CN109957002A - 一种氨基酸序列在识别气味化合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种氨基酸序列在识别气味化合物中的应用。具体涉及如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列在识别气味化合物中的应用。所述气味化合物为反‑2‑己烯醇、肉桂醛、苯乙酸甲酯、4‑乙基苯乙酮、反‑3‑己烯醇和正辛醇中的至少一种。

Description

一种氨基酸序列在识别气味化合物中的应用

技术领域

本申请涉及一种氨基酸序列在识别气味化合物中的应用。

背景技术

棉铃虫(Helicoverpa armigera)，属于鳞翅目、夜蛾科害虫，在中国多个省份及世界上其他地区广泛分布。其幼虫具有高度杂食性，取食包括玉米、大豆、棉花、番茄等主要经济作物在内的120多种植物，造成严重的经济损失。其成虫具有高度迁移性，雌虫具有很强的产卵能力，最高可产1000多颗卵，而雄虫被报道可多次交配，因此棉铃虫的防治是很大的难题。农药的大面积使用带来多种问题，如生态污染，害虫抗性增加等。害虫综合治理(IPM)一直是被国际上多个国家大力支持的防治策略。在中国，转基因作物的推广种植(如转Bt棉花、转Bt玉米)有效地控制了棉铃虫的大面积危害。然而，近年来棉铃虫对Bt产生抗性已多有报道，可以预见转基因作物将面临的靶标害虫抗性增加的越来越严峻的挑战。

植物挥发物在昆虫取食、交配、产卵等重要生物学活动中发挥的重要作用已经被充分证明。对于棉铃虫，很多行为学实验表明寄主植物如棉花、大豆、烟草的多种挥发物组分对其雌、雄蛾有引诱作用。

然而，对于植物源的昆虫引诱剂组分的开发，传统的方法遇到的主要问题有：1.工序复杂：挥发物组分鉴定过程操作复杂；2.工作量大：植物挥发物组分数量众多，利用行为学试验逐一验证不同组分的引诱效果工作量巨大；3.开发周期长：引诱剂开发的每一步都需要占据较长的时间。

如果能找到棉铃虫识别气味的气味受体蛋白，那么将克服传统开发引诱剂过程中存在的缺陷。

发明内容

本申请之一提供了如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列在识别气味化合物中的应用。

在一个具体实施方式中，所述气味化合物为反-2-己烯醇、肉桂醛、苯乙酸甲酯、4-乙基苯乙酮、反-3-己烯醇和正辛醇中的至少一种。

本申请之二提供了能够编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列在识别气味化合物中的应用。

在一个具体实施方式中，所述气味化合物为反-2-己烯醇、肉桂醛、苯乙酸甲酯、4-乙基苯乙酮、反-3-己烯醇和正辛醇中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本申请之三提供了一种鉴别气味化合物的方法，其包括如下步骤：

1)将第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在细胞或昆虫的触角中进行共表达，得到表达有气味受体二聚体的细胞或昆虫的触角；其中，第一氨基酸序列包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，第二氨基酸序列包括如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；

2)通过测定所述细胞或昆虫的触角在用气味化合物缓冲液刺激前后的细胞膜电位或神经元放电频率变化来判断所述气味化合物是否能够激活所述气味受体二聚体。

在一个具体实施方式中，在步骤1)中，所述细胞为非洲爪蟾的卵母细胞。

在一个具体实施方式中，在步骤1)中具体包括向非洲爪蟾的卵中导入第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，之后培养所述非洲爪蟾的卵(例如培养2至5天)，得到表达有气味受体二聚体的非洲爪蟾卵母细胞；其中，所述第一核苷酸序列包括依次从5’到3’的第一核苷酸非编码序列，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列和第二核苷酸非编码序列；第二核苷酸序列包括依次从5’到3’的第三核苷酸非编码序列，编码SEQ ID No.11所示的氨基酸序列的核苷酸序列和第四核苷酸非编码序列。

在一个具体实施方式中，第一核苷酸非编码序列和第三核苷酸非编码序列独立地为SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

在一个具体实施方式中，第二核苷酸非编码序列和第四核苷酸非编码序列独立地为SEQ ID No.9。

在一个具体实施方式中，所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列的质量比为0.8-1.2:1。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，将气味化合物溶于1×Ringer，得到气味化合物灌流液，将所述气味化合物灌流液加入到灌流管中，利用双电极电压钳系统测定所述表达有气味受体二聚体的非洲爪蟾卵母细胞经所述气味化合物灌流液刺激前后的电流值，根据经所述气味化合物灌流液刺激前后得到的电流值的差值判断所述气味化合物是否能够激活所述气味受体二聚体。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，首先将气味化合物溶于二甲基亚砜中，形成例如0.5M至1.5M的气味化合物母液，然后将所述气味化合物母液溶于1×Ringer，得到气味化合物灌流液。其中，气味化合物在灌流液中的浓度根据实际需要来确定其浓度。

