应用于多个峰而获得的两个主峰之间。
在某些实施例中，主谷可以将对应于第一组有核细胞事件的第一主峰(dominantpeak)与对应于第二组有核事件的第二主峰分开。
在某些实施例中，收集的信号可包括散射光。散射光可包括前向光散射或侧向光散射。侧向光散射可以包括偏振侧散射或消偏振侧散射。在某些实施方案中，收集的信号可包括荧光信号。
在某些实施例中，该方法可包括收集包括散射光的第一多个信号和包括荧光信号的第二多个信号；(a)对收集的第一多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设定用于分析收集的散射光的阈值；并使用阈值来区分细胞事件和非细胞事件；(b)对所收集的第二多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设定用于分析收集的荧光信号的阈值；并使用阈值来区分有核细胞事件和非有核细胞事件。
在某些实施方案中，该方法可包括将有核细胞事件分类为单核细胞事件和非白细胞事件。
在某些实施方案中，步骤(b)可以对应于步骤(a)中鉴定的细胞事件的荧光信号进行。
在某些实施方案中，该方法可包括将有核细胞事件分类为单核细胞事件、多形核细胞事件和非白细胞事件。在某些实施方案中，该方法可包括将单核细胞事件分类为淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞。
在某些实施方案中，体液可包括血液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、心包液、滑液或持续性非卧床腹膜透析液。在某些实施方案中，该方法可包括用荧光染料染色体液样品。在某些实施方案中，该方法可包括使染色的体液样品流过血液分析仪的流动池。在某些实施方案中，该方法可包括用能量源照射体液样品。
本文还公开了一种用于分析体液中细胞的自动系统。该系统可以包括计算机，该计算机包括用于存储用于分析体液中的细胞的指令的存储器，该指令由处理器执行以收集由被能量源照射的体液样品发出的信号，其中体液样品被荧光染料染色，其中荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合，在细胞内形成染料复合物；对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并且分析高于阈值的信号以区分体液中不同类型的细胞。
自动系统可包括血细胞分析仪，其包括流动池；用于照射引入流动池的细胞的能量源；多个检测器，用于检测由流动池中的细胞发射的信号，其中，该存储器还包括用于使血液分析仪用荧光染料染色体液样品的指令；使染色的体液样品流过流动池；使用能量源照射流过流动池的细胞。
在某些实施例中，指令可以包括用于将分水岭变换迭代地应用于多个峰和谷直至获得主谷的指令，该主谷位于通过将分水岭变换迭代地应用于多个峰而获得的两个主峰之间。在某些实施方案中，主谷可以将对应于有核细胞事件的第一主峰与对应于非有核事件的第二主峰分开。
收集的信号可以包括散射光，例如前向光散射和/或侧向光散射。侧向光散射可以包括偏振侧散射和/或去偏振侧散射。收集的信号可包括荧光信号。
在某些实施例中，指令可包括用于收集包括散射光的第一多个信号和包括荧光信号的第二多个信号的指令；和(a)对收集的第一多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设定用于分析收集的散射光的阈值；并使用阈值来区分细胞事件和非细胞事件；(b)对所收集的第二多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设定用于分析收集的荧光信号的阈值；并使用阈值来区分有核细胞事件和非有核细胞事件。指令可以包括用于将有核细胞事件分类为单核细胞事件和非白细胞事件的指令。步骤(b)可以对应于步骤(a)中鉴定的细胞事件的荧光信号进行。
在某些实施方案中，指令可包括用于将有核细胞事件分类为单核细胞事件、多形核细胞事件和非白细胞事件的指令。在某些实施方案中，指令可包括用于将单核细胞事件分类为淋巴细胞和单核/巨噬细胞的指令。体液可以是血液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、心包液、滑液或连续的非卧床腹膜透析液。
附图说明
图1A-1D提供了应用分水岭变换以识别一维信号中的主峰和谷的示例。
图2是表示用于体液分析的示例性方法的流程图。
图3是脑脊髓(CSF)体液的散点图，其中未知事件在荧光1(FL1)(对数标度)与轴向光损失(ALL)中可能的有核事件(图2的步骤3)中被细化。
图4A和4B示出了有核细胞事件分类为淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、多形核(PMN)细胞事件和非白细胞(NWBC)。图4A显示胸膜液中有核细胞的数据。图4B显示含有NWBC的腹膜液中有核细胞的数据。
图5A-5D示出了使用如本文所述的分水岭变换识别的阈值获得的细胞计数之间的相关性，并与使用预设阈值的传统方法进行比较。图5A，RBC(细胞/μl)；图5B，WBC(细胞/μl)；图5C，单核细胞百分比(MN％)；图5D，多形核细胞百分比(PMN％)。
图6是根据一个实施方案的流式细胞仪的第一个实例的示意图，其用于产生用于使用本公开的方法进行分析的数据。
图7是根据一个实施方案的流式细胞仪的第二个实例的示意图，其用于产生用于使用本公开的方法进行分析的数据。
具体实施方式
定义
短语“分水岭变换”或“分水岭算法”可互换使用，并且参考Luc Vincent和PierreSoillie,Watersheds in digital spaces:an efficient algorithm based onimmersion simulations.IEEE Transactions on Pattern Analysis and MachineIntelligence,13(6),1991,pp.583-598。
