CN109956859B - 一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物分离提纯领域，具体涉及一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法，主要包括以下步骤：乳酸发酵液热处理，去除菌体等不溶性杂质；酸处理；浓缩；有机试剂沉淀；离心过滤；浓缩；脱色；硅胶层析柱；ODS柱；浓缩得成品。本发明方法得到乳酸成品，测得其纯度在93％以上，乳酸回收率在67％以上，制备过程中减少了主要成分的流失、节省了材料、减少了废液的排放，同时还缩短了处理时间。

Description

一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物分离提纯领域，具体涉及一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法。

背景技术

广泛用于食品加工和医疗行业的L-乳酸通常通过发酵制造。在过去十年中，由于其实际需求的增加，潜在的生产力越来越受到重视。乳酸(2-羟基丙酸)是一种天然存在的羟基羧酸，首先由瑞典化学家Scheele于1780年由酸奶精制而成。随后，由于其作为酸味剂、增味剂和防腐剂等多种用途，乳酸在食品、医药、化妆品和其他化学工业占据重要地位。此外，L-乳酸可以用作生产聚乳酸(PLA)的原料，而PLA是医疗应用中存在的聚合物和环境友好的生物可降解塑料，它可以代替来源于石油资源的合成塑料，因而乳酸的生产受到了极大的关注，具有广泛的应用前景。

乳酸可以通过化学合成或微生物发酵的生物技术来进行商业化生产。最常见的合成乳酸的方法是通过乳腈的水解方法。然而，化学合成法常会伴有D-乳酸的产生，难以合成高光学纯度的L-乳酸；另一方面，通过微生物发酵法可以获得光学纯的L-乳酸，且该方法原料成本低，生产工艺简单，效率高。因而，目前微生物发酵已经成为乳酸生产的主要方法，其中发酵菌种主要为乳酸菌。

由于L-乳酸的高粘度性和热敏感性，从发酵液中提取高纯度的L-乳酸存在一定的困难。近年来对乳酸的分离提取工艺已有大量研究，报道的分离方法主要有乳酸钙结晶、有机溶剂萃取、直接蒸馏、电渗析、离子交换、膜分离等。

目前我国工业上普遍的提纯工艺是碱化结晶-酸解，其大致过程包括：将微生物发酵液加热，加入氢氧化钙进行碱化处理，使乳酸转化为乳酸钙；过滤除去菌体、蛋白质等胶体杂质；得到的乳酸钙醪液经浓缩结晶，离心过滤除去母液，得到乳酸钙晶体；加热复溶后，用硫酸进行酸解，加入适量活性炭脱色，分离去除硫酸钙和活性炭残渣，得到粗乳酸溶液；将粗乳酸溶液分别通过阴、阳离子交换树脂，去除其中的杂质离子；所得溶液再经浓缩至80％以上，即得乳酸成品。

该工艺流程具有设备要求简单、成本低等特点，但存在一定的不足，如工艺中将乳酸转换为乳酸钙，但由于发酵液糖类、蛋白质和色素等杂质的影响，使乳酸钙结晶率不高，因而需要多次结晶，不但影响其纯度，且增大了时间成本；工艺中用到阴、阳离子交换树脂，在活化与再生树脂过程中，需耗费大量的酸、碱和时间，同时会产生大量废液，提高了处理废料的成本。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸菌的方法，所述方法可在保证乳酸成品的提取率及纯度的前提下，减少提纯的时间和废料的产生。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法，主要包括以下步骤：