在一个具体实施方式中，在所述步骤2)中，缓冲液的pH值为7.4-7.8，其包括如下组分：9.5-9.7mM NaCl,0.15-0.25mM KCl,0.4-0.6mM MgCl₂-6H₂O,0.4-0.6mM HEPES,0.5-0.7mM CaCl₂。

在一个具体实施方式中，将所述非洲爪蟾的卵培养3天得到所述非洲爪蟾卵母细胞。

在一个具体实施方式中，昆虫的触角为果蝇的触角。本领域的技术人员熟知可以利用果蝇空神经元体内表达系统来共表达所述气味受体二聚体，并可通过本领域技术人员熟知的技术手段来测定果蝇触角的神经元放电频率。

本申请的有益效果：

本申请首次发现棉铃虫的HarmOR59基因为气味受体基因，其产生的蛋白对肉桂醛和/或反-2-己烯醇具有非常强的敏感性，对苯乙酸甲酯、4-乙基苯乙酮、反-3-己烯醇和正辛醇也具有一定的敏感性。从而可以基于此来制备引诱棉铃虫的引诱剂。

通过利用气味受体HarmOR59灵敏识别特定气味的功能，筛选得到可用于棉铃虫引诱剂的气味物质，可以大大简化开发引诱剂组分的工序，降低工作量，并明显缩短了开发周期。

具体实施方式

以下通过优选的实施例的形式对本申请的上述内容作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本申请的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。选用的化学试剂为分析纯。

实施例1

1.棉铃虫气味受体基因HarmOR59的克隆和cRNA合成

1.1取羽化后1-3天的棉铃虫触角，提取RNA并反转成cDNA；

1.2根据HarmOR59的mRNA(SEQ ID No.1，其对应编码的氨基酸序列的SEQ IDNo.2)序列，设计引物OR59-F(SEQ ID No.3)和引物OR59-R(SEQ ID No.4)，以步骤1.1中获得的cDNA为模板克隆HarmOR59的编码序列(SEQ ID No.1)，连接克隆载pMD-19上，转入大肠杆菌感受态细胞37℃培养过夜，挑单克隆测序确定基因序列，得到pMD-HarmOR59；

1.3合成连表达载体引物OR59-PT7Ts-F(SEQ ID No.5)、OR59-PT7Ts-R(SEQ IDNo.6)，OR59-PT7Ts-F引物的构成为：与表达载体上游相同的20个核苷酸序列(acgctcaacttggcagatct)+Kozak序列(gccacc)+全长引物OR59-F(SEQ ID No.3)；OR59-PT7Ts-R引物的构成为：与表达载体下游相同的20个核苷酸序列(gatcctagtcagtcactagt)+全长引物OR59-R(SEQ ID No.4)。以pMD-HarmOR59质粒为模板进行PCR克隆基因全长，PCR后对产物进行纯化；将表达载体PT7Ts质粒(Addgene plasmid#17091)用限制性内切酶BglII、SpeI进行双酶切，酶切产物纯化后与上述纯化的PCR产物通过同源重组方式连接(诺唯赞C112-01)，之后转入大肠杆菌感受态细胞Trans-T1(全式金)37℃培养过夜，挑取单克隆测序确定基因序列，得到连接HarmOR59全长编码序列的真核表达载体质粒HarmOR59-PT7Ts。

2.棉铃虫气味受体cRNA合成和异源表达

2.1将HarmOR59-PT7Ts质粒用限制性内切酶SmaI酶切，酶切产物通过酚/氯仿抽提进行纯化、浓缩，之后以纯化后的酶切产物为模板，用体外转录试剂盒(T7Kit，Ambion)合成HarmOR59的cRNA(SEQ ID No.7)，其包括依次从5’到3’的SEQ ID No.8，SEQ ID No.1和SEQID No.9。将cRNA纯化并定浓度至2000ng/μl，分装后放于-80℃冰箱备用。

2.2用上述同样的方法克隆共表达气味受体HarmORco(SEQ ID No.10，其对应编码的氨基酸序列的SEQ ID No.11)的DNA序列(SEQ ID No.10)。并合成HarmORco的cRNA(SEQID No.12)，其包括依次从5’到3’的SEQ ID No.8，SEQ ID No.10和SEQ ID No.9。将cRNA纯化并定浓度至2000ng/μl，分装后放于-80℃冰箱备用。连接到克隆载体上时使用的引物为：ORco-F(SEQ ID No.13)，ORco-R(SEQ ID No.14)，连接到表达载体上时使用的引物为(引物构成和HarmOR59的相同)：ORco-PT7Ts-F(SEQ ID No.15)，ORco-PT7Ts-R(SEQ ID No.16)。

