CN109952304B - 一类抑制并降解cdk的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类抑制并降解CDK的化合物，具体地，本发明提供了一种如下式I所示的化合物；其中，各基团的定义如说明书中所述。本发明的化合物具有很好的周期蛋白依赖性激酶CDK抑制活性，可以用于制备治疗CDK活性相关的疾病的药物。

Description

一类抑制并降解CDK的化合物
技术领域
本发明属于医药领域，具体地涉及一类抑制并降解周期蛋白依赖性激酶CDK的化合物及其制备和应用。本发明化合物可用于治疗细胞增殖疾病，例如癌症。
背景技术
周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一类丝氨酸(Ser)/苏氨酸(T11r)激酶，作为细胞内重要的信号转导分子，和周期素(cyclin)形成的CDK.cyclin复合物，参与细胞的生长、增殖、休眠或者进入凋亡。CDK家族包括1-13，cyclin分为A-L，不同的CDK分别联接不同的cyclin。
CDK特异性的激活与一些肿瘤的增殖密切相关，大约80％的人类肿瘤中存在CDK通路的异常。已报到的多个处于临床研究中的CDK抑制剂针对的适应症包括乳腺癌、卵巢上皮癌、脂肪肉瘤、非小细胞肺癌肺癌、肝癌、套细胞淋巴癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、头颈部癌等肿瘤。
CDK抑制剂还能够用于治疗各种自身免疫系统疾病。例如，类风湿性关节炎的特征是滑膜组织增生，CDK抑制剂P16蛋白能抑制滑膜成纤维细胞(Taniguchi k.et al.，NatMed.1999，5：760-767)。CDK抑制剂可有效对抗其它细胞增殖障碍，包括以角质形成细胞过度增殖为特征的银屑病、狼疮。
因此，本领域技术人员致力于开发能够抑制周期蛋白依赖性激酶CDK活性的化合物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够抑制并降解周期蛋白依赖性激酶CDK的化合物，及其制备和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种如下式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure GPA0000265661190000021
其中：
——表示单键
Figure GPA0000265661190000022
表示单键或双键
A缺失或选自C(＝O)、C(＝O)X1、SOX1、SO2X1、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、和带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基；其中X1缺失或选自(CR35R36)kO、(CR35R36)kS和NR14；其中R35、R36、R14各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、和带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基，k为0至3之间的整数；
W缺失或选自O、NR17、-X2C(＝O)X3、-X2S(＝O)gX3；其中R17为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；其中X2、X3各自独立的缺失或选自O、S、NR18、(CH2)gO；其中各g为0至2的整数；其中R18为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；
Y为(CR22R23)h、CHX4(CR22R23)h、CX4＝CH(CR22R23)h或(CR22R23)h；其中h为0至30之间的整数；其中R22、R23各自独立的选自H、氰基、羟基、氨基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的烃氧基；其中X4＝H、卤素、氰基、硝基、羟基、带有或不带有取代基C1-8烃氧基、带有或不带有取代基C1-8烃氧羰基、带有或不带有取代基C1-8胺基、带有或不带有取代基C1-8酯基、带有或不带有取代基C1-8胺基羰基、带有或不带有取代基C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基；
Z为(CR24R25)i、CHX5(CR24R25)i、CX5＝CH(CR24R25)i或C≡C(CR24R25)i；其中i为0至30之间的整数；其中R24、R25各自独立的选自H、氰基、羟基、氨基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基、带有或不带有取代基C1-8烃氧基；其中X5＝H、卤素、氰基、硝基、羟基、带有或不带有取代基C1-8的烃氧基、带有或不带有取代基C1-8烃氧羰基、带有或不带有取代基C1-8胺基、带有或不带有取代基C1-8酯基、带有或不带有取代基C1-8胺基羰基、带有或不带有取代基C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基；
B缺失或选自O、C＝O、S、NR15、-NR15C(＝O)-、-C(＝O)NR15-、-C(＝O)O-、OC(＝O)O-、-NR15C(＝O)O-、-OC(＝O)NR15-、-NR15C(＝O)NR16-、带有或不带有取代基的C1-12的烃基、带有或不带有取代基的C1-12的环烃基、和带有或不带有取代基的C1-12的杂环烃基；其中R15、R16各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、和带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；
X选自CR19R20、C(＝O)、S(＝O)、SO2、NR21；其中R19、R20各自独立的选自H、氰基、羟基、氨基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的烃氧基；其中R21选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；
X’缺失或者当X’不被取代时，X’选自NH、CH2、O、S、C(＝O)、S(＝O)、和S(＝O)2；当X’被取代时X’选自N、和CH；
X”缺失或选自C(＝O)、CH2、S(＝O)、和S(＝O)2；
R1、R8各自独立地选自：H、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-6酰基；
