CN114787625A - 检测血液样品中的血小板 - Google Patents

Abstract

提供了包括对是沉积在样品室中的细胞悬浮液的血液样品进行成像的设备和方法。允许细胞在样品室中沉降以形成细胞单层。在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用显微镜(24)获取细胞单层的至少一幅显微图像，并且确定已经沉降在单层内的血小板的第一血小板计数。在将显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，获取样品的另外的显微图像，并且确定未沉降在单层内的血小板的第二血小板计数。基于第一血小板计数和第二血小板计数生成输出。还描述了其他应用。

Description

检测血液样品中的血小板

相关申请的交叉引用

本申请要求Yafin等人2019年12月12日提交的标题为”Detecting Platelets ina Blood Sample”的美国临时专利申请第62/946,998号的优先权，该申请通过引用并入本文。

本发明实施方案的领域

本发明公开的主题的一些应用总体涉及身体样品的分析，并且特别地涉及对血液样品进行的光密度和显微测量。

背景

在一些基于光学的方法(例如，诊断和/或分析方法)中，通过进行光学测量来确定生物样品诸如血液样品的特性。例如，组分的密度(例如，每单位体积的组分计数)可以通过对显微图像内的组分计数来确定。类似地，组分的浓度和/或密度可以通过对样品进行光吸收、透射、荧光和/或发光测量来测量。通常，将样品放置到样品载体(sample carrier)中，并且对包含在样品载体的样品室中的样品的一部分进行测量。分析对包含在样品载体的样品室中的样品的一部分进行的测量，以便确定样品的特性。

实施方案概述

根据本发明的一些应用，将包括细胞悬浮液的血液样品的一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中。通常，允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层。在细胞已经留置沉降在样品室的基底表面上(例如，通过已经留置沉降预定的时间间隔)之后，通常获取细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像。通常，获取单层的多于一幅图像，每幅图像对应于位于该单层的成像平面内各自不同区域的成像视野。通常，例如使用如Greenfield的美国专利US10,176,565中描述的技术确定聚焦显微镜以便对单层成像的最佳深度水平，该专利通过引用并入本文。对于一些应用，各自成像视野具有彼此不同的最佳深度水平。对于一些应用，在细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在单层内的血小板。

本申请的发明人已经注意到，通常情况是，即使在已经使用本文描述的技术留置沉降诸如以形成单层之后，血液样品内的血小板也不是全都沉降在单层内，并且一些细胞继续悬浮在细胞溶液内。更具体地，本发明人已经发现，通常情况是，即使在样品已经留置沉降约两分钟后，样品内10％与70％之间的血小板并未沉降在单层聚焦视野内。通常，如果允许单层在较长的时间段内形成，则更多的血小板沉降在单层聚焦视野内。然而，本发明人已经发现，即使允许单层在相对长的时间段内(例如，在15分钟与30分钟之间)形成，一些血小板仍然保持悬浮在溶液内，使得血小板不被置于单层聚焦视野内。通常，除了其中放置细胞溶液的腔的高度之外，保持悬浮在溶液内(使得血小板不被置于单层聚焦视野内)的血小板的数量取决于允许形成单层的时间。

因此，对于一些应用，为了准确估计样品中血小板的数量，除了鉴定单层聚焦视野内的血小板之外，还鉴定悬浮在细胞溶液内的血小板。通常，这样的血小板通过以下来鉴定：在将显微镜聚焦至以便对细胞单层(本文称为“单层深度水平”)成像的深度水平之外的深度水平聚焦显微镜，并且在这些另外的深度水平获取图像。通常，对在另外的深度水平获取的图像内的血小板进行鉴定和计数，并且基于这些图像内的血小板计数，估计悬浮在细胞溶液内的血小板的总计数。

对于一些应用，将已经沉降在单层内的血小板计数与尚未沉降在单层内的血小板计数进行比较。通常，响应于比较生成输出。对于一些应用，基于已经沉降在单层内的血小板计数和尚未沉降在单层内的血小板计数的比较，导出临床状况并将其输出至用户。例如，样品内血小板活化的程度可以至少部分地基于比较导出。可选地或另外地，临床状况可以基于血小板的尺寸、形状、沉降时间和/或沉降动力学导出。对于一些这样的应用，血小板的沉降动力学通过对同一成像视野进行多于一次成像(在每次图像获取之间有一定时间间隔)来确定，和/或通过确定直至特定时间样品室内存在的血小板的高度来确定。

对于一些应用，计算机处理器基于比较生成输出，该输出指示样品应以与制备样品的方式不同的方式制备(例如，通过改变在其中稀释样品的稀释液，通过添加血小板活化剂和/或通过添加凝固剂)。

对于一些应用，基于已经沉降在单层内的血小板计数和尚未沉降在单层内的血小板计数之间的比较，血液样品的部分对于用于对样品进行至少一些测量是无效的。例如，如果未沉降的血小板与沉降的血小板的比例大于第一特定阈值和/或低于第二特定阈值，则这可以解释为指示样品和/或其制备有问题。

对于一些应用，样品的参数(诸如血小板体积、平均血小板体积和/或中位值血小板体积)基于对样品的一部分进行的测量来确定。对于一些应用，测量基于已经沉降在单层内的血小板的特性与尚未沉降在单层内的血小板的特性之间的比较来校准。

因此，根据本发明的一些应用，提供了一种方法，该方法包括：

将是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中；

允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层；

在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用显微镜获取细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内；

在至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在单层内的血小板；

基于在至少一幅显微图像内鉴定的血小板，确定已经沉降在单层内的血小板的第一血小板计数；

在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，使用显微镜获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像；

在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板；

基于在至少一幅另外的显微图像内鉴定的血小板，确定尚未沉降在单层内的血小板的第二血小板计数；并且

基于第一小板计数和第二血小板计数生成输出。

在一些应用中，该方法还包括至少部分地基于将第一血小板计数和第二血小板计数彼此比较来导出关于血液样品的误差，其中生成输出包括生成误差的指示。

在一些应用中，该方法还包括至少部分地基于将第一血小板计数和第二血小板计数彼此比较来导出关于血液样品制备的误差，其中生成输出包括生成误差的指示。

在一些应用中，该方法还包括至少部分地基于将第一血小板计数和第二血小板计数彼此比较来导出受试者的临床状况，其中生成输出包括生成临床状况的指示。

在一些应用中，该方法还包括至少部分地基于将第一血小板计数和第二血小板计数彼此比较来导出血小板活化的量度，其中生成输出包括生成血小板活化的指示。

在一些应用中，在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板包括考虑置于单层内的白细胞对血小板可见度的干扰。