2.3将HarmOR59和HarmORco的cRNA各1μl均匀混合(在昆虫中，特异的气味受体蛋白需要和非典型的共表达气味受体ORco共表达，形成二聚体才能发挥作用)，用显微注射仪将混合好的cRNA注射到非洲爪蟾的卵中，每颗卵的注射量为27.6nl，注射后的卵在16℃培养液中培养2-5天。

3.电压钳记录

3.1.分别将选定的14种植物挥发物用二甲基亚砜(DMSO)配制成1mol/L的母液，再用1×Ringer(9.6mM NaCl,0.2mM KCl,0.5mM MgCl₂-6H₂O,0.5mM HEPES,0.6mM CaCl₂,pH7.6)配制成终浓度为10^-4mol/L的灌流液；其中，14种植物挥发物依次为：反-2-己烯醇、肉桂醛、月桂烯、桃金娘烯醛、胡椒酮、苯甲酸甲酯、4-乙基苯乙酮、4-甲氧基苯甲醇、丁香酚、反-3-己烯醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸香叶酯。

3.2.利用双电极电压钳系统测定上述2.2表达HarmOR59的卵母细胞对上述14种植物挥发物的电流值，每种化合物测定4-8个细胞。结果表明，HarmOR59能被反-2-己烯醇和肉桂醛强烈激活，在10^-4M的浓度下，HarmOR59对反-2-己烯醇的反应平均值高达1800nA，对肉桂醛的反应平均值达700nA；其余有反应的化合物在10^-4M浓度下如下：苯乙酸甲酯(283nA)、4-乙基苯乙酮(310nA)、反-3-己烯醇(364nA)、正辛醇(367nA)。

3.3.反-2-己烯醇、肉桂醛等对表达HarmOR59的卵母细胞的EC₅₀

分别测定不同浓度下反-2-己烯醇、肉桂醛、苯乙酸甲酯、4-乙基苯乙酮、反-3-己烯醇、正辛醇激活受体的反应值，并绘制剂量-反应曲线，计算EC₅₀值。结果表明HarmOR59对这些化合物的EC₅₀值分别为：反-2-己烯醇(1.189e-003mol/L)、肉桂醛(1.716e-006mol/L)、苯乙酸甲酯(2.826e-004mol/L)、4-乙基苯乙酮(7.246e-005mol/L)、反-3-己烯醇(4.945e-005mol/L)、正辛醇(4.116e-004mol/L)。该受体对肉桂醛有最大的灵敏度。

综合3.3和3.4的结果，在较高浓度，反-2-己烯醇能够激活HarmOR59最大的反应；而在较低浓度下，肉桂醛能够激活该受体最大的反应。

因此，可以判定能够以反-2-己烯醇和肉桂醛等有反应的气味化合物作为主成分配制引诱混合物。

实施例2

引诱剂母液的配制：

吸取20μL反-2-己烯醇(tans-2-Hexon-1-ol)、10μL肉桂醛(Cinnamaldehyde)、9μL阿尔法蒎烯(α-Pinene)、4μL柠檬烯(Limonen)、8μL桉叶油醇(Eucalypol)，用正己烷(Hexane)作为溶剂，定容至终体积1mL，混合均匀。得到2v％反-2-己烯醇、1v％肉桂醛、0.9v％阿尔法蒎烯、0.4v％柠檬烯和0.8v％桉叶油醇的10倍引诱剂母液。制成后的引诱剂母液可以放入冰箱保存，保存温度为-22℃。使用时，将引诱剂母液用正己烷稀释10倍。

引诱剂的配制：

吸取500μL的引诱剂母液，加入正己烷至终体积为5mL，混合均匀。得到2v‰反-2-己烯醇、1v‰肉桂醛、0.9v‰阿尔法蒎烯、0.4v‰柠檬烯和0.8v‰桉叶油醇的引诱剂。

以溶剂正己烷作为阴性对照。

对比例1

以含有1v‰苯乙醛、1v‰水杨酸丁酯、1v‰大茴香醇、1.4v‰阿尔法蒎烯、0.4v‰柠檬烯和0.8v‰桉叶油醇，正己烷作为溶剂的混合物作为引诱剂。

以溶剂正己烷作为阴性对照。

实施例3

引诱实验

对引诱剂进行室内Y形管引诱试验。

地点：试验在中国农业科学院植物保护研究所实验室内进行。

时间：试验时间为晚上18:00至凌晨2:00。

室内条件：温度26～28℃，湿度30％～50％；为了防止光线对行为选择造成影响，使用红光作为光源。

仪器设备和设置：Y形管为玻璃材质，两侧臂A、B夹角60°，分别长20cm，直臂长25cm，三条臂直径均为4cm，两条侧臂开口处分别用中间插有胶管的橡胶塞塞住；气流被大气采样仪收集后，分别经过装有活性炭的玻璃干燥塔和装有纯净水的玻璃湿润塔，之后分流进入两臂，气流速度为1L/min。