R2、R5各自独立的选自：氢、OR26、NR27R28、氰基、卤素、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-6酰基、带有或不带有取代基的C1-6酰胺基；其中R26、R27、R28各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基；
R3、R6、R7、R9、R10各自独立的选自：H、OR29、NR30R31、氰基、卤素、硝基、带有或不带有取代基的C1-8烃基、环烃基、杂环烃基、X6S(＝O)jR32、X6C(＝O)R33；其中j为0至2之间的整数；其中R29，R30，R31，R32，R33各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基、胺基；其中X6缺失或选自O、S、NR34；其中R34为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基；
R4选自H、氰基、羧基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8烃氧羰基；
a为0至5之间的整数(如1、2、3、4、5)；
b为0至3之间的整数(如1、2、3)；
c为0至30之间的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9)；
d为0至9之间的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9)；
e为0至3之间的整数(如1、2、3)。
在另一优选例中，A缺失；W为-X2C(＝O)X3，其中，X3为NR18、并且X2缺失，或者X2为NR18、X3缺失；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，h为1至6之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，i为1至6之间的整数；c为0。
在另一优选例中，A缺失；W缺失或为O；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，h为0至3之间的整数；B为O；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，i为0至3之间的整数；c为1至6之间的整数。
在另一优选例中，A为C(＝O)X1，其中X1缺失或选自(CR35R36)kO、和(CR35R36)kS，其中k为0至2之间的整数，R35、R36各自独立的为氢或C1-4的烷基；W为NR17，其中R17为H、或带有或不带有取代基的C1-4的烃基；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，h为0至3之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，i为0至3之间的整数；B为O；c为1至4之间的整数。
在另一优选例中，A为SO2X1，其中X1缺失或选自O、和S；W为O；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，h为1至6之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，i为0至3之间的整数；c为0。
在另一优选例中，A缺失；W为NR17，其中R17为H、或带有或不带有取代基的C1-4的烃基；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，h为0至3之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，i为0至4之间的整数；B为O；c为1至6之间的整数。
在另一优选例中，A缺失；W缺失；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，h为0至3之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的选自H、羟基、带有或不带有取代基的C1-4的烃基，i为0至3之间的整数；B为O；c为1至10之间的整数。
在另一优选例中，W为-X2C(＝O)X3-；其中X2为NR18、X3为(CH2)gO；其中各g为0至2的整数；其中R18为H、或带有或不带有取代基的C1-6的烃基。
在另一优选例中，R8选自：带有或不带有取代基的C3-8环烃基、或带有或不带有取代基的C3-8杂环烃基。
在另一优选例中，R10为X6C(＝O)R33；其中X6缺失或选自O、NR34；其中R34为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基；R33选自H、带有或不带有取代基的C1-8烃基、和胺基(优选地为二甲基氨基)。
在另一优选例中，R9选自：H、氰基、卤素、硝基、带有或不带有取代基的C1-8烃基(优选为C1-3烷基)。
在另一优选例中，所述的任一取代基选自下组：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、未取代或卤代的C1-C6烷氧基、未取代或卤代的C2-C6烷氧基烷基、未取代或卤代的C3-C8环烷基、未取代或卤代的C2-C6烷基羰基、未取代或卤代的C1-C6亚烷基-羟基、未取代或C1-C6烷基取代的胺基。
在另一优选例中，所述化合物结构如式I’所示：
Figure GPA0000265661190000041
其中，各取代基如上所述。
在另一优选例中，式I、或I’中，
Figure GPA0000265661190000042
表示单键。
在另一优选例中，所述X为C(＝O)。
在另一优选例中，R1、R8各自独立地选自：H、带有或不带有取代基的C1-4烷基、和带有或不带有取代基的C1-8环烷基。
在另一优选例中，R2、R5各自独立的选自：氢、和带有或不带有取代基的C1-4烷基。
在另一优选例中，R3选自：氢、和带有或不带有取代基的C1-4烷基。
在另一优选例中，R6选自：氢、带有或不带有取代基的C1-4烷基、OR29其中R29选自H、带有或不带有取代基的C1-6烷基。
在另一优选例中，R7选自：氢、和带有或不带有取代基的C1-4烷基。
在另一优选例中，R8选自：H、和带有或不带有取代基的C3-8环烷基。
在另一优选例中，R9选自：氢、和带有或不带有取代基的C1-4烷基。
在另一优选例中，R10选自：卤素、氰基、硝基、带有或不带有取代基的C1-4烷基、C(＝O)NR37R38，其中R37，R38各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-4烷基。
在另一优选例中，R4选自H、氰基、带有或不带有取代基的C1-6烷基。
在另一优选例中，所述化合物的结构如下式I”所示：
Figure GPA0000265661190000051
在另一优选例中，式I”中，X’选自N、和CH。