本文所用的术语“体液”通常是指衍生自“生物样品”的流体，其包括从个体或个体群体获得的多种样品类型，并且可用于诊断、监测或筛选测定。该定义包括生物来源的血液和其他液体样品。该定义还包括在采购后以任何方式操作的样品，例如通过混合或汇集单个样品，用试剂处理，溶解，或富集某些组分，例如有核细胞、非有核细胞、病原体等等。
术语“生物样品”包括临床样品，还包括培养细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊髓液(CSF)、间质液、眼液、滑液、血浆和血清等血液成分等。
这里使用的“数据处理单元”是指将执行其所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，这里的任何数据处理单元可以是可编程数字处理器(例如，微处理器)，例如以电子控制器、大型机、服务器、云或个人计算机(台式或便携式)的形式提供。在数据处理单元是可编程的情况下，合适的编程可以从远程位置传送到数据处理单元，或者先前保存在计算机程序产品中(例如便携式或固定计算机可读存储介质，无论是基于磁性、光学还是固态设备)。
详细说明
公开了用于体液样品的自动细胞分析的方法、装置和系统。该方法、装置和系统将分水岭变换应用于通过使体液样品流过流式细胞仪产生的数据，以确定将用于分析该数据的阈值。
在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
在提供一系列值的情况下，应理解，每个中间值，至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定，在该范围的上限和下限之间以及在所述范围的任何其他所述或中间值，包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，受所述范围内任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本发明中。
本文提出了某些范围，其中数值前面有术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字提供字面支持，以及接近或近似该术语后数字的数字。在确定数字是否接近或近似具体引用的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供具体引用的数字的实质等同的数字。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述具有代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入本文并且通过引用并入本文以公开和描述与被引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明的价值而先于这些出版物。此外，提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。
应注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。还应注意，可以撰写权利要求以排除任何可选要素。因此，本声明旨在用作与权利要求要素的叙述或使用“否定”限制有关的“单独”、“仅”等排除性专用术语的先行基础。
对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独实施例具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其他几个实施例的特征分离或组合而不脱离本发明的范围或精神。任何列举的方法可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
方法
公开了用于分析体液样品的方法。这些方法提供了体液样品中存在的细胞类型的自动分析。这些方法可以与自动流式细胞仪结合使用，例如血液分析仪。
在某些实施方案中，本文公开的方法可用于鉴定用于分析体液样品的阈值。在某些实施方案中，该方法可包括收集由被能量源照射的体液样品发出的信号，其中体液样品用荧光染料染色，其中荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合形成细胞内的染料复合物；对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并分析高于阈值的信号以识别体液中不同类型的细胞。在某些实施方案中，体液样品是未溶解的，即体液中含有的细胞是未溶解的。
在某些实施方案中，该方法可包括用荧光染料染色体液样品，其中荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合以在细胞内形成染料复合物。在某些实施方案中，该方法还可包括使染色的体液样品流过流式细胞仪(例如血液学分析仪、荧光流式细胞仪)的流动池。用于照射流动的体液样品的能量源可以是任何合适的能量源，例如光源。在某些实施方案中，荧光流式细胞仪可以如美国专利No.5,631,165中所述进行配置。用于照射流过流动池的体液样品的光源可以发射激光束。在某些实施例中，标准氩离子激光器可用于照射流动的体液样品。
收集由被能量源照射的体液样品发射的信号的步骤可以由信号检测单元执行。信号检测单元可以可操作地耦合到数据处理单元。在一些实施例中，由信号检测单元收集的数据的分析可以由数据处理单元使用本文提供的用于数据分析的方法来执行。
信号检测单元可包括一个信号检测器或多个信号检测器，用于检测通过流式细胞仪(例如，血液分析仪)的流动池中流过光束的体液样品的光学询问(opticalinterrogation)而产生的光学信号。示例性信号检测器包括用于测量光学信号的检测器，例如荧光信号、轴向光损失(ALL，也称为前向消光)、中间角散射(IAS，散射在光)、小角度前向散射(SAS)、去极化侧散射(DSS)和/或偏振侧散射(PSS)。收集的信号可以包括荧光信号、ALL、IAS、SAS、DSS和PSS中的一种或多种。