行为学测定：

(1)吸取配制好的引诱剂(实施例1的引诱剂或对比例1的引诱剂)50μL滴加到边长1cm的方形滤纸片上，等待10秒钟待溶剂挥发后将纸片放入A臂，B臂放置滴有50μL正己烷的边长1cm的方形滤纸片作为阴性对照；

(2)羽化1～2天的棉铃虫雌、雄蛾单头放入直臂入口处，打开大气采样仪使气流进入，同时开始计时，统计10min内棉铃虫蛾分别在两臂的停留时间；

(3)每头棉铃虫蛾试验后更换Y形管和滤纸片，并更换A、B两臂的左右位置，在每组行为学试验中，雌、雄蛾使用的虫数分别为50头。

结果分析：

分别统计雌、雄蛾对不同引诱剂的选择倾向，去除不做选择的个体，计算选择各臂的虫体数占总选择虫体数的百分比。结果表明：实施例2的引诱剂对雌蛾的引诱率为61.2％，对雄蛾的引诱率为64.5％；而对比例1对雌蛾的引诱率为42.8％，对雄蛾的引诱率为38.4％。实施例2的引诱剂获得的对棉铃虫雌蛾的引诱效果高于对比例1的引诱剂对棉铃虫雌蛾的引诱效果18.4％；实施例2的引诱剂获得的对棉铃虫雄蛾的引诱效果高于对比例1的引诱剂对棉铃虫雄蛾的引诱效果26.1％，说明实施例2的引诱剂具有更优的引诱效果。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种氨基酸序列在识别气味化合物中的应用

<130> LHA1760772

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA/RNA

<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)

<400> 1

atgggcttcg tcagaaattt ctggaaaaaa ttgactcaca caaaggccct cgaccaatca 60

agtgggagat tggagacagt tttctttgag tctatctata ggattactta tgtggcaggt 120

atgtcgtcgt cagaccatga tatgttctac ttgatgtaca gtaatacagt caagttggcc 180

atagtgtttc tagtatgtgg agaaatatgg tacgggttca ccgaagcttc gggattggat 240

gaggtagctg cctctatcaa cgtcacggtc atacagtata ttgccatgta cagatttatg 300

aacatgatgt cacataagga cttttacaag aaattagcga cgtctatgga atccccttat 360

tttgatatta caacagaaga aagaaagaaa ctggtggact attggtggca gactaacgag 420

agatatttaa agcttttgct tgctttggga aactgcactc ttgccttctg gttcatcttc 480

cccctagtcg acgatgtgga ctacaacctc atagtgggga tccggctgcc tctaaactac 540

aaaaccccat tccgataccc tttagcatac atagtggtga tgatagcctt tttctatatc 600

tctcattttg tgatgatcac ggatctgaag atgcagacac atttactgca tctgctgtgc 660

cagtttacag tgctggtgga ttgcttccag aatttgttgc gagattgtcg gattgggttt 720

gaagatgtag cggaaaacaa cttagtttac gaaaaacgtt ttgcagacaa atacacaaag 780

cgacttggcg acctcgtgga acaacataaa cttattttga gcaacacaat gaatttgcgc 840

gacacgctaa gtagcccgat gttgggacag ctggttgcga gcggtatact catttgtttc 900

atcggttatc aggccactac gaccatagca gaaagccctt ttcaaggtct aatgagtgct 960

ttctttttgg gctacaatct ttttggtttc tatataattt gccgctgggg tgaggagata 1020

acaaatcaga gtgaaaagat aggagaagcc atatattgtt caggatggga atgtgggcta 1080

gccaaactac ctggagtacg gtccaccatc atgtacgtga tagcgagggc caacaaacct 1140

ctggtcctca ccgcgggagg gatgtacaac ctctcactca cctcttacac tagtttggtg 1200

aaaacatctt acagtgcgtt gaccgtattg cttcaatttc gacacgaata g 1251

<210> 2

<211> 416

<212> PRT

<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)