(1)将乳酸发酵液热处理，去除菌体等不溶性杂质；

(2)将(1)中处理液进行酸处理；浓缩；加入有机试剂进行沉淀；离心过滤；

(3)将(2)所得滤液浓缩；

(4)将(3)所得浓缩液进行脱色；

(5)将(4)所得处理液过硅胶层析柱；

(6)将(5)所得处理液过ODS柱；

(7)将(6)所得处理液浓缩得成品。

进一步的，所述从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法，包括以下步骤：

(1)将乳酸发酵液加热，恒温搅拌，离心过滤，得滤液1；

(2)向滤液1中加入强酸，如硫酸、盐酸等，调节pH至1.0，70℃旋蒸浓缩至稠膏状，向浓缩液中添加有机试剂(如乙醇等)，混匀，4℃静置，离心过滤，得滤液2；

(3)将滤液2浓缩，得浓缩液3；

(4)对浓缩液3进行脱色(脱色剂可选用活性炭等物质)，然后过滤得滤液4；

(5)将滤液4浓缩至稠膏状，过硅胶层析柱，用洗脱剂(如有机试剂)洗脱，得洗脱馏分5；

(6)将洗脱馏分5中的洗脱剂除去(如挥发除去有机试剂)，过ODS柱，以纯水冲洗，得馏分6；

(7)将馏分6浓缩至水份挥干，得到乳酸成品，测得其纯度在93％以上，乳酸回收率在67％以上。

进一步的，所述步骤(1)或步骤(2)中的离心操作，其转速为8000～12000g，例如可以是8000g、8500g、9000g、9500g、10000g、10500g、11000g、12000g，优选为9000g；所述离心时间为10～30min，例如可以是10min、12min、15min、18min、20min、23min、25min、30min，优选为10～20min，进一步优选为15min；其中步骤(1)和步骤(2)的离心条件可以相同，也可以不相同，分别在上述范围内任选即可。

进一步的，所述方法中的过滤操作，过滤方式均为真空抽滤，滤膜规格为0.45μm。

进一步的，所述步骤(1)中加热温度为60℃～90℃，例如可以为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，优选为90℃。

进一步的，所述步骤(1)中搅拌时间为5～10min，例如可以为5min、6min、7min、8min、9min、10min，优选为8min。

进一步的，步骤(2)中所述的强酸浓度为40％～98％，例如可以为40％、41％、42％、45％、48％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、98％，优选为45％～60％，进一步优选为50％。

进一步的，所述步骤(2)中有机试剂的终浓度为50％～90％，例如可以为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选为75％。

进一步的，所述步骤(2)中静置时间为4～10h，例如可以为优选为6h、7h、8h、9h、10h，优选为6h。

进一步的，步骤(3)所述的浓缩液3终密度为1.05～1.20g/mL，例如可以为1.05g/mL、1.10g/mL、1.15g/mL、1.20g/mL，优选为1.08g/mL。

进一步的，所述步骤(4)中脱色剂与浓缩液3的质量比为0.3:100～1.0:100，例如可以为0.3:100、0.4:100、0.5:100、0.6:100、0.7:100、0.8:100、0.9:100、1.0:100，优选为0.5:100。

进一步的，所述步骤(4)中脱色温度为75～80℃，例如可以为75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃，优选为80℃。

进一步的，所述步骤(4)中脱色时间为30～60min，例如可以为30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min，优选为50min。

进一步的，所述步骤(5)中过硅胶层析柱时，硅胶柱上样前，将硅胶G与浓缩液按质量比为1:2混匀，然后上柱。

进一步的，所述步骤(5)中硅胶柱径高比为1:5～1:25，例如可以为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:14、1:16、1:20、1:22、1:25，进一步优选为1:10。

进一步的，所述步骤(5)中硅胶G规格为100～200目。

进一步的，所述步骤(5)中有机试剂为甲醇/二氯甲烷体系，洗脱方式为梯度浓度洗脱。

本发明有益效果：

(1)向发酵液中添加硫酸等强酸，使乳酸根离子全部以乳酸的形式存在，免去了因多次乳酸钙结晶过程造成的损失；

(2)用有机试剂进行沉淀，脂溶性糖类、蛋白、色素等杂质被沉淀下来并离心去除，同时可降低料液的粘度，为后续分离提纯提供有力条件；另外该有机试剂可重复利用，从而减少了废液的排放，降低了提取成本；

(3)不使用阴、阳离子交换树脂，从而避免耗费大量的酸和碱去活化和再生树脂，以及样品后续处理所耗费的时间；

(4)通过硅胶柱层析和ODS柱，可充分去除料液中的糖类、蛋白等杂质。

本发明方法可适用于所有能产生乳酸的菌株发酵所形成的的发酵液，使最终乳酸成品纯度高达93％以上，乳酸回收率高于67％。

附图说明

图1为本发明分离提纯方法的流程图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

试验材料

本实施方式以清酒乳杆菌的发酵液为例阐述本发明的具体技术方案，但并不表示本发明提供的分离提纯乳酸的方法只能用于清酒乳杆菌的发酵液。本发明提供的分离提纯乳酸的方法可适用于所有能产生乳酸的菌株发酵所形成的发酵液。

本发明所用菌株：清酒乳杆菌，来源于市售。

乳酸菌发酵培养基：

(1)MRS琼脂培养基：

蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、乙酸钠5.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、琼脂14.0g，蒸馏水溶解定容至1000mL，调pH值至6.4±0.2，搅拌至完全溶解后，于115℃、0.1Mpa下灭菌20min。