ALL通常是由于细胞通过激光束前面并被检测器(例如光电二极管)检测而导致的光能减少。光损失通常是由于散射造成的，并且定义为由于细胞通过光束而到达该光束(例如激光束)路径中的检测器的光能减少(通常以约0°至约1°的角度检测到ALL)。相反，小角度前向散射(SAS)是由于来自穿过光束的细胞的散射而到达入射激光束外部的检测器(但在约1°至3°的窄角度内)的光能。通常提供光束挡板以防止激光束进入检测器。ALL测量系统在激光照射的入射锥内收集光，而小角度散射系统在该锥体外收集光。在ALL测量系统中，感兴趣的信号是从稳态激光信号中减去的负信号，而在小角度前向散射测量中，信号是施加在非常低的背景光水平上的小的正信号。除了光从入射激光束以更大的角度散射外，中间角度前向散射(IAS)类似于小角度前向散射。更具体地，IAS涉及在远离激光束的入射或中心线约3°和15°之间的环中散射的光。在一些实施例中，从激光轴垂直地以小于约0.3°的角度和小于约1.2°的角度收集ALL，并且以距激光轴约3°和10°之间的角度收集IAS。在某些情况下，DSS信号和PSS信号在入射到流动池中的光束约90°处测量。
将分水岭变换应用于收集的信号以在收集的信号中定义多个峰和谷的步骤可以包括将收集的信号组织成适合于应用分水岭变换算法的任何格式。在某些实施例中，收集的信号可以以直方图格式、散点图或其他多维图来组织。在所公开方法的某些方面，所收集的信号可以包括散射光，例如侧向散射光，例如侧向散射光，DSS和/或PSS以及散射光的强度可以绘制为直方图。例如，可以在体液样品流过流动池的一段时间内绘制散射光的强度。在某些实施方案中，可以在Y轴上绘制散射光的强度，并且可以在X轴上绘制对应于散射光强度的事件的数量(其可以是细胞和非细胞事件)，反之亦然。在某些实施例中，X轴可以是不同的散射光强度范围(例如，分成区间)，Y轴可以是落在相应的散射光强度范围内的事件的数量。对于细胞事件(例如，血细胞)测量的散射光的强度高于非细胞事件(例如，细胞碎片，例如来自裂解网状细胞的RNA、豪-乔小体、网状血小板、巨大血小板、来自白细胞(WBC)的DNA和巨核细胞碎片、寄生虫、红细胞(RBC)片段、红细胞重影、聚集蛋白质等)。因此，将分水岭变换应用于信号的二维或三维图将在信号中定义多个峰和多个谷。一些峰，通常是较不强烈的峰，可以对应于来自非细胞事件的信号。然而，在不使用分水岭变换的情况下，数据分析系统可以应用预设阈值来区分细胞事件和非细胞事件。尽管如此，该预设阈值可以根据体液的类型、稀释量、用于制备用于分析的体液样品的试剂等而变化。应用分水岭算法有助于确定被分析样品的自定义阈值，同时考虑特定样品的特征。分水岭算法迭代地应用于最初识别的峰和谷直到保留单个主谷。基于主谷的信号选择阈值。然后分析光散射信号以使用阈值作为截止值来区分细胞事件和非细胞事件，例如，强度高于阈值的散射光被计数为对应于细胞事件，并且强度低于阈值的散射光被计数为对应于非细胞事件。
在某些实施例中，分水岭变换的迭代应用包括将较不主要的峰与该较不主要的峰相邻的较主要的峰合并。在某些实施例中，分水岭变换的迭代应用包括将较不主要的谷与该较不主要的谷相邻的较主要的谷合并。在某些实施例中，当合并的相邻谷或相邻峰被分开小于预定距离时，它们可以合并。例如，X轴可以具有以特定间隔分开的信号的范围，例如，1-10、>10-20、>20-30、>30-40等等。当主谷对应于1-10范围而较小主谷对应于>10-20范围时，这两个谷可以合并。合并的谷的值可以对应于更主要的谷的值，或者可以是两个谷的平均值。在某些实施方案中，较低主要的峰与较主要的峰的合并可以以类似于谷的合并的方式进行。在某些实施例中，将较不主要的谷与较主要的谷合并可以包括移除较不主要的谷。类似地，在某些实施方案中，将较不主要的峰与较主要的峰合并可以包括去除较不主要的峰。因此，在某些情况下，分水岭变换的迭代应用可以包括去除较不主要的谷，直到保留单个主谷。在某些实施例中，较不主要的谷可以是高于某个信号的谷，该信号可以是预定信号，例如，已知与细胞事件相关的信号。在某些实施例中，更主要的谷可以是低于特定信号的谷，该信号可以是预定信号，例如，已知与非细胞事件相关的信号。在某些实施例中，较不主要的峰可以是低于某个信号的峰，该信号可以是预定信号，例如，已知与非细胞事件相关的信号。在某些实施例中，更主要的峰可以是高于某个信号的峰，该信号可以是预定信号，例如，已知与细胞事件相关的信号。在其他实施例中，确定主峰和/或谷不使用预定信号，而是从头进行主峰和/或谷的确定，例如，基于逐个样品。
在另一个实施例中，收集的信号可以包括荧光信号。在某些实施方案中，荧光信号的强度可以绘制为直方图。例如，可以在体液样品流过流动池的一段时间内绘制荧光强度。在某些实施方案中，荧光的强度可以绘制在Y轴上，并且对应于荧光强度的事件(可以是有核细胞和非有核细胞)数量可以在X轴上绘制，或者反之亦然。在某些实施方案中，X轴可以是荧光强度的范围(例如分成区间)，Y轴可以是落在X轴上绘制的范围内的事件的数量。
在另一个示例中，可以生成图表，其显示与特定信号强度(例如，荧光强度或散射光强度)相关联的事件的数量的频率。理论直方图显示在图1A中，在X轴上绘制与不同光强度(分成不同范围或区间)相关联的事件，并且在Y轴上绘制这些事件的发生频率。图1A表明与特定光强度相关的事件是最频繁的，而与不同光强度相关的其他事件则较不频繁。然而，为了识别与不同光强度相关联的哪些事件对应于真实事件(例如，当光信号是散射光的细胞，或当光信号是荧光时的有核细胞)，并且对应于非事件(例如，当光信号是散射光的细胞碎片，或当光信号是荧光时的非有核细胞)，需要利用阈值。如上所述，使用预定阈值的传统阈值或门控方法可能引入错误。此处使用分水岭变换的应用来识别正在分析的数据集的自定义阈值。图1B描述了将分水岭变换应用于图1A中绘制的原始数据的结果。图1B示出了分水岭算法的应用识别多个峰值和谷值。图1C描述了将分水岭变换迭代地应用于图1B中识别的峰和谷的最终结果。如图1C所示，迭代地应用分水岭变换直到单个主谷仍然将主谷识别为对应于阈值，该阈值可用于分析数据以区分事件和非事件并提供体液样品的分析。