<400> 2

Met Gly Phe Val Arg Asn Phe Trp Lys Lys Leu Thr His Thr Lys Ala

1 5 10 15

Leu Asp Gln Ser Ser Gly Arg Leu Glu Thr Val Phe Phe Glu Ser Ile

20 25 30

Tyr Arg Ile Thr Tyr Val Ala Gly Met Ser Ser Ser Asp His Asp Met

35 40 45

Phe Tyr Leu Met Tyr Ser Asn Thr Val Lys Leu Ala Ile Val Phe Leu

50 55 60

Val Cys Gly Glu Ile Trp Tyr Gly Phe Thr Glu Ala Ser Gly Leu Asp

65 70 75 80

Glu Val Ala Ala Ser Ile Asn Val Thr Val Ile Gln Tyr Ile Ala Met

85 90 95

Tyr Arg Phe Met Asn Met Met Ser His Lys Asp Phe Tyr Lys Lys Leu

100 105 110

Ala Thr Ser Met Glu Ser Pro Tyr Phe Asp Ile Thr Thr Glu Glu Arg

115 120 125

Lys Lys Leu Val Asp Tyr Trp Trp Gln Thr Asn Glu Arg Tyr Leu Lys

130 135 140

Leu Leu Leu Ala Leu Gly Asn Cys Thr Leu Ala Phe Trp Phe Ile Phe

145 150 155 160

Pro Leu Val Asp Asp Val Asp Tyr Asn Leu Ile Val Gly Ile Arg Leu

165 170 175

Pro Leu Asn Tyr Lys Thr Pro Phe Arg Tyr Pro Leu Ala Tyr Ile Val

180 185 190

Val Met Ile Ala Phe Phe Tyr Ile Ser His Phe Val Met Ile Thr Asp

195 200 205

Leu Lys Met Gln Thr His Leu Leu His Leu Leu Cys Gln Phe Thr Val

210 215 220

Leu Val Asp Cys Phe Gln Asn Leu Leu Arg Asp Cys Arg Ile Gly Phe

225 230 235 240

Glu Asp Val Ala Glu Asn Asn Leu Val Tyr Glu Lys Arg Phe Ala Asp

245 250 255

Lys Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Asp Leu Val Glu Gln His Lys Leu Ile

260 265 270

Leu Ser Asn Thr Met Asn Leu Arg Asp Thr Leu Ser Ser Pro Met Leu

275 280 285

Gly Gln Leu Val Ala Ser Gly Ile Leu Ile Cys Phe Ile Gly Tyr Gln

290 295 300

Ala Thr Thr Thr Ile Ala Glu Ser Pro Phe Gln Gly Leu Met Ser Ala

305 310 315 320

Phe Phe Leu Gly Tyr Asn Leu Phe Gly Phe Tyr Ile Ile Cys Arg Trp

325 330 335

Gly Glu Glu Ile Thr Asn Gln Ser Glu Lys Ile Gly Glu Ala Ile Tyr

340 345 350

Cys Ser Gly Trp Glu Cys Gly Leu Ala Lys Leu Pro Gly Val Arg Ser

355 360 365

Thr Ile Met Tyr Val Ile Ala Arg Ala Asn Lys Pro Leu Val Leu Thr

370 375 380

Ala Gly Gly Met Tyr Asn Leu Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Ser Leu Val