(2)MRS肉汤：

蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、碳酸钙5.0g、乙酸钠5.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g，蒸馏水溶解定容至1000mL，调pH值至5.7±0.2，搅拌至完全溶解后，于115℃、0.1Mpa下灭菌20min。

本发明方法的主要流程包括：

乳酸发酵液→热处理→去除菌体等不溶性杂质→酸处理→浓缩→有机试剂沉淀→离心过滤→浓缩→脱色→硅胶层析柱→ODS柱→浓缩得成品。

实施例1

上述乳酸发酵液的制备，步骤如下：

①活化菌株：将上述清酒乳杆菌保菌管从-80℃低温冰箱中取出，以无菌接种环挑单菌于MRS平板上划线，30℃培养箱中培养18h；

②挑单菌于MRS肉汤，30℃静置培养12h；

③按2％的接种量将乳酸菌接种至1L的MRS肉汤中，30℃静置培养36h；

④检测乳酸：L-乳酸，浓度为56.50mg/mL，总质量为56.50g。

乳酸发酵液中乳酸的分离提纯，步骤如下：

(1)热处理并去除菌体等不溶性杂质：

将发酵液加热至70℃，恒温搅拌9min后离心(转速为8000g，时间为25min)除去菌体、残余碳酸钙等不溶杂质，取上清过滤，得滤液1；

(2)有机试剂沉淀去除脂溶性杂质：

①向滤液1中加入98％的硫酸至pH为1.0，使滤液1中的乳酸钙全部转化成乳酸，70℃旋蒸浓缩至稠膏状，向浓缩液中添加乙醇(终浓度为90％)，混匀，4℃静置6h，离心(转速为8000g，时间为25min)过滤，除去料液中的脂溶性糖类、蛋白、色素等杂质，且降低料液的粘度，得滤液2；

②将滤液2浓缩至终密度为1.20g/mL，得浓缩液3，收集挥出的有机试剂，以备后续提取进行重复利用；

(3)脱色：

将浓缩液加热至75℃，加入活性炭，其中活性炭与浓缩液3的质量比为0.3:100，恒温搅拌45min，后过滤得滤液4；

(4)过硅胶层析柱去除极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取100～200目硅胶G，加入等体积的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，使柱径高比为1:8；

②将滤液4浓缩至稠膏状，与硅胶G混合均匀(质量比为2:1)后上样，上样量为柱体积的5％，加入二氯甲烷至液面高出上样硅胶上层约2cm，于硅胶上层塞一小团脱脂棉；

③以梯度浓度的体积比为1:30的甲醇/二氯甲烷(体积比为1:50～50:1)洗脱层析柱，流速为5mL/min，每50mL收一馏分；

④检测乳酸：对上述洗脱馏分进行乳酸检测，将可检测到乳酸的洗脱馏分记作馏分5；

(5)过ODS柱去除非极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取填料C18 50g(型号为40～60μm)，加入等体积的甲醇，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，以3倍柱体积的甲醇冲洗柱子，后用三倍柱体积的蒸馏水平衡ODS柱；

②上样：将馏分5挥去有机试剂后上样，上样量为柱体积的3％，于填料上方塞一小团脱脂棉，以3倍柱体积的蒸馏水冲洗，流速为5mL/min，收集馏分，记作馏分6；

(6)浓缩得成品：将馏分6浓缩至水份挥干，得到乳酸成品，测得乳酸纯度为93.1％，提取得率为67.3％。

实施例2

上述乳酸发酵液的制备，与实施例1相同。

乳酸发酵液中乳酸的分离提纯步骤，如下：

(1)热处理并去除菌体等不溶性杂质：

将发酵液加热至90℃，恒温搅拌8min后离心(转速为9000g，时间为15min)除去菌体、残余碳酸钙等不溶杂质，取上清过滤，得滤液1；

(2)有机试剂沉淀去除脂溶性杂质：

①向滤液1中加入50％的硫酸至pH为1.0，使滤液1中的乳酸钙全部转化成乳酸，70℃旋蒸浓缩至稠膏状，向浓缩液中添加乙醇(终浓度为75％)，混匀，4℃静置4h，离心(转速为11000g，时间为12min)过滤，除去料液中的脂溶性糖类、蛋白、色素等杂质，且降低料液的粘度，得滤液2；

②将滤液2浓缩至终密度为1.05g/mL，得浓缩液3，回收洗脱剂，以备后续提取进行重复利用；

(3)脱色：

将浓缩液加热至80℃，加入活性炭，其中活性炭与浓缩液3的质量比为0.5:100，恒温搅拌50min，后过滤得滤液4；

(4)过硅胶层析柱去除极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取100～200目硅胶G，加入等体积的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，使柱径高比为1:10；