在一些应用中，在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板包括考虑置于单层内的红细胞对血小板可见度的干扰。

在一些应用中：

获取细胞单层的部分的至少一幅第一显微图像包括：在显微镜聚焦在一个或更多个单层深度水平时，在各自成像视野处获取单层的第一数量的图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内；

获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像包括在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，在各自成像视野处获取第二数量的图像；并且

第一数量与第二数量之间的比例大于2:1。

在一些应用中：

获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像包括在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的各自深度水平时，获取多于一幅另外的显微图像；并且

在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板包括避免对在相邻深度水平获取的图像内的血小板重复计数。

在一些应用中，避免对在相邻深度水平获取的图像内的血小板重复计数包括考虑在相邻深度水平获取的图像的获取之间血小板的横向移动。

因此，根据本发明的一些应用，还提供了一种方法，该方法包括：

将是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中；

允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层；

在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用显微镜获取细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内；

在至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在单层内的血小板；

在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，使用显微镜获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像；

在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板；并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在单层内的血小板生成输出。

在一些应用中，该方法还包括基于被鉴定为已经沉降在单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在单层内的血小板来估计血液样品的血小板计数，其中生成输出包括生成血小板计数的指示。

在一些应用中，该方法还包括基于被鉴定为已经沉降在单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在单层内的血小板来导出样品的血小板沉降特征，其中生成输出包括生成血小板沉降特征的指示。

在一些应用中，该方法还包括基于被鉴定为已经沉降在单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在单层内的血小板的组合来导出样品内的血小板特征，其中生成输出包括生成所导出的特征的指示。

因此，根据本发明的一些应用，还提供了一种方法，该方法包括：

将是悬浮液的样品的至少一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中；

允许细胞悬浮液中的实体沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成实体单层；

在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用显微镜获取实体单层的至少一部分的至少一幅显微图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内；

在至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在单层内的特定类型的实体；

在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，使用显微镜获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像；

在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的特定类型的实体；并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在单层内的特定类型的实体和被鉴定为尚未沉降在单层内的特定类型的实体生成输出。

因此，根据本发明的一些应用，还提供了设备，该设备包括：

样品室，该样品室是包括基底表面的腔，并且被配置为接收是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分，并且允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层；

显微镜，该显微镜被配置为：

在显微镜聚焦在单层深度水平时，获取细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内，并且

在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像；以及

计算机处理器，该计算机处理器被配置为：

在至少一幅第一显微图像内鉴定已经沉降在单层内的血小板，

基于在至少一幅显微图像内鉴定的血小板，确定已经沉降在单层内的血小板的第一血小板计数，

在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板，

基于在至少一幅另外的显微图像内鉴定的血小板，确定尚未沉降在单层内的血小板的第二血小板计数；并且

基于第一小板计数和第二血小板计数生成输出。

因此，根据本发明的一些应用，还提供了设备，该设备包括：

样品室，该样品室是包括基底表面的腔，并且被配置为接收是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分，并且允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层；

显微镜，该显微镜被配置为：

在显微镜聚焦在单层深度水平时，获取细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内，并且

在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像；以及

计算机处理器，该计算机处理器被配置为：

在至少一幅第一显微图像内鉴定已经沉降在单层内的血小板，

并且在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板，并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在单层内的血小板生成输出。

因此，根据本发明的一些应用，还提供了设备，该设备包括：

样品室，所述样品室是包括基底表面的腔，并且被配置为接收是细胞悬浮液的样品的至少一部分，并且允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层；

显微镜，该显微镜被配置为：

在显微镜聚焦在单层深度水平时，获取细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平单层处于显微镜的焦距内，并且

在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平时，获取样品的部分的至少一幅另外的显微图像；以及

计算机处理器，该计算机处理器被配置为：

在至少一幅第一显微图像内鉴定已经沉降在单层内的特定类型的实体，

在至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的特定类型的实体，并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在单层内的特定类型的实体和被鉴定为尚未沉降在单层内的特定类型的实体生成输出。

根据以下对本发明实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本发明，在附图中：

附图简述

图1是示出根据本发明的一些应用的生物样品分析系统的组件的框图；

图2A、图2B和图2C是根据本发明的一些应用的光学测量单元的示意图；

图3A、图3B和图3C是根据本发明的一些应用的用于进行显微测量和光密度测量二者的样品载体的各自视图的示意图；

图4A和图4B是根据本发明的一些应用使用各自的成像参数在明视野成像下从单层深度水平获取的显微图像；

图5是根据本发明的一些应用从单层深度水平获取的荧光显微图像；

图6A和图6B是根据本发明的一些应用使用各自的成像参数在明视野成像下从另外的深度水平(即，不是单层深度水平)获取的显微图像；

图7是根据本发明的一些应用从另外的深度水平获取的荧光显微图像；

图8是示出根据本发明的一些应用进行的方法的步骤的流程图；

图9是示出根据本发明的一些应用进行的另外方法的步骤的流程图；并且

图10是示出根据本发明的一些应用进行的另外方法的步骤的流程图。

实施方案详述

现在参考图1，其是示出根据本发明的一些应用的生物样品分析系统20的组件的框图。通常，将生物样品(例如，血液样品)放置到样品载体22中。在样品置于样品载体中时，使用一个或更多个光学测量装置24对样品进行光学测量。例如，光学测量装置可以包括显微镜(例如，数字显微镜)、分光光度计、光度计、分光计、相机、光谱相机、高光谱相机、荧光计、荧光分光光度计和/或光电探测器(诸如，光电二极管、光敏电阻和/或光电晶体管)。对于一些应用，光学测量装置包括专用光源(诸如发光二极管、白炽光源等)和/或用于操作光收集和/或光发射的光学元件(诸如透镜、漫射器(diffuser)、滤光器等)。

计算机处理器28通常接收并处理由光学测量装置进行的光学测量。此外，通常，计算机处理器控制由一个或更多个光学测量装置进行的光学测量的获取。计算机处理器与存储器30通信。用户(例如，实验室技术人员或从其抽取样品的个体)经由用户界面32向计算机处理器发送指令。对于一些应用，用户界面包括键盘、鼠标、操纵杆、触摸屏装置(诸如智能手机或平板计算机)、触摸板、轨迹球、语音命令界面和/或本领域已知的其他类型的用户界面。通常，计算机处理器经由输出装置34生成输出。此外，通常，输出装置包括显示器，诸如监视器，并且输出包括显示在显示器上的输出。对于一些应用，处理器在不同类型的视觉、文本、图形、触觉、音频和/或视频输出装置(例如，扬声器、耳机、智能手机或平板计算机)上生成输出。对于一些应用，用户界面32用作输入界面和输出界面二者，即，它用作输入/输出界面。对于一些应用，处理器在计算机可读介质(例如，非瞬时性计算机可读介质)诸如磁盘或便携式USB驱动器上生成输出，和/或在打印机上生成输出。