385 390 395 400

Lys Thr Ser Tyr Ser Ala Leu Thr Val Leu Leu Gln Phe Arg His Glu

405 410 415

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 3

atgggcttcg tcagaaattt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 4

ctattcgtgt cgaaattgaa g 21

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 5

acgctcaact tggcagatct gccaccatgg gcttcgtcag aaattt 46

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

gatcctagtc agtcactagt ctattcgtgt cgaaattgaa g 41

<210> 7

<211> 1532

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

aagcttgctt gttctttttg cagaagctca gaaacgctca acttggcaga tctgccacca 60

tgggcttcgt cagaaatttc tggaaaaaat tgactcacac aaaggccctc gaccaatcaa 120

gtgggagatt ggagacagtt ttctttgagt ctatctatag gattacttat gtggcaggta 180

tgtcgtcgtc agaccatgat atgttctact tgatgtacag taatacagtc aagttggcca 240

tagtgtttct agtatgtgga gaaatatggt acgggttcac cgaagcttcg ggattggatg 300

aggtagctgc ctctatcaac gtcacggtca tacagtatat tgccatgtac agatttatga 360

acatgatgtc acataaggac ttttacaaga aattagcgac gtctatggaa tccccttatt 420

ttgatattac aacagaagaa agaaagaaac tggtggacta ttggtggcag actaacgaga 480

gatatttaaa gcttttgctt gctttgggaa actgcactct tgccttctgg ttcatcttcc 540

ccctagtcga cgatgtggac tacaacctca tagtggggat ccggctgcct ctaaactaca 600

aaaccccatt ccgataccct ttagcataca tagtggtgat gatagccttt ttctatatct 660

ctcattttgt gatgatcacg gatctgaaga tgcagacaca tttactgcat ctgctgtgcc 720

agtttacagt gctggtggat tgcttccaga atttgttgcg agattgtcgg attgggtttg 780

aagatgtagc ggaaaacaac ttagtttacg aaaaacgttt tgcagacaaa tacacaaagc 840

gacttggcga cctcgtggaa caacataaac ttattttgag caacacaatg aatttgcgcg 900

acacgctaag tagcccgatg ttgggacagc tggttgcgag cggtatactc atttgtttca 960

tcggttatca ggccactacg accatagcag aaagcccttt tcaaggtcta atgagtgctt 1020

tctttttggg ctacaatctt tttggtttct atataatttg ccgctggggt gaggagataa 1080

caaatcagag tgaaaagata ggagaagcca tatattgttc aggatgggaa tgtgggctag 1140

ccaaactacc tggagtacgg tccaccatca tgtacgtgat agcgagggcc aacaaacctc 1200

tggtcctcac cgcgggaggg atgtacaacc tctcactcac ctcttacact agtttggtga 1260

aaacatctta cagtgcgttg accgtattgc ttcaatttcg acacgaatag actagtgact 1320

gactaggatc tggttaccac taaaccagcc tcaagaacac ccgaatggag tctctaagct 1380

acataatacc aacttacact tacaaaatgt tgtcccccaa aatgtagcca ttcgtatctg 1440

ctcctaataa aaagaaagtt tcttcacatt ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aacccccccc cccccccccc cccccccccc cc 1532

<210> 8

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(non)

<400> 8

aagcttgctt gttctttttg cagaagctca gaaacgctca acttggcaga tctgccacc 59

<210> 9

<211> 222

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

actagtgact gactaggatc tggttaccac taaaccagcc tcaagaacac ccgaatggag 60

tctctaagct acataatacc aacttacact tacaaaatgt tgtcccccaa aatgtagcca 120

ttcgtatctg ctcctaataa aaagaaagtt tcttcacatt ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aacccccccc cccccccccc cccccccccc cc 222

<210> 10

<211> 1422

<212> DNA/RNA

<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)

<400> 10

atgatgacca aggtgaaggc ccagggcctc gtgtcagact tgatgcccaa catcaagctg 60

atgcagatgg ccggccattt cctcttcaat taccactcag aaaatgctgg catgtcaaac 120

cttctccgta agatctacgc gagtactcat gctatcctca ttttcatcca ctacgcgtgt 180

atgggaatca acatggcgaa atactccgat gaggtcaacg agctgacagc caataccata 240

actgtcttat tcttcgccca tactatcatc aagcttgcgt tctttgcttt aaactctaag 300

agcttctaca ggaccctggc agtatggaac cagtcgaaca gtcacccact gttcacggag 360

tcagacgctc gctatcacca gatcgcgctc accaagatga ggaggctgct gtacttcatc 420

tgcgggatga ctgtcctctc tgttatcagc tgggtaaccc taacattctt cggtgagtca 480

gtacgcatgg tgacgaacaa ggaaaccaac gagaccctga cggaggtggt gccccgcctg 540

cctctgaagg cctggtaccc ttttaatgct atgagcggca ctatgtatat cgtggcgttc 600

gcttttcagg tatactggct cctattctca atggccatag cgaacctgat ggacgtgatg 660

ttctgttcct ggctgatctt cgcgtgtgaa cagctgcagc atttgaaggc tatcatgaaa 720

cccctcatgg agttgagcgc ctctttggac acgtaccggc ctaatactgc tgagctgttt 780

agagcttctt ctactgagaa atccgaaaag atccccgaca cggtagacat ggacattcgc 840

ggcatatact ccacacagca agacttcggc atgacactcc gaggtgctgg tgggagactc 900

cagaacttcg gccagcagaa ccccaaccct aacggcttga ctcccaagca ggagatgctg 960

gccaggtctg ctatcaagta ctgggtggag aggcataagc atgtcgtcag actagtggca 1020

tcgattggag acacgtatgg taccgccctg ctgttccaca tgttggtgtc tacgatcaca 1080

ctcaccctgc tggcctacca agctactaag atcaacggaa tcaacgtgta tgctttcagt 1140

acgatcggat acttgagtta cactctgggt caagtgttcc acttctgcat ctttggaaat 1200

aggctcattg aagagagctc atcagtaatg gaagcagctt actcctgcca gtggtatgac 1260

ggctccgagg aagcgaagac attcgtgcaa atcgtctgcc aacagtgtca gaaggctatg 1320

agcatctccg gagccaagtt cttcacggtc tcacttgatt tgtttgcttc ggtccttgga 1380

gccgtggtaa cctacttcat ggtattgata cagctcaagt ga 1422

<210> 11

<211> 473

<212> PRT

<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)