②将滤液4浓缩至稠膏状，与硅胶G混合均匀(质量比为2:1)后上样，上样量为柱体积的5％，加入二氯甲烷至液面高出上样硅胶上层约2cm，于硅胶上层塞一小团脱脂棉；

③以梯度浓度的体积比为1:50的甲醇/二氯甲烷(体积比为1:50～50:1)洗脱层析柱，流速为5mL/min，每50mL收一馏分；

④检测乳酸：对上述洗脱馏分进行乳酸检测，将可检测到乳酸的洗脱馏分记作馏分5；

(5)过ODS柱去除非极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取填料C18 50g(型号为40～60μm)，加入等体积的甲醇，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，以3倍柱体积的甲醇冲洗柱子，后用三倍柱体积的蒸馏水平衡ODS柱；

②上样：将馏分5挥去有机试剂后上样，上样量为柱体积的3％，于填料上方塞一小团脱脂棉，以3倍柱体积的蒸馏水冲洗，流速为5mL/min，收集馏分，记作馏分6；

(6)浓缩得成品：将馏分6浓缩至水份挥干，得到乳酸成品，测得乳酸纯度为94.1％，提取得率为68.3％。

实施例3

上述乳酸发酵液的制备，与实施例1相同。

乳酸发酵液中乳酸的分离提纯步骤，如下：

(1)热处理并去除菌体等不溶性杂质：

将发酵液加热至85℃，恒温搅拌5min后离心(转速为10000g，时间为10min)除去菌体、残余碳酸钙等不溶杂质，取上清过滤，得滤液1；

(2)有机试剂沉淀去除脂溶性杂质：

①向滤液1中加入60％的硫酸至pH为1.0，使滤液1中的乳酸钙全部转化成乳酸，70℃旋蒸浓缩至稠膏状，向浓缩液中添加乙醇(终浓度为60％)，混匀，4℃静置8h，离心(转速为10000g，时间为10min)过滤，除去料液中的脂溶性糖类、蛋白、色素等杂质，且降低料液的粘度，得滤液2；

②将滤液2浓缩至终密度为1.10g/mL，得浓缩液3，收集挥出的有机试剂，以备后续提取进行重复利用；

(3)脱色：

将浓缩液加热至78℃，加入活性炭，其中活性炭与浓缩液3的质量比为1:100，恒温搅拌30min，后过滤得滤液4；

(4)过硅胶层析柱去除极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取100～200目硅胶G，加入等体积的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，使柱径高比为1:5；

②将滤液4浓缩至稠膏状，与硅胶G混合均匀(质量比为2:1)后上样，上样量为柱体积的5％，加入二氯甲烷至液面高出上样硅胶上层约2cm，于硅胶上层塞一小团脱脂棉；

③以梯度浓度的体积比为50:1的甲醇/二氯甲烷(体积比为1:50～50:1)洗脱层析柱，流速为5mL/min，每50mL收一馏分；

④检测乳酸：对上述洗脱馏分进行乳酸检测，将可检测到乳酸的洗脱馏分记作馏分5；

(5)ODS柱去除非极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取填料C18 50g(型号为40～60μm)，加入等体积的甲醇，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，以3倍柱体积的甲醇冲洗柱子，后用三倍柱体积的蒸馏水平衡ODS柱；

②上样：将馏分5挥去有机试剂后上样，上样量为柱体积的3％，于填料上方塞一小团脱脂棉，以3倍柱体积的蒸馏水冲洗，流速为5mL/min，收集馏分，记作馏分6；

(6)浓缩得成品：将馏分6浓缩至水份挥干，得到乳酸成品，测得乳酸纯度为93.9％，提取得率为67.6％。

实施例4

上述乳酸发酵液的制备，与实施例1相同。

乳酸发酵液中乳酸的分离提纯步骤，如下：

(1)热处理并去除菌体等不溶性杂质：

将发酵液加热至60℃，恒温搅拌10min后离心(转速为12000g，时间为30min)除去菌体、残余碳酸钙等不溶杂质，取上清过滤，得滤液1；

(2)有机试剂沉淀去除脂溶性杂质：

①向滤液1中加入40％的硫酸至pH为1.0，使滤液1中的乳酸钙全部转化成乳酸，70℃旋蒸浓缩至稠膏状，向浓缩液中添加乙醇(终浓度为50％)，混匀，4℃静置10h，离心(转速为10500g，时间为23min)过滤，除去料液中的脂溶性糖类、蛋白、色素等杂质，且降低料液的粘度，得滤液2；