现在参考图2A、图2B和图2C，图2A、图2B和图2C是根据本发明的一些应用的光学测量单元31的示意图；图2A示出了完全组装的装置的外部的斜视图，而图2B和图2C示出了装置的各自斜视图，其中已使盖透明，使得装置内的组件可见。对于一些应用，一个或更多个光学测量装置24(和/或计算机处理器28和存储器30)容纳在光学测量单元31内。为了对样品进行光学测量，将样品载体22放置在光学测量单元内。例如，光学测量单元可以定义槽36，经由槽36将样品载体插入光学测量单元中。通常，光学测量单元包括台64，台64被配置为在光学测量单元内支撑样品载体22。对于一些应用，光学测量单元的盖上的屏幕63(例如，光学测量单元的前盖上的屏幕，如示出的)发挥用户界面32和/或输出设备34的作用。

通常，光学测量单元包括显微镜系统37(在图2B-图2C中示出)，其被配置为对样品的一部分进行显微成像。对于一些应用，显微镜系统包括一组光源65(其通常包括一组被配置为用于样品的明视野成像的明视野光源(例如发光二极管)、一组被配置为用于样品的荧光成像的荧光光源(例如发光二极管)和被配置为对样品成像的相机(例如CCD相机或CMOS相机)。通常，光学测量单元还包括光密度测量单元39(在图2C中示出)，其被配置为对样品的第二部分进行光密度测量(例如，光吸收测量)。对于一些应用，光密度测量单元包括一组光密度测量光源(例如，发光二极管)和光探测器，它们被配置为用于对样品进行光密度测量。对于一些应用，上述光源组(即，明视野光源组、荧光光源组和光密度测量光源组)中的每一组包括多于一种光源(例如，多于一种发光二极管)，其中每种光源被配置为以各自波长或以各自波长波段发射光。

现在参考图3A和图3B，图3A和图3B是根据本发明的一些应用的样品载体22的各视图的示意图。图3A示出了样品载体的顶视图(为了说明的目的，样品载体的顶盖在图3A中示出为不透明的)，并且图3B示出了底视图(其中相对于图3A所示的视图，样品载体已经绕其短边缘旋转)。通常，样品载体包括用于对样品进行显微分析的第一组52的一个或更多个样品室和用于对样品进行光密度测量的第二组54的样品室。通常，样品载体的样品室经由样品入口孔38填充身体样品，诸如血液。对于一些应用，样品室定义一个或更多个出口孔40。出口孔被配置为通过允许存在于样品室中的空气从样品室释放来辅助身体样品填充样品室。通常，如所示的，出口孔与入口孔纵向相对(相对于样品载体的样品室)地定位。对于一些应用，出口孔因此提供了比如果将出口孔置于更靠近入口孔处更有效的空气逸出机制。

参考图3C，其示出了根据本发明的一些应用的样品载体22的分解视图。对于一些应用，样品载体包括至少三个组件：模制组件42、玻璃层44(例如，玻璃板)和被配置为将玻璃层粘合至模制组件的下侧的粘合层46。模制组件通常由聚合物(例如，塑料)制成，其被模制(例如，经由注塑)以提供具有所期望几何形状的样品室。例如，如所示的，模制组件通常模制为定义围绕每个样品室中心部分的入口孔38、出口孔40和槽48。槽通常通过允许空气向出口孔流动和/或通过允许身体样品绕样品室的中心部分流动来辅助身体样品填充样品室。

对于一些应用，在对血液样品进行完整血液计数时，使用如图3A-图3C中所示的样品载体。对于一些这样的应用，样品载体与光学测量单元31一起使用，光学测量单元31通常参考图2A-图2C示出和描述来配置。对于一些应用，将血液样品的第一部分放置在第一组52的样品室内(其用于例如使用显微镜系统37(在图2B-图2C中示出)对样品进行显微分析)，并且将血液样品的第二部分放置在第二组54的样品室内(其用于例如使用光密度测量单元39(在图2C中示出)对样品进行光密度测量)。对于一些应用，第一组52的样品室包括多于一个样品室，而第二组54的样品室仅包括单个样品室，如所示的。然而，本申请的范围包括在第一组样品室内或第二组样品室内或其任何组合内使用任何数量的样品室(例如，单个样品室或多于一个样品室)。血液样品的第一部分通常相对于血液样品的第二部分进行稀释。例如，稀释液可以包含pH缓冲剂、染色剂、荧光染色剂、抗体、球形剂(sphering agents)、裂解剂等。通常，放置在第二组54的样品室内的血液样品的第二部分是天然的、未稀释的血液样品。可选地或另外地，血液样品的第二部分可以是经历一些修饰的样品，所述修饰包括以下一种或更多种：例如稀释(例如，以受控方式稀释)、添加组分或试剂或分级分离。

对于一些应用，在对样品进行显微成像之前，使用一种或更多种染色物质对血液样品的第一部分(放置在第一组52的样品室内)进行染色。例如，染色物质可以被配置为相对于其他细胞组分的染色优先对DNA染色。可选地，染色物质可以被配置为相对于其他细胞组分的染色优先对所有细胞核酸染色。例如，样品可以用吖啶橙试剂、Hoechst试剂和/或被配置为优先对血液样品中的DNA和/或RNA染色的任何其他染色物质来染色。任选地，染色物质被配置为对所有细胞核酸染色，但DNA和RNA各自的染色在一些照明和滤光条件下更显著可见，如对于例如吖啶橙已知的。可以使用允许检测细胞的成像条件(例如，明视野)和/或允许染色的小体可视化的成像条件(例如适当的荧光照明)来获取样品的图像。通常，样品的第一部分用吖啶橙试剂和Hoechst试剂染色。例如，血液样品的第一(稀释)部分可以使用如Pollak的US 9,329,129中描述的技术制备，该专利申请通过引用并入本文，并且该专利申请描述了用于制备用于分析的血液样品的方法，该方法包括稀释步骤，该稀释步骤有利于样品的显微图像内组分的鉴定和/或计数。对于一些应用，样品的第一部分用一种或更多种染色剂染色，该染色剂使样品内的血小板在明视野成像条件下和/或在荧光成像条件下可见，例如，如上文描述的。例如，样品的第一部分可以用亚甲蓝和/或罗氏染液(Romanowsky stains)染色。