<400> 11

Met Met Thr Lys Val Lys Ala Gln Gly Leu Val Ser Asp Leu Met Pro

1 5 10 15

Asn Ile Lys Leu Met Gln Met Ala Gly His Phe Leu Phe Asn Tyr His

20 25 30

Ser Glu Asn Ala Gly Met Ser Asn Leu Leu Arg Lys Ile Tyr Ala Ser

35 40 45

Thr His Ala Ile Leu Ile Phe Ile His Tyr Ala Cys Met Gly Ile Asn

50 55 60

Met Ala Lys Tyr Ser Asp Glu Val Asn Glu Leu Thr Ala Asn Thr Ile

65 70 75 80

Thr Val Leu Phe Phe Ala His Thr Ile Ile Lys Leu Ala Phe Phe Ala

85 90 95

Leu Asn Ser Lys Ser Phe Tyr Arg Thr Leu Ala Val Trp Asn Gln Ser

100 105 110

Asn Ser His Pro Leu Phe Thr Glu Ser Asp Ala Arg Tyr His Gln Ile

115 120 125

Ala Leu Thr Lys Met Arg Arg Leu Leu Tyr Phe Ile Cys Gly Met Thr

130 135 140

Val Leu Ser Val Ile Ser Trp Val Thr Leu Thr Phe Phe Gly Glu Ser

145 150 155 160

Val Arg Met Val Thr Asn Lys Glu Thr Asn Glu Thr Leu Thr Glu Val

165 170 175

Val Pro Arg Leu Pro Leu Lys Ala Trp Tyr Pro Phe Asn Ala Met Ser

180 185 190

Gly Thr Met Tyr Ile Val Ala Phe Ala Phe Gln Val Tyr Trp Leu Leu

195 200 205

Phe Ser Met Ala Ile Ala Asn Leu Met Asp Val Met Phe Cys Ser Trp

210 215 220

Leu Ile Phe Ala Cys Glu Gln Leu Gln His Leu Lys Ala Ile Met Lys

225 230 235 240

Pro Leu Met Glu Leu Ser Ala Ser Leu Asp Thr Tyr Arg Pro Asn Thr

245 250 255

Ala Glu Leu Phe Arg Ala Ser Ser Thr Glu Lys Ser Glu Lys Ile Pro

260 265 270

Asp Thr Val Asp Met Asp Ile Arg Gly Ile Tyr Ser Thr Gln Gln Asp

275 280 285

Phe Gly Met Thr Leu Arg Gly Ala Gly Gly Arg Leu Gln Asn Phe Gly

290 295 300

Gln Gln Asn Pro Asn Pro Asn Gly Leu Thr Pro Lys Gln Glu Met Leu

305 310 315 320

Ala Arg Ser Ala Ile Lys Tyr Trp Val Glu Arg His Lys His Val Val

325 330 335

Arg Leu Val Ala Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Leu Phe

340 345 350

His Met Leu Val Ser Thr Ile Thr Leu Thr Leu Leu Ala Tyr Gln Ala

355 360 365

Thr Lys Ile Asn Gly Ile Asn Val Tyr Ala Phe Ser Thr Ile Gly Tyr

370 375 380

Leu Ser Tyr Thr Leu Gly Gln Val Phe His Phe Cys Ile Phe Gly Asn

385 390 395 400

Arg Leu Ile Glu Glu Ser Ser Ser Val Met Glu Ala Ala Tyr Ser Cys

405 410 415

Gln Trp Tyr Asp Gly Ser Glu Glu Ala Lys Thr Phe Val Gln Ile Val

420 425 430

Cys Gln Gln Cys Gln Lys Ala Met Ser Ile Ser Gly Ala Lys Phe Phe

435 440 445

Thr Val Ser Leu Asp Leu Phe Ala Ser Val Leu Gly Ala Val Val Thr

450 455 460

Tyr Phe Met Val Leu Ile Gln Leu Lys

465 470

<210> 12

<211> 1703

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(non)