在另一优选例中，X”缺失或选自C(＝O)、和CH2。
在另一优选例中，所述各C1-8环烃基优选为C3-8环烃基(如C3-8环烷基)。
在另一优选例中，所述各C1-8杂环烃基优选为C3-8杂环烃基(如C3-8杂环烷基)。
本发明的第二方面，提供一种药物组合物，所述的组合物含有第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐、前药，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的有效量是指治疗有效量或抑制有效量，较佳地为0.01～99.99％。
在另一优选例中，所述药物组合物，还包含另外一种或多种抗肿瘤剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制周期蛋自依赖性激酶CDK的活性。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病。
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的化合物的用途，用于：
(a)制备治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备周期蛋白依赖性激酶CDK靶向抑制剂或降解剂；
(c)体外非治疗性地抑制或降解周期蛋白依赖性激酶CDK；
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
(e)治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病。
在另一优选例中，所述的疾病包括肿瘤、自身免疫性疾病等。
在另一优选例中，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢上皮癌、脂肪肉瘤、非小细胞肺癌肺癌、肝癌、套细胞淋巴癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、头颈部癌等肿瘤。
在另一优选例中，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮、多发性硬化、器官移植排斥等。
本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式I化合物的制备方法，包括步骤：
Figure GPA0000265661190000052
(a)在惰性溶剂中，用式IV化合物和式II化合物反应，得到式I化合物；
上述各式中，各基团的定义如上所述，M1为离去基团。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
Figure GPA0000265661190000061
(b)在惰性溶剂中，用式III化合物和式V化合物反应，得到式II化合物，M1、M2为离去基团。
本发明的第五方面，提供了一种抑制或降解周期蛋白依赖性激酶CDK的方法，包括步骤：对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，或对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第四方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的抑制是体外非治疗性的抑制。
在另一优选例中，当对抑制对象施用抑制有效量的如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐时，所述的抑制有效量为0.001-500nmol/L，较佳地为0.01-200nmol/L。
本发明的第六方面，提供了一种治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病的方法，所述方法包括：对治疗对象施用治疗有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物，或如本发明第四发明所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述对象为哺乳动物；优选地，所述哺乳动物为人。
在另一优选例中，所述与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病为肿瘤或自身免疫性疾病。
本发明的第七方面，提供了一种体外抑制细胞增殖的方法，所述方法包括：对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物，或如本发明第二方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述细胞为肿瘤细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，制备了一类具有式I所示结构的化合物，并发现其具有周期蛋白依赖性激酶CDK抑制和降解活性。且所述的化合物在极低浓度下，即对周期蛋白依赖性激酶CDK产生抑制作用，抑制活性相当优异，因而可以用于治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK性或表达量相关的疾病如肿瘤。在此基础上完成了本发明。
本发明公开一类新化合物及其能抑制并降解周期蛋白依赖性激酶CDK的用途。这些化合物能抑制并降解周期蛋白依赖性激酶CDK，可用于治疗非小细胞肺癌。
术语
本发明中，术语“C1-8烃基”是指只含有碳、氢两种原子的官能团，其中，碳原子的个数为1～8。烃基可以看作是相应的烃失去一个氢原子后剩下的自由基，其可为烷基、环烷基、烯基或炔基等；其结构可为直链、支链或环状；可以是脂肪族的，也可以是芳香族的。
术语“C1-6烷基”指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或类似基团。
本文所用的术语“烷氧基”包括O-烷基，其中的“烷基”是如上所定义的。
本发明所用术语“卤代”除非另有指示，包括氟代、氯代、溴代或碘代。
本发明的化合物可以含有双键。当含有这类双键时，本发明的化合物以顺式、反式或其混合物存在。
本文所述卤素包括氟、氯、溴和碘。
除非另有指示，本文所指烷基以及烷氧基的烷基部分可以是直链、支链或是环状的。
本发明中，术语“环烃基”是指含有碳、氢两种原子的官能团。包括环烷基、环烯基(至少含有一个碳碳双键)和芳基。它们可以是单环、双环和多环。它们可以是螺环，也可以是稠环。
本发明中，术语“杂环烃基”是指含有碳、氢及除碳、氢外至少一种杂原子的官能团。包括杂环烷基、杂环烯基(至少含有一个碳碳双键)和杂芳基。环中的一个或多个成环原子为杂原子。杂原子可以是O、N和S原子，以及它们的各种组合。它们可以是单环、双环和多环。它们可以是螺环，也可以是稠环。