同样参考图2B-图2C，通常，样品载体22由台64支撑在光学测量单元内。此外，通常，台具有叉形设计，使得样品载体由绕样品载体边缘的台支撑，但使得台不干扰样品载体的样品室对光学测量装置的可见性。对于一些应用，样品载体被保持在台内，使得样品载体的模制组件42被置于玻璃层44的上方，并且使得光学测量单元的显微镜单元的物镜66被置于样品载体的玻璃层的下方。通常，在对样品进行的显微测量期间使用的至少一些光源65(例如，在明视野成像期间使用的光源)从模制组件上方对样品载体照明。此外，通常，至少一些另外的光源(未示出)从样品载体下方(例如，经由物镜)对样品载体照明。例如，在荧光显微术期间用于激发样品的光源可以从样品载体下方(例如，经由物镜)对样品载体照明。

通常，在进行显微成像之前，允许血液的第一部分(放置在第一组52的样品室中)沉降，诸如以形成细胞单层，例如，使用如Pollak的US9,329,129中描述的技术，该专利申请通过引用并入本文。注意，在本申请的上下文中，术语单层用于指已经沉降，诸如置于显微镜的单个聚焦视野中的细胞层。在单层内可能存在一些细胞重叠，使得在某些区域内存在两个或更多个重叠细胞层。例如，在单层内红细胞可能彼此重叠，和/或在单层内血小板可能与红细胞重叠或置于红细胞上方。

对于一些应用，对血液样品的第一部分的显微分析是对细胞单层进行的。通常，血液样品的第一部分在明视野成像下成像，即在来自一个或更多个光源(例如，一个或更多个发光二极管，其通常在各自的光谱波段发射光)的照明下成像。此外，通常，血液样品的第一部分另外地在荧光成像下成像。通常，荧光成像通过以下来进行：将已知的激发波长(即，已知如果用这些波长的光激发，则染色的对象发射荧光的波长)的光导向样品来激发样品内染色的对象(即，已经吸收了染色剂的对象)，并检测荧光。通常，对于荧光成像，使用一组单独的光源(例如，一个或更多个发光二极管)以已知的激发波长对样品照明。

如参考Pollak的US 2019/0302099(其通过引用并入本文)描述的，对于一些应用，属于组52的样品室(用于显微术测量)具有彼此不同的高度，以便辅助使用各样品室的显微图像测量不同的测量对象(measurands)，和/或不同的样品室用于各样品类型的显微分析。例如，如果血液样品和/或由样品形成的单层具有相对低的红细胞密度，则可以在样品载体的具有较大高度的样品室内(即，样品载体的样品室相对于具有相对较低高度的不同样品室具有较大高度)进行测量，使得存在足够的细胞密度，和/或使得在由样品形成的单层内存在足够的细胞密度，以提供统计学上可靠的数据。这样的测量可以包括例如红细胞密度测量、其他细胞属性的测量(诸如异常红细胞的计数、包括胞内体(例如病原体、豪-乔小体)的红细胞的计数，等)和/或血红蛋白浓度。相反，如果血液样品和/或由样品形成的单层具有相对高密度的红细胞，则这样的测量可以对样品载体的具有相对较低高度的样品室进行，例如，使得存在足够稀疏的细胞，和/或使得在由样品形成的细胞单层内存在足够稀疏的细胞，使得可以在显微图像内鉴定细胞。对于一些应用，即使不精确知晓属于组52的样品室之间的高度变化，也可以进行这样的方法。

对于一些应用，基于被测量的测量对象，选择样品载体内在其上进行光学测量的样品室。例如，样品载体的具有较大高度的样品室可以用于进行白细胞计数(例如，以减少可能由较浅区域中的低计数引起的统计学误差)、白细胞分化和/或检测更罕见形式的白细胞。相反，为了确定平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)、红细胞形态特征和/或红细胞异常，可以从样品载体的具有相对较低高度的样品室获得显微图像，因为在这样的样品室中，细胞相对稀疏地分布在区域的整个面积中，和/或形成细胞相对稀疏地分布在其中的单层。类似地，为了对血小板计数、对血小板分类和/或提取血小板的任何其他属性(诸如体积)，可以从样品载体的具有相对较低高度的样品室获得显微图像，因为在这样的样品室内，在显微图像中和/或在单层中与血小板(完全或部分地)重叠的红细胞较少。

根据以上描述的实施方案，优选使用样品载体的具有较低高度的样品室来进行用于测量样品(诸如血液样品)内的一些测量对象的光学测量，而优选使用样品载体的具有较大高度的样品室来进行用于测量这样的样品内的其他测量对象的光学测量。因此，对于一些应用，通过对置于属于样品载体的组52的第一样品室内的样品的一部分进行第一光学测量(例如，通过获取其显微图像)来测量样品内的第一测量对象，并且通过对置于样品载体的组52的第二样品室内的样品的一部分进行第二光学测量(例如，通过获取其显微图像)来测量同一样品的第二测量对象。对于一些应用，第一测量对象和第二测量对象相对于彼此进行归一化，例如，使用如Zait的US 2019/0145963中描述的技术，其通过引用并入本文。

通常，为了对样品进行光密度测量，期望尽可能精确知晓对其进行光学测量的样品部分的光路长度、体积和/或厚度。通常，对样品的第二部分(其通常以未稀释的形式放置在第二组54的样品室中)进行光密度测量。例如，组分的浓度和/或密度可以通过对样品进行光吸收、透射、荧光和/或发光测量来测量。

同样参考图3B，对于一些应用，属于组54的样品室(用于光密度测量)定义至少第一区域56(其通常较深)和第二区域58(其通常较浅)，样品室的高度以预定义的方式在第一区域与第二区域之间变化，例如，如Pollak的US 2019/0302099中描述的，该专利申请通过引用并入本文。样品室的第一区域56和第二区域58的高度由玻璃板定义的下表面和模制组件定义的上表面定义。第二区域处的上表面相对于第一区域处的上表面呈台阶状。在第一区域与第二区域处的上表面之间的台阶提供区域之间的预定的高度差Δh，使得即使已知区域的绝对高度未达到足够的准确度(例如，由于制造过程中的公差)，但也已知高度差Δh达到足够的准确度，以使用本文描述并如Pollak的US 2019/0302099中描述的技术来确定样品的参数，该专利申请通过引用并入本文。对于一些应用，样品室的高度从第一区域56至第二区域58变化，并且然后高度同样从第二区域至第三区域59变化，使得沿着样品室，第一区域56定义最大高度区域，第二区域58定义中等高度区域，并且第三区域59定义最小高度区域。对于一些应用，高度的另外变化沿着样品室的长度发生，和/或高度沿着样品室的长度逐渐变化。