图1D提供了将分水岭变换应用于另一数据集的最终迭代的结果。类似于用于获得图1A-1C中的数据集的阈值的描述，峰和谷的识别以及分水岭变换的迭代应用以识别主谷有助于确定该数据集特有的阈值。然后该阈值可用于分析存在于生成数据集的体液样品中的细胞。
在某些实施例中，可以对来自能量源照射的体液样品的信号执行分水岭变换的迭代应用，直到实现期望的结果，例如，直到保留单个主谷和/或单个主峰。在其他实施例中，当保留单个主谷和多个主峰(例如，2-10、2-5或2-3个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)时，可以停止分水岭变换的迭代应用。在另一个实施例中，当保留单个主峰和多个主谷(例如，2-10、2-5或2-3个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个)，可以停止分水岭变换的迭代应用。在某些实施例中，主谷可以对应于阈值。在其他实施例中，主峰可以对应于阈值。
在某些实施例中，与从先前的分水岭算法应用获得的峰和/或谷的数量相比，分水岭算法的每次迭代可以减少峰和/或谷的数量。在一些实施方案中，可以通过分别合并相似的峰和/或合并相似的谷来减少峰和/或谷的数量以识别主峰和/或谷。另外或可替代地，通过分别合并相似的峰和/或合并相似的谷，减少峰和/或谷的数量以识别主峰和/或谷，较不主要的峰可以与更主要的峰合并且较不主要的谷可以与更主谷合并。如上所述，分开小于预定距离的峰值可以合并(例如，可以除去与更主要的峰分开小于预定距离的较不主要的峰并且保留更主要的峰值)。在一些实施例中，可以通过去除对应于预定为伪像(artifacts)或噪声的信号的峰和/或谷来减少峰和/或谷的数量。在一些实施例中，与相邻的谷不充分分离的谷可以与相邻的谷合并或者可以被移除。可以对相邻峰执行类似的迭代。
在某些实施例中，该方法包括迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷，该主谷值位于通过将分水岭变换迭代地应用于多个峰而获得的两个主峰之间。
在某些实施例中，对从经照射的体液样品获得的荧光信号迭代应用分水岭变换可以识别主谷，该主谷将对应于第一多个有核细胞事件的第一主峰与对应于第二多个有核事件的第二主峰分开，其中主谷对应于来自无核事件的信号。第一主峰可以具有比第二主峰更高的信号强度，并且可以对应于从WBC产生的信号，而第二主峰可以对应于从未成熟的RBC(网状细胞)产生的信号。在某些实施例中，对从被照射的体液样品记录的散射光的分水岭变换的迭代应用可以识别将对应于第一多个较大细胞(例如，WBC)的第一主峰与对应于第二多个较小细胞(例如，血小板)的第二主峰的第一主峰分开的主谷，其中主谷对应于来自非细胞事件的信号。
在某些实施例中，该方法可以包括收集包括散射光的第一多个信号和包括荧光的第二多个信号；和(a)对收集的第一多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设定用于分析收集的散射光的阈值；并使用阈值来区分细胞事件和非细胞事件；(b)对所收集的第二多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设定用于分析收集的荧光信号的阈值；并使用阈值来区分有核细胞事件和非有核细胞事件。在某些实施方案中，步骤(a)和步骤(b)可以同时进行。在某些实施方案中，步骤(a)和步骤(b)可以以任何顺序依次进行。在某些实施方案中，步骤(b)可以仅对应于步骤(a)中鉴定的细胞事件的荧光信号进行。
本公开的方法还可以包括分析对应于有核细胞事件的数据，以识别单核细胞事件、多形核细胞事件和非白细胞事件的数量。该方法可以进一步包括确定淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞的数量。
可使用本文公开的方法分析的体液样品可包括血液(例如，全血样品或其部分)、脑脊髓液(CSF)、胸膜液、腹膜液、心包液、滑液、尿液、唾液、泪液、精液、羊水、痰液、持续性非卧床腹膜透析液(CAPD)等。
体液样品可以在流过血液分析仪的流动池之前使用任何合适的方案进行处理，例如US5,631,165和US8,911,669中描述的那些，其通过引用整体并入本文。例如，体液样品可以用荧光染料染色，该荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合以在细胞内形成染料复合物。可以使用与DNA或RNA结合的任何合适的染料。可以使用的一些市售染料包括YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1等。本领域技术人员已知具有不同消光(EX)最大值的染料可以用适当的光源激发，例如He-Ne、Xenon或Mercury灯。另外，体液样品可任选地暴露于等渗溶液和/或其他试剂以裂解RBC。此外，体液样品可任选地暴露于重要的核染色剂，其有效地标记可能存在于被分析的体液中的任何有核(NRBC)。在流过血液分析仪之前，可任选地稀释处理过的体液样品。
本公开的方法可以与其他方法一起使用以准确确定患者计数，其是每微升体液样品中的事件数。事件可包括红细胞(RBC)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)及其类别或亚类。“事件”是指粒子(例如，细胞)通过流动池的询问区，如光学询问系统所检测的。“非事件”或“非细胞事件”是指类似于不由事件产生的事件的光信号特征。本公开的方法确定阈值，该阈值然后可以用于确定信号是来自事件还是非事件。