本发明中，术语“取代基”包括但不限于氟、氯、溴、氰基、羟基、氨基、C1-6烃氧基、C1-6卤代烃基、C1-6酰基、C1-6磺酰基。
本文所用的术语“烃氧基”是指O-烃基，其中的“烃基”是如上所定义的。
本文所用的术语“烃氧羰基”是指C(＝O)O-烃基，其中的“烃基”是如上所定义的。
本文所用的术语“胺基”是指N(H或烃基1)(H或烃基2)，其中的“烃基”是如上所定义的，如-N(C1-6烷基)(C1-6烷基)。
本文所用的术语“胺基羰基”是指C(＝O)-胺基，其中的“胺基”是如上所定义的。
本文所用的术语“酰胺基”是指N(H或烃基)-C(＝O)-烃基，其中的“烃基”是如上所定义的。
本发明中，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、未取代或卤代的C1-6烷基、未取代或卤代的C2-6酰基、未取代或卤代的C1-6烷基-羟基。
除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，术语“本发明化合物”指式I所示的化合物。该术语还包括及式I化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
化合物及其药学上可接受的盐
本发明涉及下式I化合物或其药学上可接受的盐；
Figure GPA0000265661190000071
其中：
——表示单键
Figure GPA0000265661190000072
表示单键或双键
A缺失或选自C(＝O)、C(＝O)X1、SOX1、SO2X1、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、和带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基；其中X1缺失或选自(CR35R36)kO、(CR35R36)kS和NR14；其中R35、R36、R14各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、和带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基，k为0至3之间的整数；
W缺失或选自O、NR17、-X2C(＝O)X3、-X2S(＝O)gX3；其中R17为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；其中X2、X3各自独立的缺失或选自O、S、NR18；其中g为0至2的整数；其中R18为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；
Y为(CR22R23)h、CHX4(CR22R23)h、CX4＝CH(CR22R23)h或(CR22R23)h；其中h为0至30之间的整数；其中R22、R23各自独立的选自H、氰基、羟基、氨基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的烃氧基；其中X4＝H、卤素、氰基、硝基、羟基、带有或不带有取代基C1-8烃氧基、带有或不带有取代基C1-8烃氧羰基、带有或不带有取代基C1-8胺基、带有或不带有取代基C1-8酯基、带有或不带有取代基C1-8胺基羰基、带有或不带有取代基C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基；
Z为(CR24R25)i、CHX5(CR24R25)i、CX5＝CH(CR24R25)i或C≡C(CR24R25)i；其中i为0至30之间的整数；其中R24、R25各自独立的选自H、氰基、羟基、氨基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基、带有或不带有取代基C1-8烃氧基；其中X5＝H、卤素、氰基、硝基、羟基、带有或不带有取代基C1-8的烃氧基、带有或不带有取代基C1-8烃氧羰基、带有或不带有取代基C1-8胺基、带有或不带有取代基C1-8酯基、带有或不带有取代基C1-8胺基羰基、带有或不带有取代基C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基；
B缺失或选自O、C＝O、S、NR15、-NR15C(＝O)-、-C(＝O)NR15-、-C(＝O)O-、OC(＝O)O-、-NR15C(＝O)O-、-OC(＝O)NR15-、-NR15C(＝O)NR16-、带有或不带有取代基的C1-12的烃基、带有或不带有取代基的C1-12的环烃基、和带有或不带有取代基的C1-12的杂环烃基；其中R15、R16各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、和带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；
X选自CR19R20、C(＝O)、S(＝O)、SO2、NR2；其中R19、R20各自独立的选自H、氰基、羟基、氨基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的烃氧基；其中R21选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8的环烃基、带有或不带有取代基的C1-8的杂环烃基；
X’缺失或者当X’不被取代时，X’选自NH、CH2、O、S、C(＝O)、S(＝O)、和S(＝O)2；当X’被取代时X’选自N、和CH；
X”缺失或选自C(＝O)、CH2、S(＝O)、和S(＝O)2；
R1、R8各自独立地选自：H、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-6酰基；
R2、R5各自独立的选自：氢、OR26、NR27R28、氰基、卤素、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基C1-8环烃基、带有或不带有取代基C1-8杂环烃基、带有或不带有取代基的C1-6酰基、带有或不带有取代基的C1-6酰胺基；其中R26、R27、R28各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基；
R3、R6、R7、R9、R10各自独立的选自：H、OR29、NR30R31、氰基、卤素、硝基、带有或不带有取代基的C1-8烃基、环烃基、杂环烃基、X6S(＝O)jR32、X6C(＝O)R33；其中j为0至2之间的整数；其中R29，R30，R31，R32，R33各自独立的选自H、带有或不带有取代基的C1-8烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基、胺基；其中X6缺失或选自O、S、NR34；其中R34为H、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8环烃基、带有或不带有取代基的C1-8杂环烃基；