如上文描述的，在样品置于样品载体中时，使用一个或更多个光学测量装置24对样品进行光学测量。通常，样品通过光学测量装置经由玻璃层进行观察，玻璃至少对光学测量装置通常使用的波长是透明的。通常，在进行光学测量时，将样品载体插入容纳光学测量装置的光学测量单元31中。通常，光学测量单元容纳样品载体，使得模制层置于玻璃层上方，并且使得光学测量单元置于样品载体的玻璃层下方，并且能够经由玻璃层对样品进行光学测量。样品载体通过将玻璃层粘附至模制组件而形成。例如，玻璃层和模制组件可以在制造或组装期间彼此结合(例如使用热结合(thermal bonding)、溶剂辅助结合(solvent-assisted bonding)、超声波焊接、激光焊接、热铆接、粘合剂、机械夹紧和/或另外的物质)。对于一些应用，玻璃层和模制组件在制造或组装期间使用粘合层46彼此结合。

根据本发明的一些应用，包括将细胞悬浮液的血液样品的一部分放置在是包括基底表面57的腔55的样品室中(在图3C中示出)。根据各自的应用，腔是封闭的(即，被覆盖的)腔，或者是开放的(即，未被覆盖的)腔。例如，如上文描述的，血液样品的第一部分通常放置在第一组52的样品室中。对于一些应用，在血液样品的第一部分被稀释之后，将血液样品的第一部分放置在第一组52的样品室中。通常，允许细胞悬浮液中的细胞沉降在样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层。如上文所述，在本申请的上下文中，术语单层用于指已经沉降，诸如置于显微镜的单个聚焦视野(本文称为“单层聚焦视野”)中的细胞层。在单层内可能存在一些细胞重叠，使得在某些区域内存在两个或更多个重叠细胞层。例如，在单层内红细胞可能彼此重叠，和/或在单层内血小板可能与红细胞重叠或置于红细胞上方。

在细胞已经留置沉降在样品室的基底表面上(例如，通过已经留置沉降预定的时间间隔)之后，通常获取细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像。通常，获取单层的多于一幅图像，每幅图像对应于位于该单层的成像平面内各自不同区域的成像视野。通常，例如使用如Greenfield的US 10,176,565中描述的技术确定聚焦显微镜以便对单层成像的最佳深度水平，该专利通过引用并入本文。对于一些应用，各自成像视野具有彼此不同的最佳深度水平。对于一些应用，在细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在单层内的血小板。

本申请的发明人已经注意到，通常情况是，即使在已经使用本文描述的技术留置沉降诸如以形成单层之后，血液样品内的血小板也不是全都沉降在单层内，并且一些细胞继续悬浮在细胞溶液内。更具体地，本发明人已经发现，通常情况是，即使在样品已经留置沉降约两分钟后，样品内10％与70％之间的血小板并未沉降在单层聚焦视野内。通常，如果允许单层在较长的时间段内形成，则更多的血小板沉降在单层聚焦视野内。然而，本发明人已经发现，即使允许单层在相对长的时间段内(例如，在15分钟与30分钟之间)形成，一些血小板仍然保持悬浮在溶液内，使得血小板不被置于单层聚焦视野内。通常，除了其中放置细胞溶液的腔的高度之外，保持悬浮在溶液内(使得血小板不被置于单层聚焦视野内)的血小板的数量取决于允许形成单层的时间。

因此，对于一些应用，为了准确估计样品中血小板的数量，除了鉴定单层聚焦视野内的血小板之外，还鉴定悬浮在细胞溶液内的血小板。通常，这样的血小板通过以下来鉴定：在将显微镜聚焦至以便对细胞单层成像的深度水平(本文称为“单层深度水平”)之外的深度水平聚焦显微镜，并且在这些另外的深度水平获取图像。通常，对在另外的深度水平获取的图像内的血小板进行鉴定和计数，并且基于这些图像内的血小板计数，估计悬浮在细胞溶液内的血小板的总计数。

如上文描述的，通常，悬浮在细胞溶液内的血小板通过在另外的深度水平获取显微图像来鉴定。通常，细胞溶液被成像的连续的另外的深度水平之间的高度间隔取决于显微镜光学系统的聚焦深度。例如，取决于显微镜光学系统的聚焦深度，显微镜可以聚焦于在样品室内的样品部分的高度上以特定的高度差(例如，在1微米与10微米之间)彼此分开的另外的深度水平。通常，在单层深度水平内，从相对大量的成像视野获取样品室的显微图像，如上文描述的。例如，单层的显微图像可以从100个与500个之间的成像视野获取。通常，通过以相对于其他图像增加的曝光时间获取这些图像，这些成像视野中的5个与100个之间(例如，10个与50个之间)被优化用于鉴定血小板。对于一些应用，对于每个另外的深度水平，仅从成像视野的子集获取显微图像，以便减少相对于如果从所有成像视野获取显微图像对样品部分成像所需的时间量。例如，可以在每个另外的深度水平内获取3个与10个之间的成像视野的显微图像。对于一些应用，(a)对单层成像并优化用于鉴定血小板(例如，如以上描述，通过增加曝光时间)的成像视野数与(b)对每个另外的深度水平成像的成像视野数的比例在2:1与10:1之间。对于一些应用，比例是1:1。

对于一些应用，样品的部分在明视野成像下在另外的深度水平成像，例如，如上文描述的。可选地或另外地，样品的部分在荧光成像下在另外的深度水平成像，例如，如上文描述的。对于一些应用，样品的第一部分用一种或更多种染色剂染色，该染色剂使样品内的血小板在明视野成像条件下和/或在荧光成像条件下可见，例如，如上文描述的。例如，样品的第一部分可以用亚甲蓝和/或罗氏染液染色。对于一些应用，例如，在另外的深度水平获取具有不一定是为血小板检测优化的成像参数的图像，以便检测其他实体，否则所述实体可能与血小板混淆。