②将滤液2浓缩至终密度为1.08g/mL，得浓缩液3，收集挥出的有机试剂，以备后续提取进行重复利用；

(3)脱色：

将浓缩液加热至76℃，加入活性炭，其中活性炭与浓缩液3的质量比为0.8:100，恒温搅拌60min，后过滤得滤液4；

(4)硅胶层析柱去除极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取100～200目硅胶G，加入等体积的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，使柱径高比为1:25；

②将滤液4浓缩至稠膏状，与硅胶G混合均匀(质量比为2:1)后上样，上样量为柱体积的5％，加入二氯甲烷至液面高出上洋硅胶上层约2cm，于硅胶上层塞一小团脱脂棉；

③以梯度浓度的体积比为50:1的甲醇/二氯甲烷(体积比为1:50～50:1)洗脱层析柱，流速为5mL/min，每50mL收一馏分；

④检测乳酸：对上述洗脱馏分进行乳酸检测，将可检测到乳酸的洗脱馏分记作馏分5；

(5)ODS柱去除非极性糖类、蛋白等杂质：

①装柱：称取填料C18 50g(型号为40～60μm)，加入等体积的甲醇，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后装柱，以3倍柱体积的甲醇冲洗柱子，后用三倍柱体积的蒸馏水平衡ODS柱；

②上样：将馏分5挥去有机试剂后上样(上样量为柱体积的3％)，于填料上方塞一小团脱脂棉，以3倍柱体积的蒸馏水冲洗，流速为5mL/min，收集馏分，记作馏分6；

(6)浓缩得成品：将馏分6浓缩至水份挥干，得到乳酸成品，测得乳酸纯度为93.6％，提取得率为68.5％。

本实施方式中所采用的个具体试剂、参数及操作方式均为例举，本发明方法并不局限于这些具体试剂、参数及操作方式，还可选择与本实施方式所选择的试剂、参数及操作方式实现同样功能的其他试剂、参数及操作方式替代。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种从乳酸发酵液中分离提纯乳酸的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)将乳酸发酵液热处理，去除不溶性杂质；

(2)将(1)中处理液进行酸处理；然后浓缩；再加入有机试剂进行沉淀；然后离心过滤；所述有机试剂为乙醇；

(3)将(2)所得滤液浓缩；

(4)将(3)所得浓缩液进行脱色；

(5)将(4)所得处理液过硅胶层析柱；

(6)将(5)所得处理液过ODS柱；

(7)将(6)所得处理液浓缩得成品。

2.根据权利要求1所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述从乳酸发酵液中分离提纯乳酸菌的方法，包括以下步骤：

(1)将乳酸发酵液加热，恒温搅拌，离心过滤，得滤液1；

(2)向滤液1中加入强酸调节pH至1.0，旋蒸浓缩至稠膏状，向浓缩液中添加有机试剂，混匀，静置，离心过滤，得滤液2；

(3)将滤液2浓缩，得浓缩液3；

(4)用脱色剂对浓缩液3进行脱色，然后过滤得滤液4；

(5)将滤液4浓缩至稠膏状，过硅胶层析柱，用洗脱剂洗脱，得洗脱馏分5；

(6)将洗脱馏分5中的洗脱剂除去，过ODS柱，冲洗，得馏分6；

(7)将馏分6浓缩，得到乳酸成品。

3.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中离心转速为8000～12000g，离心时间为10～30min；所述步骤(2)中离心转速为8000～12000g，离心时间为10～30min。

4.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述过滤方式为真空抽滤，滤膜规格为0.45μm。

5.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加热温度为60℃～90℃，搅拌时间为5～10min。

6.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的强酸浓度为40％～98％；有机试剂的终浓度为50％～90％；静置时间为4～10h。

7.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述的浓缩液3终密度为1.05～1.20g/mL。

8.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述步骤(4)中脱色剂与浓缩液3的质量比为0.3:100～1.0:100，脱色温度为75～80℃，脱色时间为30～60min。

9.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述步骤(5)中过硅胶层析柱时，所述硅胶柱径高比为1:5～1:25；硅胶柱上样前，将硅胶G与浓缩液按质量比为1:2混匀，然后上柱。

10.根据权利要求2所述的分离提纯乳酸的方法，其特征在于，所述步骤(5)中洗脱剂为甲醇/二氯甲烷体系，洗脱方式为梯度浓度洗脱。

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