R4选自H、氰基、羧基、带有或不带有取代基的C1-8的烃基、带有或不带有取代基的C1-8烃氧羰基；
a为0至5之间的整数(如1、2、3、4、5)；
b为0至3之间的整数(如1、2、3)；
c为0至30之间的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9)；
d为0至9之间的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9)；
e为0至3之间的整数(如1、2、3)。
在另一优选例中，所述各C1-8环烃基优选为C3-8环烃基(如C3-8环烷基)。
在另一优选例中，所述各C1-8杂环烃基优选为C3-8杂环烃基(如含3-8个碳原子的4-10元杂环烷基)。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述化合物选自下组：
Figure GPA0000265661190000091
Figure GPA0000265661190000101
Figure GPA0000265661190000111
Figure GPA0000265661190000121
本发明的化合物包可以与无机酸、有机酸或碱形成药学上可接受的盐。所述的无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸等；所述的有机酸包括但不限于甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、富马酸、草酸、乙酸、马来酸、抗坏血酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、乙醇酸、琥珀酸和丙酸等；所述的碱包括但不限于无机盐和胺类。
术语药学上可接受的盐指根据医学判断适用于接触人和哺乳动物的组织而无过度毒性、刺激、过敏反应等的那些盐。药学上可接受的盐为本领域公知的。
本发明还涵盖含有式I化合物的前体药物的药物组合物。前体药物包括这样的化合物，其中前体分子通过碳酸酯键、氨基甲酸酯键、酰胺键、烷基酯键、磷酸酯键、氨基磷酸酯键共价结合到式I化合物的游离羧基、羟基、氨基或胺基上。
化合物的制备
制备方法
下面更具体地描述本发明式I结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
下列反应流程阐述本发明化合物的制备。除非另有指示，反应流程和随后的讨论中的A、B、W、Y、Z、X、X’、X”、a、b、c、d、e、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10是如上述定义的，M1、M2为离去基团。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供的制备本发明式I化合物的的方法，包括步骤：
Figure GPA0000265661190000131
(a)在惰性溶剂中，用式IV化合物和式II化合物反应，得到式I化合物；
上述各式中，各基团的定义如上所述，M1为离去基团。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
Figure GPA0000265661190000132
(b)在惰性溶剂中，用式III化合物和式V化合物反应，得到式II化合物，M1、M2为离去基团。
一般而言，可以如下述方案中所述的从式III获得式I的化合物：
Figure GPA0000265661190000133
在化合物II中，当W为醚时，可采用式III(W1＝OH)在碱作用下与含有离去基团的中间体直接亲核取代制备，或采用光延反应与醇反应来制备；当W为酯、氨基甲酸酯(NHCO2)时，可采用式III(W1＝OH)在碱作用下与酰氯、活化酯(酰胺)、羧酸、异氰酸酯反应制备；当W为胺时，可采用式III(W1＝NH2)在碱作用下与含有离去基团的中间体直接亲核取代制备，也可采用式III(W1＝NH2)与醛/酮进行还原胺化反应来制备；当W为酰胺、烷氧羰基胺(OCONH)及脲时，可采用式III(W1＝NH2)在碱作用下与相应酰氯、活化酯(酰胺)、羧酸、异氰酸酯反应制备。
在化合物I中，当A与氮原子以C-N键连接时，可用直接取代或还原胺化制备；当A与氮原子以酰胺、脲、氨基甲酸酯、磺酰胺、硫酰胺方式连接时，可用相应的酰氯、活化酯(酰胺)、羧酸、异氰酸酯、磺酰氯、硫酰氯制备。
一般的，根据连接结构A与W的情况，化合物I也可以通过先把式IV与中间的链连接，再与式III反应得到。所用化学合成方法同上所述。
式III、IV的化合物可通过已知的合成方法获得或容易通过商业购买获得。
式I化合物的应用
所述的式I化合物可用于以下的一种或多种用途：
(a)制备治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备周期蛋白依赖性激酶CDK靶向抑制剂或降解剂；
(c)体外非治疗性地抑制或降解周期蛋白依赖性激酶CDK；
(d)体外非治疗性地抑制细胞增殖；和/或
(e)治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病。
在另一优选例中，所述与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病为肿瘤或自身免疫性疾病。
本发明的式I化合物可用于制备一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(i)有效量的式I化合物，或其药学上可接受的盐；和(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的有效量是指治疗有效量或抑制有效量。
本发明的式I化合物还可以用于抑制或降解周期蛋白依赖性激酶CDK的方法，所述的抑制是体外非治疗性的抑制也可以是治疗性的抑制。
在另一优选例中，当对抑制对象施用抑制有效量的本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐时，所述的抑制有效量为0.001-500nmol/L，较佳地为0.01-200nmol/L。
特别地，本发明还提供了一种治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病的方法，所述方法包括：对治疗对象施用治疗有效量的式I化合物，或所述含有式I化合物作为有效成分的药物组合物。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的对周期蛋白依赖性激酶CDK的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由与CDK活性或表达量相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗包括肿瘤等的疾病。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure GPA0000265661190000141