现在参考图4A和图4B，图4A和图4B是根据本发明的一些应用使用各自的成像参数在明视野成像下从单层深度水平获取的显微图像。如可以观察到的，在图像内可鉴定出血小板60，并且血小板被红细胞61包围。红细胞处于聚焦中，因为图像是在红细胞沉降在其内的单层深度水平获取的。还参考图5，图5是根据本发明的一些应用从单层深度水平获取的荧光显微图像。同样，在图像内可鉴定出血小板60，并且血小板被隐约可见的红细胞包围。

另外地，参考图6A和图6B，图6A和图6B是根据本发明的一些应用使用各自的成像参数在明视野成像下从另外的深度水平(即，不是单层深度水平)获取的显微图像。如可以观察到的，在图像内可鉴定出血小板60，并且红细胞在背景中可见。红细胞处于失焦中，因为图像不是在红细胞已经沉降在其内的单层深度水平获取的。还参考图7，图7是根据本发明的一些应用从另外的深度水平获取的荧光显微图像。同样，在图像内可鉴定出血小板60。

通常，在另外的深度水平获取的图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板。(注意到所鉴定的血小板可能包括在另外的深度水平内的失焦的血小板。)此外，通常，基于在另外的深度水平获取的图像内鉴定的血小板，估计尚未沉降在单层内的血小板的计数。对于一些应用，为了进行以上描述的估计，计算机处理器被配置为通过鉴定在置于成像平面内彼此相似位置处的相邻深度水平获取的图像内的血小板，并确定在每个深度水平鉴定的血小板是否可能对应于单个(即，同一)血小板，来避免对在相邻深度水平获取的图像内的血小板重复计数。对于一些应用，在确定在每个相邻深度水平鉴定的血小板是否可能对应于单个(即，同一)血小板时，计算机处理器考虑在每个相邻深度水平获取的图像之间血小板的横向移动。对于一些应用，为了进行以上描述的估计，计算机处理器被配置为考虑置于单层内和/或悬浮在细胞溶液内的白细胞对血小板可见度的干扰。例如，在另外的深度水平获取的荧光图像中，在单层内发荧光的白细胞通常是可见的，并且干扰置于白细胞上方的血小板的可见度。因此，在单层内置于白细胞上方的血小板可能不被包括在血小板计数中。由于白细胞上方体积内的血小板不被包括在计数中，因此可以估计在这些体积内的血小板数量。可选地或另外地，为了进行以上描述的估计，计算机处理器被配置为考虑置于单层内并且可能干扰明视野图像内血小板的鉴定的红细胞对血小板可见度的干扰。

对于一些应用，单层深度水平内和/或另外的深度水平内的血小板计数被归一化，和/或其他统计学分析技术被应用于这些计数中的一种或两种。例如，特定成像视野内的血小板计数可以相对于该视野内的红细胞计数进行归一化，血小板沉降的时间动力学可以并入对未沉降在单层内的血小板的估计，和/或可以从估计中去除异常值。对于一些应用，如果存在低血小板计数，如果存在异常值视野(例如，具有非常高或非常低的血小板计数)，和/或如果在另外的深度水平成像的成像视野由于错误而被拒绝，则对另外的成像视野进行成像。

对于一些应用，将已经沉降在单层内的血小板计数与尚未沉降在单层内的血小板计数进行比较。通常，响应于比较生成输出。对于一些应用，基于已经沉降在单层内的血小板计数和尚未沉降在单层内的血小板计数的比较，导出临床状况并将其输出至用户。例如，样品内血小板活化的程度可以至少部分地基于比较导出。可选地或另外地，临床状况可以基于血小板的尺寸、形状、沉降时间和/或沉降动力学导出。对于一些这样的应用，血小板的沉降动力学通过对同一成像视野进行多于一次成像(在每次图像获取之间有一定时间间隔)来确定，和/或通过确定直至特定时间样品室内存在的血小板的高度来确定。

对于一些应用，计算机处理器基于比较生成输出，该输出指示样品应以与制备样品的方式不同的方式制备(例如，通过改变在其中稀释样品的稀释液，通过添加血小板活化剂和/或通过添加凝固剂)。

对于一些应用，基于已经沉降在单层内的血小板计数和尚未沉降在单层内的血小板计数之间的比较，血液样品的部分用于对样品进行至少一些测量是无效的。例如，如果未沉降的血小板与沉降的血小板的比例大于第一特定阈值和/或低于第二特定阈值，则这可以解释为指示样品和/或其制备有问题。

对于一些应用，样品的参数(诸如血小板体积、平均血小板体积和/或中位值血小板体积)基于对样品的第一部分进行的测量来确定。对于一些应用，测量基于已经沉降在单层内的血小板的特性与尚未沉降在单层内的血小板的特性之间的比较来校准。

现在参考图8和图9，图8和图9是示出根据本发明的一些应用对血液样品内的血小板进行的方法的步骤的流程图。对于一些应用，将细胞悬浮液放置在样品室内(步骤70)并允许其沉降以形成单层(步骤71)。随后，在显微镜聚焦在单层深度水平时，获取至少一幅图像(步骤72)，并在图像中鉴定已经沉降在单层内的血小板(步骤74)。另外，在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平上时，获取样品的至少一幅显微图像(步骤73)，并在与单层深度水平不同的深度水平的至少一幅显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的血小板(步骤75)。如所示的，至少部分地基于被鉴定为已经沉降在单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在单层内的血小板生成输出(步骤79)。对于一些应用，如图9所示，在鉴定图像中的血小板(步骤74和步骤75)之后，确定已经沉降在单层内的血小板的第一血小板计数(步骤76)，并且确定尚未沉降在单层内的血小板的第二计数(步骤77)。然后基于第一血小板计数和第二血小板计数生成输出(步骤78)。例如，根据上文描述的方法，可以基于第一血小板计数与第二血小板计数之间的比较来生成输出。

通常，应注意尽管关于血液样品内的血小板已经描述了本发明的一些应用，但本发明的范围包括本文描述的设备和方法作必要修改后应用于各种样品内的各种实体。例如，参考鉴定尚未沉降在单层内的血小板描述的设备和方法作必要修改后可以对血液样品内的其他实体来进行。这样的实体可以包括白细胞、异常白细胞、循环肿瘤细胞、红细胞、网织红细胞、豪-乔小体、异物(诸如细菌、真菌、酵母或寄生虫)、添加至稀释液中的实体(诸如珠)等。