可以使用本文公开的方法分析由数据收集单元收集的原始信号数据。在其他实施例中，可以在应用分水岭变换之前处理原始数据。例如，可以过滤原始信号数据。可以使用逆高斯滤波器系数对原始信号数据进行滤波。可以处理原始信号数据以去除已知为噪声的信号(例如，特定的流式细胞仪可能具有高基线噪声背景)。原始信号数据可以被数字化(例如，模拟信号可以被转换成数字信号)。可以进一步修改原始信号数据或经处理的数据，例如，转换为对数标度、放大等。原始信号数据或经处理的数据可以进一步格式化为适合于应用分水岭变换以识别谷和峰的任何形式。
本文公开的方法的某个实施方案描述于图2中。图2显示了使用血液分析仪分析从体液样品收集的数据的步骤的流程图。步骤1包括基于其尺寸散射特性将细胞事件与噪声分离。在从细胞事件中去除噪声之后，下一步骤(步骤2)包括将有核细胞事件与非有核血细胞分离，因为有核细胞在用荧光染料染色时发出更强的荧光信号。代替传统的阈值或门控方法，利用迭代分水岭变换来沿着数据的直方图自动定位峰和谷。最初将分水岭变换应用于信号以定位峰和谷的初始位置。然后应用迭代步骤来合并较不主要的峰和谷。在程序收敛时，仅留下主要的峰和谷。分水岭变换应用于步骤1中的数据，直到仅剩下主谷。该主谷是在步骤1中分离不同事件类型的截止阈值。分水岭变换应用于步骤2中的数据，直到仅剩下主谷。该主谷是在步骤2中分离不同事件类型的截止阈值。
图2的步骤3是可选步骤。在某些体液样品中，形成额外簇的其他未知事件可包括在有核细胞事件中。可采用如图3所示的细化方法来滤除未知事件，以实现准确的总有核细胞计数(TNCC)。在某些情况下，通过去除未知细胞事件来细化有核细胞事件的方法(流程图中的步骤3)可以使用非参数特征聚类技术(Mean Shift,Mode Seeking,and Clustering,IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence,17(8),790-799,1995)来利用细胞事件的荧光信号和附加时间戳。
图2的步骤4包括将总有核细胞分类为亚类：淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、多形核(PMN)细胞和NWBC(NWBC包括非WBC的有核细胞，NWBC包括上皮细胞和/或肿瘤细胞)。淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞可以列举为单核细胞(MNC)计数；WBC包括MNC和PMN细胞。图4A和4B显示两种体液样品，其中TNCC聚集成淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、PMN细胞和NWBC。在某些实施方案中，将有核细胞事件分类为单核细胞事件、多形核细胞事件和非白细胞(NWBC)事件(流程图中的步骤4)的方法可以使用有效的k均值聚类算法(An efficient k-means clustering algorithm:analysis and implementation,IEEE Trans on PatternAnalysis and Machine Intelligence Vol.24,2002,881-892)来利用多维光散射信号(前向光散射、侧向光散射、偏振侧散射、去极化侧散射或其组合)和荧光信号。
图2的步骤5中，该方法还包括计算可报告的参数，包括每种细胞类型的浓度、百分比和标记。在某些实施方案中，用于分析体液样品的方法可以进一步包括基于稀释比、流速、计数时间和适当的校准因子提供细胞浓度。可以标记体液样品以指示进一步的分析，例如，由于数据质量和/或细胞计数表明潜在的恶性肿瘤。可以使用显微镜检查进一步分析标记的样品。显微镜检查可以通过血液分析仪进行，所述血液分析仪具有用于制备标记样品的载玻片的模块，并使用显微镜从载玻片获得数据。
图5A-5D证明使用分水岭变换分析体液样品以确定数据分析的阈值提供了与使用预定阈值的常规方法得到的细胞计数密切相关的细胞计数。
可以使用任何可靠的方法将总有核细胞分类和计数为亚类：淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、多形核(PMN)细胞和NWBC，例如，使用美国专利No.5,631,165中描述的方法，其通过引用并入本文。本文公开的方法的一个或多个步骤可以通过本文描述的装置和系统实施。下面更详细地描述执行本文提供的方法各方面的特定装置和系统。
设备和系统
如上所概述，本公开还提供了例如可用于实践本公开的方法的装置和系统。
用于实施本文公开的方法的装置可以是被编程为执行本文公开的方法的一个或多个步骤的计算机。计算机可以包括用于存储用于分析体液中的细胞的指令的存储器。计算机还可以包括用于执行存储在存储器中的指令的处理器。指令可以包括用于收集由被能量源照射的体液样品发出的信号的指令，其中体液样品用荧光染料染色，其中荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合以在细胞内形成染料复合物；对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并且分析高于阈值的信号以区分体液中不同类型的细胞。如本文所述，本文描述的装置和系统可以是自动化的，因此可以在没有人为干预的情况下实施本公开的方法。相对于使用预设阈值的装置和系统，通过识别用于分析通过流体细胞计流动体液而产生的数据的自定义阈值来执行体液分析的这种装置和系统得到改进。
在某些实施方案中，上述计算机可以是流式细胞仪(例如血液学分析仪、荧光流式细胞仪)的一部分。流式细胞仪可以包括流动池、用于照射引入流动池的细胞的能量源，其中流式细胞仪的存储器还可以包括用于使流动分析仪用如本文所述的荧光染料染色体液样品、使染色的体液样品流过流动池、并照射流过流动池的细胞的指令。
在某些实施例中，指令可以包括用于将分水岭变换迭代地应用于多个峰和谷直到获得主谷的指令。主谷位于通过将分水岭变换迭代地应用于多个峰而获得的两个主峰之间。
本公开还提供了适于执行本公开的任何方法的系统(例如，流式细胞术系统，其可以是自动血液学系统的子系统)。此类系统可包括本文描述的任何非暂时性计算机可读介质。