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1.提供了一种如式I所示的化合物。
2.提供了一种结构新颖的CDK抑制剂和降解剂及其制备和应用，所述的抑制剂和降解剂在极低浓度下即可抑制CDK的活性并降解CDK酶。
3.提供了一类治疗与CDK酶活性相关疾病的药物组合物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 化合物3的制备
Figure GPA0000265661190000151
第一步：
将2.14g 6-溴己酰氯和1.37g泊马度胺溶于50ml THF中，搅拌回流8h。减压除去溶剂，经柱层析得到化合物(1)1.22g。MS(ESI)：450[M+H]+。
第二步：
将1.00g化合物(1)、1.19g化合物(2)和0.57g二异丙基乙胺溶于30ml DMF中，80℃搅拌6h，降至室温，浓缩后经柱层析得化合物(3)1.21g，收率：66.7％。MS(ESI)：804[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：9.79(br，1H)，8.70(s，1H)，8.34(d，J＝9.2Hz，1H)，8.24(s，1H)，8.03(d，J＝3.2Hz，1H)，7.49(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.33(dd，J＝9.6，3.2Hz，1H)，7.11(d，J＝6.8Hz，1H)，6.91(d，J＝8.4Hz，1H)，6.52(t，J＝5.6Hz，1H)，6.43(s，1H)，4.90(dd，J＝12.0，5.6Hz，1H)，4.78(m，1H)，3.64-3.76(m，4H)，3.15(s，6H)，2.53-2.90(m，6H)，2.39(t，J＝7.2Hz，2H)，1.35-2.16(m，18H)。
实施例2 化合物8的制备
Figure GPA0000265661190000161
第一步：
将4-羟基沙利度胺100mg，三甘醇单苄醚96mg，三苯基膦100mg溶解在10ml无水THF中，滴加DIAD 95mg，室温反应2h。减压去除THF，柱层析纯化后得化合物(4)110mg。MS(ESI)：497[M+H]+。
第二步：
将100mg化合物(4)及10％Pd-C 100mg加入甲醇10ml中，室温氢化过夜。过滤，滤液浓缩，残余物经柱层析纯化后得化合物(5)40mg。MS(ESI)：407[M+H]+。
第三步：
将化合物(5)30mg溶于DCM 5ml中，加入Dess-martin氧化剂47mg，室温反应3h。加入NaHCO3饱和水溶液和Na2S2O3饱和水溶液，搅拌5min，，分出有机层，经无水Na2S2O3干燥，浓缩至干，得化合物(6)直接用于下一步反应。
将化合物(6)用DCM 5ml溶解后，加入原料(7)50mg以及NaBH(OAc)3 30mg，室温反应过夜，减压蒸除DCM，柱层析纯化后得化合物(8)，30mg。MS(ESI)：836[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：9.85(br，1H)，8.83(s，1H)，8.75(br，1H)，8.15(d，J＝8.8Hz，1H)，8.07(d，J＝2.8Hz，1H)，7.67(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.47(d，J＝6.8Hz，1H)，7.32(dd，J＝8.8，2.8Hz 1H)，7.26(d，J＝8.4Hz，1H)，5.87(m，1H)，4.95(dd，J＝12.0，5.2Hz，1H)，4.35(t，J＝4.8Hz，2H)，3.95(t，J＝4.8Hz，2H)，3.80(m，2H)，3.66(m，4H)，3.22(m，4H)，2.68-2.92(m，8H)，2.55(s，3H)，2.48-2.65(m，1H)，2.37(s，3H)，2.30-2.41(m，2H)，2.00-2.16(m，3H)，1.86(br，2H)，1.67(m，2H)。
实施例3 化合物11的制备
Figure GPA0000265661190000171
第一步：
将2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙酸苄酯174mg、碳酸钾100mg、碘化钾20mg与泊马度胺100mg加入20mlDMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，80℃反应过夜。反应液经柱层析纯化后得化合物(9)113mg。MS(ESI)：510[M+H]+。
第二步：
将100mg化合物(9)及10％Pd-C100mg加入10ml甲醇中，室温氢化过夜。过滤，滤液浓缩，残余物经柱层析纯化后得化合物(10)73mg。MS(ESI负离子)：418[M-H]-。
第三步：
将化合物(10)50mg及原料(7)50mg溶于二氯甲烷5ml中，加入HOBt(1-羟基苯并三唑)20mg及EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)40mg，室温反应过夜。减压蒸除二氯甲烷，柱层析纯化后得化合物(11)，32mg.MS(ESI)：849[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.73(br，1H)，8.82(s，1H)，8.52(br，1H)，8.14(d，J＝9.2Hz，1H)，8.08(d，J＝2.8Hz，1H)，7.49(dd，J＝8.4，7.2Hz，1H)，7.33(dd，J＝9.2，2.8Hz，1H)，7.11(d，J＝7.2Hz，1H)，6.91(d，J＝8.4Hz，1H)，6.52(t，J＝5.6Hz，1H)，5.87(m，1H)，4.90(dd，J＝12.0，5.2Hz，1H)，4.53(br，2H)，3.58-3.76(m，10H)，3.48(dd，J＝11.2，5.6Hz，2H)，3.22(t，J＝4.8Hz，4H)，2.65-2.91(m，4H)，2.55(s，3H)，2.37(s，3H)，2.30-2.39(m，2H)，2.00-2.16(m，2H)，1.62-1.92(m 4H)。
实施例4 化合物14的制备
Figure GPA0000265661190000172
第一步：
将原料(7)200mg溶解于二氯甲烷20ml，加入三乙胺100mg及5-苄氧基戊烷磺酰氯135mg，室温反应过夜。减压蒸除溶剂，柱层析纯化后得化合物(12)254mg。MS(ESI)：688[M+H]+。