现在参考图10，图10是示出根据本发明的一些应用对血液样品内的实体进行的方法的步骤的流程图。如上文参考图8和图9描述的，将细胞悬浮液放置在样品室内(步骤70)并允许其沉降以形成单层(步骤71)。随后，在显微镜聚焦在单层深度水平时，获取至少一幅图像(步骤72)，并在图像中鉴定特定类型的实体(步骤92)。另外，在显微镜聚焦在与单层深度水平不同的深度水平上时，获取样品的至少一幅显微图像(步骤73)，并在与单层深度水平不同的深度水平的至少一幅显微图像内鉴定尚未沉降在单层内的特定类型的实体(步骤94)。如所示的，至少部分地基于被鉴定为已经沉降在单层内的特定类型的实体和被鉴定为尚未沉降在单层内的特定类型的实体生成输出(步骤96)。

对于一些应用，本文描述的设备和方法作必要修改后应用于生物样品，诸如，血液、唾液、精液、汗液、痰、阴道液、粪便、母乳、支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、眼泪和/或鼻分泌物(nasal discharge)。生物样品可以来自任何生物，并且通常来自温血动物。对于一些应用，生物样品是来自哺乳动物的样品，例如来自人体的样品。对于一些应用，样品取自任何家养动物、动物园动物和农场动物，包括但不限于犬、猫、马、牛和绵羊。可选地或另外地，生物样品取自用作疾病载体(disease vector)的动物，包括鹿或大鼠。

对于一些应用，本文描述的设备和方法应用于非身体样品。作必要修改后，对于一些应用，样品是环境样品，诸如水(例如地下水)样品、表面拭子、土壤样品、空气样品或其任何组合。在一些实施方案中，样品是食品样品，诸如肉类样品、乳制品样品、水样品、洗涤液样品、饮料样品和/或其任何组合。

对于一些应用，如本文描述的样品是包括血液或其组分的样品(例如，稀释或未稀释的全血样品、主要包括红细胞的样品、或主要包括红细胞的稀释样品)，并确定与血液中的组分(诸如血小板、白细胞、异常白细胞、循环肿瘤细胞、红细胞、网织红细胞、豪-乔小体等)相关的参数。

本文描述的本发明的应用可以采取从计算机可用介质或计算机可读介质(例如，非瞬时性计算机可读介质)可访问的计算机程序产品的形式，该介质提供由计算机或任何指令执行系统(诸如计算机处理器28)使用的程序代码或结合计算机或任何指令执行系统(诸如计算机处理器28)使用的程序代码。出于本说明的目的，计算机可用介质或计算机可读介质可以是任何可以包括、存储、通信、传播或传输程序的设备，所述程序由指令执行系统、设备或装置使用或结合指令执行系统、设备或装置使用。介质可以是电子、磁、光学、电磁、红外或半导体系统(或设备或装置)或传播介质。通常，计算机可用介质或计算机可读介质是非瞬时性计算机可用介质或非瞬时性计算机可读介质。

计算机可读介质的实例包括半导体或固态存储器、磁带、可移动计算机磁盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬磁盘和光盘。目前光盘的实例包括光盘只读存储器(CD-ROM)、光盘读/写(CD-R/W)和DVD。

一种适于存储和/或执行程序代码的数据处理系统将包括通过系统总线直接或间接耦合至存储器元件(例如，存储器30)的至少一个处理器(例如，计算机处理器28)。存储器元件可以包括实际执行程序代码期间使用的本地存储器、大容量存储器和高速缓存存储器，所述高速缓存存储器提供至少一些程序代码的瞬时性存储，以便减少在执行期间必须从大容量存储器中检索代码的次数。系统可以读取程序存储装置上的本发明指令，并且遵循这些指令来执行本发明实施方案的方法。

网络适配器可以耦合至处理器，以使得处理器能够通过介入的专用或公共网络变得耦合至其他处理器或远程打印机或存储装置。调制解调器、电缆调制解调器和以太网卡仅是目前可用的网络适配器类型中的几种。

用于进行本发明的操作的计算机程序代码可以用一种或更多种编程语言的任何组合来编写，所述编程语言包括面向对象的编程语言诸如Java、Smalltalk、C++等和常规程序编程语言诸如C编程语言或类似编程语言。

应当理解，本文描述的算法可以通过计算机程序指令来实现。这些计算机程序指令可以被提供至通用计算机的、专用计算机的或其他可编程数据处理设备的处理器以生产机器，使得经由计算机处理器(例如，计算机处理器28)或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令创建用于实施在本申请描述的算法中指定的功能/操作的装置。这些计算机程序指令还可以存储在计算机可读介质(例如，非瞬时性计算机可读介质)中，该介质可以指导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式工作，使得存储在计算机可读介质中的指令产生包括实现流程图框和算法中指定的功能/操作的指令装置的产品。计算机程序指令还可以加载到计算机或其他可编程数据处理设备上，以使得在计算机或其他可编程设备上进行一系列操作步骤，以产生计算机实现的处理，使得在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在本申请中描述的算法中指定的功能/操作的处理。

计算机处理器28通常是用计算机程序指令编程以产生专用计算机的硬件装置。例如，在被编程以进行本文描述的算法时，计算机处理器28通常用作专用样品分析计算机处理器。通常，本文描述的由计算机处理器28进行的操作根据所使用的存储器的技术将存储器30(其为真实的物理物品)的物理状态转换为具有不同的磁极性、电荷等。

本文描述的设备和方法可以结合以下任一专利或专利申请中描述的设备和方法使用，所有这些专利或专利申请都通过引用并入本文：

Bachelet的US 9,522,396；

Greenfield的US 10,176,565；

Pollak的US 10,640,807；

Pollak的US 9,329,129；

Pollak的US 10,093,957；

Yorav Raphael的US 10,831,013；

Bachelet的US 10,843,190；

Yorav Raphael的US 10,482,595；

Eshel的US 10,488,644；

Eshel的WO 17/168411；

Pollak的US 2019/0302099；

Zait的US 2019/0145963；以及

Yorav-Raphael的WO 19/097387。

本领域技术人员将理解，本发明不受限于上文特别示出和描述的内容。而是，本发明的范围包括上文描述的各种特征的组合和子组合二者，以及它们在现有技术中不存在的变化和修改，本领域技术人员在阅读前述描述时将会想到这些。

Claims (19)

1.一种方法，所述方法包括：

将是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中；

允许所述细胞悬浮液中的细胞沉降在所述样品室的基底表面上，以在所述样品室的基底表面上形成细胞单层；

在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用所述显微镜获取所述细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内；