在某些方面，本公开的系统是流式细胞仪。这种系统包括流动池、用于激发流过流动池的体液样品的激发源、以及用于检测从激发的样品发射的光信号的一个或多个检测器。可以包括任何本文描述的非暂时性计算机可读介质并且适合于实践本公开的方法的流式细胞仪的示例在图6中示意性地示出。流式细胞仪10包括光源12、用于光束弯曲的前镜14和后镜16、包含第一圆柱透镜20和第二圆柱透镜22的光束扩展器模块18、聚焦透镜24、精细光束调节器26、流通池28、前向散射透镜30、靶心检测器32、第一光电倍增管34、第二光电倍增管36和第三光电倍增管38。靶心检测器32具有用于0°光散射的内部检测器32a和用于7°光散射的外部检测器32b。
在某些方面，光源是激光。然而，可以使用其他光源，例如灯(例如，汞、氙)。光源12可以是垂直极化的空气冷却的Coherent Cube激光器，可从Coherent,Inc.,Santa Clara,CA商购获得。可以使用波长范围为350nm至700nm的激光器。该激光器的操作条件基本上类似于目前与“CELL-DYN”自动血液分析仪一起使用的激光器的操作条件。
关于流动池、透镜、聚焦透镜、精细波束调节机构和激光聚焦透镜的其他细节可以在美国专利No.5,631,165中找到，其通过引用并入本文，特别是在第41栏第32行至第43栏第11行。美国专利No.5,631,165的图2所示的前向光路系统包括球面平凸透镜30和位于透镜后焦平面中的双元件光电二极管检测器32。在该配置中，双元件光电二极管检测器32内的每个点映射到来自移动通过流动池28的细胞的特定光收集角。检测器32可以是能够检测轴向光损失(ALL)和中间角度前向散射(IAS)的靶心检测器。美国专利No.5,631,165在第43栏第12-52行描述了该检测器的各种替代方案。
第一光电倍增管34(PMT1)测量去极化侧向散射(DSS)。第二光电倍增管36(PMT2)测量偏振侧散射(PSS)，第三光电倍增管38(PMT3)测量440nm至680nm的荧光发射，这取决于所选择的荧光染料和所用的光源。光电倍增管收集宽范围波长的荧光信号，以增加信号强度。通过二向色分束器40和42将侧向散射和荧光发射引导到这些光电倍增管，其在所需波长处有效地发射和反射，以实现有效的检测。美国专利No.5,631,165的第43栏第53行至第44栏第4行描述了与光电倍增管有关的各种附加细节。
当通过使用浸没式收集系统测量荧光时，在光电倍增管34、36和38处增强灵敏度。浸没式收集系统是通过折射率匹配层将第一透镜30光学耦合到流动池28的系统，使得能够在广角上收集光。美国专利No.5,631,165在第44栏第5-31行描述了该光学系统的各种附加细节。
聚光器44是光学透镜系统，其具有足以用于高分辨率显微镜中的衍射受限成像的像差校正。美国专利No.5,631,165在第44栏第32-60行描述了该光学系统的各种附加细节。
图6中所示的其他组件，即狭缝46、场透镜48以及第二狭缝50的功能描述于美国专利No.5,631,165的第44栏第63行至第45栏第26行。在美国专利No.5,631,165的第44栏第63行至第45栏第26行中还描述了光学滤波器52或56和偏振器52或56，它们插入光电倍增管的光路中以改变检测光的波长或偏振或波长和偏振两者。适用于本文的滤光器包括带通滤波器和长通滤波器。
光电倍增管34、36和38检测侧向散射(在其轴线大致垂直于入射激光束的锥形中散射的光)或荧光(从与入射激光束不同波长的单元发出的光)。图7是根据一个实施方案的流式细胞仪的第二个实例的示意图，其用于产生用于使用本公开内容的方法进行分析的数据。
虽然上面引用了美国专利No.5,631,165的选择性部分，但是美国专利No.5,631,165通过引用整体并入本文。根据某些实施方案，本公开的流式细胞仪采用雪崩光电二极管(APD)作为光传感器。
在一些情况下，如本文所述的系统的组件可以通过有线数据连接来连接。任何合适且适当的有线数据连接可用于连接所述系统的组件，例如，如本文所述，包括但不限于，例如商用电缆，如USB电缆、同轴电缆、串行电缆、C2G或Cat2电缆、Cat5/Cat5e/Cat6/Cat6a电缆，令牌环电缆(Cat4)、VGA电缆、HDMI电缆、RCA电缆、光纤电缆等。在某些情况下，例如在数据安全性不太重要的情况下，可以采用无线数据连接，包括但不限于例如射频连接(例如，PAN/LAN/MAN/WAN无线网络、UHF无线电连接等)、红外数据传输连接、无线光学数据连接等。
本发明的装置和系统还可以包括能够存储信息的“存储器”，以便计算机可以在以后访问和检索信息。可以基于用于访问存储信息的装置来选择任何方便的数据存储结构。在某些方面，信息可以存储在永久存储器(即，未通过终止对计算机或处理器的电源擦除的存储器)或非永久存储器中。计算机硬盘、CD-ROM、软盘、便携式闪存驱动器和DVD都是永久性存储器的例子。随机存取存储器(RAM)是非永久存储器的一个例子。永久存储器中的文件可以是可编辑和可重写的。
基本上任何电路都可以配置成用于执行本文公开的方法的设备和系统内的功能布置。这种电路的硬件架构，包括例如专门配置的计算机，是本领域技术人员公知的，并且可以包括硬件组件，包括一个或多个处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动器)。这种电路还可以包括一个或多个图形板，用于处理图形信息并将其输出到显示装置。上述组件可以通过电路内的总线适当地互连，例如在专用计算机内。该电路还可以包括合适的接口，用于与通用外部组件通信，例如监视器、键盘、鼠标、网络等。在一些实施例中，电路能够并行处理或者可以是配置用于并行或分布式计算的网络的一部分，以增加本方法和程序的处理能力。在一些实施例中，从存储介质读出的程序代码可以写入插入电路中的扩展板中提供的存储器，或连接到电路的扩展单元，以及扩展板中提供的CPU等或扩展单元实际上可以根据编程的指令执行部分或全部操作，以实现所描述的功能。