<400> 12

aagcttgctt gttctttttg cagaagctca gaaacgctca acttggcaga tctgccacca 60

tgatgaccaa ggtgaaggcc cagggcctcg tgtcagactt gatgcccaac atcaagctga 120

tgcagatggc cggccatttc ctcttcaatt accactcaga aaatgctggc atgtcaaacc 180

ttctccgtaa gatctacgcg agtactcatg ctatcctcat tttcatccac tacgcgtgta 240

tgggaatcaa catggcgaaa tactccgatg aggtcaacga gctgacagcc aataccataa 300

ctgtcttatt cttcgcccat actatcatca agcttgcgtt ctttgcttta aactctaaga 360

gcttctacag gaccctggca gtatggaacc agtcgaacag tcacccactg ttcacggagt 420

cagacgctcg ctatcaccag atcgcgctca ccaagatgag gaggctgctg tacttcatct 480

gcgggatgac tgtcctctct gttatcagct gggtaaccct aacattcttc ggtgagtcag 540

tacgcatggt gacgaacaag gaaaccaacg agaccctgac ggaggtggtg ccccgcctgc 600

ctctgaaggc ctggtaccct tttaatgcta tgagcggcac tatgtatatc gtggcgttcg 660

cttttcaggt atactggctc ctattctcaa tggccatagc gaacctgatg gacgtgatgt 720

tctgttcctg gctgatcttc gcgtgtgaac agctgcagca tttgaaggct atcatgaaac 780

ccctcatgga gttgagcgcc tctttggaca cgtaccggcc taatactgct gagctgttta 840

gagcttcttc tactgagaaa tccgaaaaga tccccgacac ggtagacatg gacattcgcg 900

gcatatactc cacacagcaa gacttcggca tgacactccg aggtgctggt gggagactcc 960

agaacttcgg ccagcagaac cccaacccta acggcttgac tcccaagcag gagatgctgg 1020

ccaggtctgc tatcaagtac tgggtggaga ggcataagca tgtcgtcaga ctagtggcat 1080

cgattggaga cacgtatggt accgccctgc tgttccacat gttggtgtct acgatcacac 1140

tcaccctgct ggcctaccaa gctactaaga tcaacggaat caacgtgtat gctttcagta 1200

cgatcggata cttgagttac actctgggtc aagtgttcca cttctgcatc tttggaaata 1260

ggctcattga agagagctca tcagtaatgg aagcagctta ctcctgccag tggtatgacg 1320

gctccgagga agcgaagaca ttcgtgcaaa tcgtctgcca acagtgtcag aaggctatga 1380

gcatctccgg agccaagttc ttcacggtct cacttgattt gtttgcttcg gtccttggag 1440

ccgtggtaac ctacttcatg gtattgatac agctcaagtg aactagtgac tgactaggat 1500

ctggttacca ctaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga gtctctaagc tacataatac 1560

caacttacac ttacaaaatg ttgtccccca aaatgtagcc attcgtatct gctcctaata 1620

aaaagaaagt ttcttcacat tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaccccccc 1680

cccccccccc cccccccccc ccc 1703

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 13

atgatgacca aggtgaaggc c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 14

ttacttgagc tgtatcaata cc 22

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 15

acgctcaact tggcagatct gccaccatga tgaccaaggt gaaggcc 47

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 16

gatcctagtc agtcactagt ttacttgagc tgtatcaata cc 42

Claims (10)

1.如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列在识别气味化合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述气味化合物为反-2-己烯醇、肉桂醛、苯乙酸甲酯、4-乙基苯乙酮、反-3-己烯醇和正辛醇中的至少一种。

3.能够编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列在识别气味化合物中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述气味化合物为反-2-己烯醇、肉桂醛、苯乙酸甲酯、4-乙基苯乙酮、反-3-己烯醇和正辛醇中的至少一种。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

6.一种鉴别气味化合物的方法，其包括如下步骤：

1)将第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在细胞或昆虫的触角中进行共表达，得到表达有气味受体二聚体的细胞或昆虫的触角；其中，第一氨基酸序列包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，第二氨基酸序列包括如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；

2)通过测定所述细胞或昆虫的触角在用气味化合物刺激前后的细胞膜电位或神经元放电频率变化来判断所述气味化合物是否能够激活所述气味受体二聚体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞为非洲爪蟾的卵母细胞；

优选地，在步骤1)中具体包括向非洲爪蟾的卵中导入第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，之后培养所述非洲爪蟾的卵，得到表达有气味受体二聚体的非洲爪蟾卵母细胞；其中，所述第一核苷酸序列包括依次从5’到3’的第一核苷酸非编码序列，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列和第二核苷酸非编码序列；第二核苷酸序列包括依次从5’到3’的第三核苷酸非编码序列，编码SEQ ID No.11所示的氨基酸序列的核苷酸序列和第四核苷酸非编码序列；

优选地，第一核苷酸非编码序列和第三核苷酸非编码序列独立地为SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

优选地，第二核苷酸非编码序列和第四核苷酸非编码序列独立地为SEQ ID No.9。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列的质量比为0.8-1.2:1。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将气味化合物溶于1×Ringer，得到气味化合物灌流液，将所述气味化合物灌流液加入到灌流管中，利用双电极电压钳系统测定所述表达有气味受体二聚体的非洲爪蟾卵母细胞经所述气味化合物灌流液刺激前后的电流值，根据经所述气味化合物灌流液刺激前后得到的电流值的差值判断所述气味化合物是否能够激活所述气味受体二聚体。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中，1×Ringer的pH值为7.4-7.8，其包括如下组分：

9.5-9.7mM NaCl,0.15-0.25mM KCl,0.4-0.6mM MgCl₂-6H₂O,0.4-0.6mM HEPES,0.5-0.7mM CaCl₂。