第二步：
将200mg化合物(12)及10％Pd-C 200mg加入甲醇20ml中，室温氢化反应过夜。过滤，滤液浓缩，柱层析纯化后得化合物(13)161mg.MS(ESI)：598[M+H]+。
第三步：
将4-羟基沙利度胺50mg，三苯基膦50mg和化合物(13)80mg溶解在5ml无水四氢呋喃中，滴加DIAD(偶氮二甲酸二异丙酯)50mg，室温反应3h。减压去除四氢呋喃，柱层析纯化后得化合物(14)36mg。MS(ESI)：854[M+H]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.92(br，1H)，8.83(s，1H)，8.75(br，1H)，8.16(d，J＝8.4Hz，1H)，8.08(d，J＝2.8Hz，1H)，7.67(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.49(d，J＝7.2Hz，1H)，7.33(dd，J＝8.4，2.8Hz 1H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，5.82(m，1H)，4.93(dd，J＝12.0，5.6Hz，1H)，3.95(t，J＝7.2Hz，2H)，3.78(t，J＝6.8Hz，2H)，3.50-3.68(m，4H)，2.55(s，3H)，2.37(s，3H)，2.32-2.73(m，4H)，2.00-2.26(m，10H)，1.34-1.92(m，8H)。
同理，通过类似上述实施例的方法制备以下化合物：
Figure GPA0000265661190000181
Figure GPA0000265661190000191
Figure GPA0000265661190000201
Figure GPA0000265661190000211
Figure GPA0000265661190000221
Figure GPA0000265661190000231
实施例5 用Caliper assay法测试化合物对CDK4/6的抑制活性
实验步骤如下：
配置1×激酶反应缓冲液(50mM HEPES，PH 7.5；0.0015％Brij-35)和激酶反应终止液(100mM HEPES，PH 7.5；0.0015％Brij-35；0.2％Coating Reagent；50mM EDTA)；
配置实验样品：在96孔板中加入100μL 5μM的样品溶液(100％DMSO溶解)，得到50×样品溶液。在同一块板上设置两个只含有100μL 100％DMSO的孔作为对照。一个作为不加样品对照，另一个作为不加酶对照。在96孔板中加入10μL样品和90μL 1×激酶反应缓冲液，作为中转板。将此中转板震荡10分钟。
准备试验板：取96孔中转板中配置好的样品各5μL至384孔板中。
激酶反应：在5μL 5×化合物溶液(用DMSO溶解，用水稀释10倍)中加入10μL的2.5×的CDK4/6激酶溶液(激酶用1×激酶反应缓冲液稀释)，室温孵育10min后再加入10μL的2.5×底物肽溶液(在1×激酶反应缓冲液稀释的FAM标记肽和ATP)。
终止激酶反应：在28℃下反应一段时间后加入25μL激酶反应终止液。
在Caliper上测试荧光度(F)，并收集数据，并计算激酶活性抑制率：
对激酶活性的百分抑制率＝(FDMSO对照-F样品)/(FDMSO对照-F阴性对照)×100％，以DMSO为溶液对照，以不加激酶为阴性对照。
结果显示，化合物(100nM)对CDK4/6的抑制活性见下表：
Figure GPA0000265661190000241
实施例6用Western blot检测化合物降解CDK4/6蛋白的活性
细胞株：MCF-7细胞株(人乳腺癌细胞可购自ATCC)用含10％小牛血清的MEM培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度孵育箱内培养。
设置DMSO对照组、化合物干预组(1μM)，处理24小时收集细胞后加入100μL预冷的细胞裂解液，冰上裂解30min，提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度并进行定量。常规制胶、上样、电泳，然后转膜，封闭，分别加入兔抗人CDK4(1∶450)、兔抗人CDK6(1∶150)，4℃孵育过夜，漂洗后加入二抗IgG(1∶5000)，漂洗后ECL显影液显色，Bio-Rad凝胶成像系统扫描成像，计算机软件处理分析。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内参对照。
使用Image J软件对各条带进行灰度分析，计算化合物降解CDK4/6蛋白的降解率。
化合物对MCF-7细胞中CDK4/6蛋白的降解率见下表：
Figure GPA0000265661190000242
备注：上述表格中，“-”代表无降解活性，“+”代表降解率为10％-30％，“++”代表降解率为30％-50％，“+++”代表降解率为50％-90％，“++++”代表降解率为大于90％。
实施例7 MTT法检测式化合物对MCF-7细胞株(人乳腺癌细胞)增殖的抑制作用
在体外用MTT法实验测定化合物对MCF-7细胞(可购自ATCC)的增殖抑制作用。具体步骤如下：
取MCF-7细胞培养于10％小牛血清的1640培养基中，接种于96孔板，2×105细胞/孔，置于37℃，5％CO2孵化箱中。将各个化合物溶解于二甲亚砜(DMSO)中，得到浓度为10mM的溶液，再用磷酸缓冲液稀释至所需浓度，分别加入上述96孔板中，每个浓度2孔，每孔10μl，每个浓度作两个平行测试。将DMSO相应作梯度稀释后加入板中，作为对照。
将上述96孔板在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时后，每孔中加入20μl 5mg/ml MTT溶液，继续在培养箱中保温3～4小时。每孔加入100μl溶解液，继续在培养箱中保温过夜，使生成的甲媵晶体充分溶解。测定492nm光吸收值。
根据光吸收值计算化合物处理后细胞相对存活率。
通过软件计算化合物对MCF-7细胞的IC50。
合成的化合物对MCF-7细胞的体外增殖抑制作用见下表：
化合物编号 IC<sub>50</sub>(nM)
3 80
8 200
15 220
16 300
21 160
以上结果表明合成的化合物具备良好的抑制MCF-7细胞的活性。
实施例8 CCK8法检测化合物对T47D细胞株(人乳腺癌细胞)增殖的抑制作用
在体外用CCK8法实验测定化合物对T47D细胞(可购自ATCC)的增殖抑制作用。具体步骤如下：