除了本公开的设备和系统的组件之外，例如，如上所述，本公开的系统可以包括多个附加组件，诸如数据输出设备(例如监视器和/或扬声器)，数据输入设备(例如接口端口、键盘等，可致动组件，电源等)。
计算机可读媒体
如上所概述，本公开还提供了计算机可读介质，例如，其可用于实践本公开的方法。
本公开包括计算机可读介质，包括非暂时性计算机可读介质，其存储用于本文描述的方法的指令。本公开的各方面包括存储指令的计算机可读介质，所述指令在由计算设备(例如，计算设备的处理器)执行时使计算设备执行如本文所述的方法的一个或多个步骤。根据某些实施例，计算机可读介质可以包括用于收集由被能量源照射的体液样品发射的信号的指令，其中体液样品用荧光染料染色，其中荧光染料渗透细胞膜并结合到核酸在细胞内形成染料复合物；对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；迭代地将分水岭变换应用于多个峰和谷，直到获得主谷；根据主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并且分析高于阈值的信号以区分体液中不同类型的细胞。如本文所述，本文描述的装置和系统可以是自动化的，因此可以在没有人为干预的情况下实施本公开的方法。
在某些实施例中，根据本文描述的方法的指令可以以“编程”的形式被编码到计算机可读介质上，其中这里使用的术语“计算机可读介质”指的是参与向计算机提供指令和/或数据以供执行和/或处理的任何存储或传输介质。存储介质的示例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光盘、固态盘、和网络附加存储(NAS)，无论这些设备是在计算机的内部还是外部。包含信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”意味着记录信息，使得计算机可以在以后访问和检索该信息。
这里描述的计算机实现的方法可以使用以任何数量的计算机编程语言中的一个或多个编写的程序来执行。这些语言包括例如Java(Sun Microsystems，Inc.,SantaClara,CA)、Visual Basic(Microsoft Corp.,Redmond,WA)和C++(AT&T Corp.,Bedminster,NJ)，以及任何许多其他语言。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是对于本领域普通技术人员来说，根据本发明的教导，显然可以进行某些改变和修改。在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下制造。
因此，前面仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，这些布置虽然未在本文中明确描述或示出，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体叙述的示例和条件。此外，这里叙述本发明的原理、方面和实施例以及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，这些等同物旨在包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，开发的执行相同功能的任何元件，而不管结构如何。因此，本发明的范围不旨在限于这里示出和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims (34)

1.一种分析含有细胞的体液的方法，该方法包括：
收集由被能量源照射的体液样品发出的信号，其中所述体液样品用荧光染料染色，其中所述荧光染料渗透细胞膜并结合核酸以在所述细胞内形成染料复合物；
对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；
将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷，直到获得主谷；
基于所述主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并且
分析高于所述阈值的信号以区分所述体液中不同类型的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷，直到获得主谷，所述主谷位于通过将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰而获得的两个主峰之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，主谷将对应于第一组有核细胞事件的第一主峰与对应于第二组有核事件的第二主峰分开。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述收集的信号包括散射光。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述散射光包括前向光散射。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述散射光包括侧向光散射。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述侧向光散射包括偏振侧散射。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述侧向光散射包括消偏振侧散射。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述收集的信号包括荧光信号。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述方法包括收集包括散射光的第一多个信号和包括荧光信号的第二多个信号；并且：