在所述至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的血小板；

基于在所述至少一幅显微图像内鉴定的血小板，确定已经沉降在所述单层内的血小板的第一血小板计数；

在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，使用所述显微镜获取所述样品的所述部分的至少一幅另外的显微图像；

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板；

基于在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定的血小板，确定尚未沉降在所述单层内的血小板的第二血小板计数；并且

基于所述第一小板计数和所述第二血小板计数生成输出。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括至少部分地基于将所述第一血小板计数和所述第二血小板计数彼此比较来导出关于所述血液样品的误差，其中生成所述输出包括生成所述误差的指示。

3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括至少部分地基于将所述第一血小板计数和所述第二血小板计数彼此比较来导出关于所述血液样品制备的误差，其中生成所述输出包括生成所述误差的指示。

4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括至少部分地基于将所述第一血小板计数和所述第二血小板计数彼此比较来导出受试者的临床状况，其中生成所述输出包括生成所述临床状况的指示。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括至少部分地基于将所述第一血小板计数和所述第二血小板计数彼此比较来导出血小板活化的量度，其中生成所述输出包括生成所述血小板活化的指示。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板包括考虑置于所述单层内的白细胞对血小板可见度的干扰。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板包括考虑置于所述单层内的红细胞对血小板可见度的干扰。

8.根据权利要求1所述的方法，其中：

获取所述细胞单层的所述部分的所述至少一幅第一显微图像包括在所述显微镜聚焦在一个或更多个单层深度水平时，在各自成像视野处获取所述单层的第一数量的图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内；

获取所述样品的所述部分的所述至少一幅另外的显微图像包括在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，在各自成像视野处获取第二数量的图像；并且

所述第一数量与所述第二数量之间的比例大于2:1。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中：

获取所述样品的所述部分的所述至少一幅另外的显微图像包括在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的各自深度水平时，获取多于一幅另外的显微图像；并且

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板包括避免对在相邻深度水平获取的图像内的血小板重复计数。

10.根据权利要求9所述的方法，其中避免对在相邻深度水平获取的图像内的血小板重复计数包括考虑在相邻深度水平获取的图像的获取之间血小板的横向移动。

11.一种方法，所述方法包括：

将是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中；

允许所述细胞悬浮液中的细胞沉降在所述样品室的基底表面上，以在载体的基底表面上形成细胞单层；

在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用所述显微镜获取所述细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内；

在所述至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的血小板；

在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，使用所述显微镜获取所述样品的所述部分的至少一幅另外的显微图像；

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板；并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的血小板生成输出。

12.根据权利要求11所述的方法，所述方法还包括基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的血小板来估计所述血液样品的血小板计数，其中生成输出包括生成所述血小板计数的指示。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，所述方法还包括基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的血小板来导出所述样品的血小板沉降特征，其中生成输出包括生成所述血小板沉降特征的指示。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，所述方法还包括基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的血小板的组合来导出所述样品内的血小板特征，其中生成输出包括生成所导出的特征的指示。

15.一种方法，所述方法包括：

将是悬浮液的样品的至少一部分放置在是包括基底表面的腔的样品室中；

允许所述细胞悬浮液中的实体沉降在所述样品室的基底表面上，以在所述样品室的基底表面上形成实体单层；

在显微镜聚焦在单层深度水平时，使用所述显微镜获取所述实体单层的至少一部分的至少一幅显微图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内；

在所述至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的特定类型的实体；

在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，使用所述显微镜获取所述样品的所述部分的至少一幅另外的显微图像；

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的所述特定类型的实体；并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的所述特定类型的实体和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的所述特定类型的实体生成输出。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在所述至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的特定类型的实体包括在所述至少一幅显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的实体，所述实体选自由以下组成的组：白细胞、异常白细胞、循环肿瘤细胞、红细胞、网织红细胞、豪-乔小体和异物。

17.设备，所述设备包括：

样品室，所述样品室是包括基底表面的腔，并且被配置为接收是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分，并且允许所述细胞悬浮液中的细胞沉降在所述样品室的基底表面上，以在所述样品室的基底表面上形成细胞单层；

显微镜，所述显微镜被配置为：

在所述显微镜聚焦在单层深度水平时，获取所述细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内，并且

在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，获取所述样品的所述部分的至少一幅另外的显微图像；以及

计算机处理器，所述计算机处理器被配置为：

在所述至少一幅第一显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的血小板，

基于在所述至少一幅显微图像内鉴定的血小板，确定已经沉降在所述单层内的血小板的第一血小板计数，

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板，

基于在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定的血小板，确定尚未沉降在所述单层内的血小板的第二血小板计数；并且

基于所述第一血小板计数和所述第二血小板计数生成输出。

18.设备，所述设备包括：

样品室，所述样品室是包括基底表面的腔，并且被配置为接收是细胞悬浮液的血液样品的至少一部分，并且允许所述细胞悬浮液中的细胞沉降在所述样品室的基底表面上，以在所述样品室的基底表面上形成细胞单层；

显微镜，所述显微镜被配置为：

在所述显微镜聚焦在单层深度水平时，获取所述细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内，并且

在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，获取所述样品的所述部分的至少一幅另外的显微图像；以及

计算机处理器，所述计算机处理器被配置为：

在所述至少一幅第一显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的血小板，

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的血小板，并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的血小板和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的血小板生成输出。

19.设备，所述设备包括：

样品室，所述样品室是包括基底表面的腔，并且被配置为接收是细胞悬浮液的样品的至少一部分，并且允许所述细胞悬浮液中的细胞沉降在所述样品室的基底表面上，以在所述样品室的基底表面上形成细胞单层；

显微镜，所述显微镜被配置为：

在所述显微镜聚焦在单层深度水平时，获取所述细胞单层的至少一部分的至少一幅第一显微图像，在所述单层深度水平所述单层处于所述显微镜的焦距内，并且

在所述显微镜聚焦在与所述单层深度水平不同的深度水平时，获取所述样品的所述部分的至少一幅另外的显微图像；以及

计算机处理器，所述计算机处理器被配置为：

在所述至少一幅第一显微图像内鉴定已经沉降在所述单层内的特定类型的实体，

在所述至少一幅另外的显微图像内鉴定尚未沉降在所述单层内的所述特定类型的实体，并且

至少部分地基于被鉴定为已经沉降在所述单层内的所述特定类型的实体和被鉴定为尚未沉降在所述单层内的所述特定类型的实体生成输出。

Images