取T47D细胞培养于10％小牛血清的1640培养基中，接种于96孔板，1.5×105/ml，置于37℃，5％CO2孵化箱中。将各个化合物及阳性药(Ribociclib)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，得到浓度为100mM的溶液，再用培养基稀释至所需浓度，分别加入上述96孔板中，每个浓度3孔，每孔50μl。将DMSO相应作梯度稀释后加入板中，作为对照。
将上述96孔板在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72小时后，每孔中加入110μl 9％CCK8溶液，继续在培养箱中保温4小时。测定450nm光吸收值。
根据光吸收值计算化合物处理后细胞相对存活率。通过软件计算化合物对T47D细胞增殖抑制的IC50。
合成的化合物对T47D细胞的体外增殖抑制作用见下表：
Figure GPA0000265661190000251
以上结果表明合成的化合物具备良好的抑制T47D细胞增殖的活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种如下式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003146826630000011
其中：
Figure FDA0003146826630000013
表示单键，
Figure FDA0003146826630000012
表示单键或双键，
A缺失或选自C(＝O)、C(＝O)X1、SO2X1其中X1缺失或为(CR35R36)kO；其中R35、R36各自独立的为H，k为0至3之间的整数；
W缺失或选自O、NR17、X2C(＝O)X3；其中，R17为H；X2、X3各自独立的缺失或选自O和NR18，其中R18为H；
Y为(CR22R23)h，其中h为0至30之间的整数，R22、R23各自独立的为H；
Z为(CR24R25)i，其中i为0至30之间的整数，R24、R25各自独立的为H；
B缺失或为O；
X为C(＝O)；
当X’不被取代时，X’为NH；当X’被取代时X’为N；
X”缺失或为C(＝O)；
R1、R8各自独立地选自：H和C1-8环烃基；
R2、R5各自独立的选自：H和C1-8烃基；
R3、R6、R7、R9、R10各自独立的选自：H、C1-8烃基和X6C(＝O)R33；其中，R33选自H、C1-8烃基、胺基，X6缺失；
R4为H、或C1-8的烃基；
a为0至5之间的整数；
b为0至3之间的整数；
c为0至30之间的整数；
d为0至9之间的整数；
e为0至3之间的整数。
2.如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于：
所述式I中，A缺失；W为X2C(＝O)X3，其中，X3为NR18、并且X2缺失，或者X2为NR18、X3缺失；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的为H，h为1至6之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的为H，i为1至6之间的整数；c为0；或者
所述式I中，A缺失；W缺失或为O；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的为H，h为0至3之间的整数；B为O；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的为H，i为0至3之间的整数；c为1至6之间的整数；或者
所述式I中，A为C(＝O)X1，其中X1缺失或为(CR35R36)kO，其中k为0至2之间的整数,R35、R36各自独立的为氢或C1-4烷基；W为NR17，其中R17为H、或C1-4烃基；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的为H，h为0至3之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的为H，i为0至3之间的整数；B为O；c为1至4之间的整数；或者
所述式I中，A为SO2X1，其中X1缺失或为O；W为O；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的为H，h为1至6之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的为H，i为0至3之间的整数；c为0；或者
所述式I中，A缺失；W为NR17，其中R17为H、或C1-4烃基；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的为H，h为0至3之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的为H，i为0至4之间的整数；B为O；c为1至6之间的整数；或者
所述式I中，A缺失；W缺失；Y为(CR22R23)h，其中R22、R23各自独立的为H，h为0至3之间的整数；Z为(CR24R25)i，其中R24、R25各自独立的为H，i为0至3之间的整数；B为O；c为1至10之间的整数。
3.如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，式I中，R10为X6C(＝O)R33；其中X6缺失；R33选自H、C1-8烃基和二甲基氨基。
4.如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1、R8各自独立地选自：H和C3-8环烷基。
5.如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，R4选自H和C1-6烷基。
6.如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自下组：
Figure FDA0003146826630000021
Figure FDA0003146826630000031
7.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
8.一种如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于：
(a)制备治疗与周期蛋白依赖性激酶CDK活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备周期蛋白依赖性激酶CDK靶向抑制剂或降解剂；
(c)体外非治疗性地抑制或降解周期蛋白依赖性激酶CDK；或
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的疾病为肿瘤或自身免疫性疾病。
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GR01 Patent grant
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