(a)对所述收集的第一多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷直到获得主谷；基于所述主谷的信号设定用于分析所述收集的散射光的阈值；并使用所述阈值来区分细胞事件和非细胞事件；并且
(b)对所述收集的第二多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷直到获得主谷；基于所述主谷的信号设定用于分析所述收集的荧光信号的阈值；并使用所述阈值来区分有核细胞事件和非有核细胞事件。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，还包括将有核细胞事件分类为单核细胞事件和非白细胞事件。
12.根据权利要求10所述的方法，其中针对与步骤(a)中确定的细胞事件对应的荧光信号进行步骤(b)。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括将有核细胞事件分类为单核细胞事件、多形核细胞事件和非白细胞事件。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括将单核细胞事件分类为淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述体液包括血液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、心包液、滑液或持续性非卧床腹膜透析液。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，包括用所述荧光染料染色所述体液样品。
17.根据权利要求16所述的方法，包括使所述染色的体液样品流过血液分析仪的流动池。
18.根据权利要求17所述的方法，包括用所述能量源照射所述体液样品。
19.一种用于分析体液中细胞的自动系统，所述系统包括：
一种计算机，其包括：
存储器，用于存储用于分析体液中细胞的指令，所述指令由处理器执行以用于：
收集由被能量源照射的体液样品发出的信号，其中所述体液样品用荧光染料染色，其中所述荧光染料渗透细胞膜并与核酸结合以在所述细胞内形成染料复合物；
对所收集的信号应用分水岭变换，从而在所收集的信号中定义多个峰和谷；
将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷直到获得主谷；
基于所述主谷的信号设置用于信号分析的阈值；并且
分析高于所述阈值的信号以区分所述体液中不同类型的细胞。
20.根据权利要求19所述的自动系统，还包括血液分析仪，所述血液分析仪包括：
流动池；
用于照射引入所述流动池的所述细胞的所述能量源；
用于检测由所述流动池中的所述细胞发射的信号的多个检测器，
其中，所述存储器还包括指令，其用于使所述血液分析仪：
用所述荧光染料染色所述体液样品；
使所述染色的体液样品流过所述流动池；
使用所述能量源照射流过所述流动池的所述细胞。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的自动系统，其中所述指令包括用于将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷直到获得主谷的指令，所述主谷位于通过将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰得到的两个主峰之间。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的自动系统，其中所述主谷将对应于有核细胞事件的第一主峰与对应于非有核事件的第二主峰分离。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的自动系统，其中所述收集的信号包括散射光。
24.根据权利要求23所述的自动系统，其中所述散射光包括前向光散射。
25.根据权利要求23所述的自动系统，其中所述散射光包括侧向光散射。
26.根据权利要求25所述的自动系统，其中所述侧向光散射包括偏振侧散射。
27.根据权利要求25所述的自动系统，其中所述侧向光散射包括消偏振侧散射。
28.根据权利要求19-22中任一项所述的自动系统，其中，所述收集的信号包括荧光信号。
29.根据权利要求19-22中任一项所述的自动系统，其中，所述指令包括用于收集包括散射光的第一多个信号和包括荧光信号的第二多个信号的指令；并且：
(a)对所述收集的第一多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷直到获得主谷；基于所述主谷的信号设定用于分析所述收集的散射光的阈值；并使用所述阈值来区分细胞事件和非细胞事件；
(b)对所述收集的第二多个信号应用分水岭变换，从而定义多个峰和谷；将所述分水岭变换迭代地应用于所述多个峰和谷直到获得主谷；基于所述主谷的信号设定用于分析所述收集的荧光信号的阈值；并使用所述阈值来区分有核细胞事件和非有核细胞事件。
30.根据权利要求29所述的自动系统，所述指令包括用于将有核细胞事件分类为单核细胞事件和非白细胞事件的指令。
31.根据权利要求29所述的自动系统，其中针对与步骤(a)中确定的细胞事件对应的荧光信号进行步骤(b)。
32.根据权利要求31所述的自动系统，所述指令包括用于将有核细胞事件分类为单核细胞事件、多形核细胞事件和非白细胞事件的指令。
33.根据权利要求32所述的自动系统，还包括将单核细胞事件分类为淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞。
34.根据权利要求19-33中任一项所述的自动系统，其中所述体液包括血液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、心包液、滑液或持续性非卧床腹膜透析液。
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