CN109952287A - Mtor-deptor相互作用的抑制剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了可用作DEPTOR的抑制剂的取代腙化合物。本发明进一步提供了本发明的化合物的药物组合物。本发明还提供了取代腙化合物的医学用途。

Description

MTOR-DEPTOR相互作用的抑制剂及其使用方法

政府利益

本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R21 CA168491在政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。该工作由美国退伍军人事务部支持，并且联邦政府享有本发明的某些权利。

相关申请

本申请要求于2016年11月7日提交的美国临时专利申请号62/418,362的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。

背景技术

DEPTOR结合TORC1和TORC2复合物内的mTOR并且抑制该激酶。作为mTOR的抑制剂，在大多数肿瘤类型中DEPTOR的表达非常低并不令人惊讶。然而，DEPTOR的过表达发生在来自患有多发性骨髓瘤(MM)的患者的癌细胞中。

具有最高DEPTOR过表达水平的细胞存在于MM的特定遗传类别中，所述特定遗传类别包含IgH与MAF基因之间的易位或染色体8q24²(含有DEPTOR基因的区)的拷贝数增加。在表达高DEPTOR的MM细胞系中的DEPTOR敲低诱导生长停滞和细胞凋亡。由于DEPTOR是mTOR抑制剂，因此DEPTOR敲低的最接近分子效应是mTORC1和mTORC2活性的激活。TORC1麻痹(paralysis)保护MM细胞免受DEPTOR敲低影响的发现表明在所产生TORC1抑制的情况下DEPTOR与mTOR的结合有助于MM的生存力和增殖。DEPTOR沉默和单一过表达在MM中的抗MM效应表明DEPTOR是这种恶性肿瘤的潜在治疗靶标。

因此，持续需要发现和开发抑制DEPTOR并且可能是有用的治疗剂的新化合物。

发明内容

在某些实施方案中，本发明涉及具有式(I)的结构的化合物：

其中

A是任选取代的氨基、烷基氨基、环烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、酰氨基、二酰氨基、或

R¹、R²、R³和R⁴对于每次出现各自独立地是H、卤基或任选取代的烷基；并且

R⁵对于每次出现独立地是H或任选取代的烷基，优选支链烷基、最优选叔丁基。

在某些实施方案中，R¹是卤基，例如Cl。在某些实施方案中，R²是卤基，例如Cl。在某些实施方案中，R³是卤基，例如Cl。在某些实施方案中，R⁴是卤基，例如Cl。在一些实施方案中，R¹、R²、R³和R⁴各自是卤基，优选各自是F或Cl、最优选Cl。

在某些实施方案中，A是-NHR⁶或-NR⁶R⁷(优选-NHR⁶)；R⁶和R⁷对于每次出现各自独立地是任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基(例如苯基)或任选取代的杂芳基；优选任选取代的烷基或任选取代的芳基(例如，任选取代的苯基)。当R⁶或R⁷是取代的苯基时，取代基优选位于环的间位和对位。因此，在某些优选的此类实施方案中，R⁶是其中R⁸、R⁹和R¹⁰对于每次出现各自独立地是H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基或吸电子取代基(例如卤素、氰基、硝基、羰基、磺酰基等；即，不具有可以给予电子至苯环的孤对的取代基(诸如氨基、羟基、烷氧基等))，优选H、卤基或任选取代的烷基。在一些实施方案中，R⁸和R⁹是H并且R¹⁰是卤基。在其他实施方案中，R⁹是H并且R⁸和R¹⁰是卤基。在还其他实施方案中，R⁸和R⁹是H并且R¹⁰是任选取代的低级烷基，例如-CH₃或-CF₃。

在某些实施方案中，A是优选；其中

R¹¹是任选取代的烷基或任选取代的芳基或杂芳基(例如，任选取代的苯基)；并且

R¹²是任选取代的芳基或杂芳基(例如，任选取代的苯基)。

在某些实施方案中，R¹¹是苯基，其任选地被吸电子取代基(例如卤素、氰基、硝基、羰基、磺酰基等；即，不具有可以给予电子至苯环的孤对的取代基(诸如氨基、羟基、烷氧基等))，优选H、卤基或任选取代的烷基取代。在某些实施方案中，R¹¹是并且R¹³是H、卤基或任选取代的烷基。在一些实施方案中，R¹³是F。在其他实施方案中，R¹³是任选取代的低级烷基。

在某些实施方案中，R¹²是苯基，其任选地被吸电子取代基(例如卤素、氰基、硝基、羰基、磺酰基等；即，不具有可以给予电子至苯环的孤对的取代基(诸如氨基、羟基、烷氧基等))，优选H、卤基或任选取代的烷基取代。

在某些优选的实施方案中，R¹¹和R¹²是相同的。

在某些实施方案中，R⁵是任选取代的低级烷基。

本发明还涉及药物组合物，其包含本文公开的化合物和药学上可接受的载体。

本发明进一步涉及通过使用本文公开的化合物和组合物治疗癌症、抑制癌细胞增殖和抑制细胞中DEPTOR活性的方法。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、甲状腺癌或肺癌。在一些实施方案中，DEPTOR在癌细胞中过表达。例如，在某些实施方案中，DEPTOR在多发性骨髓瘤的细胞中过表达。

附图说明

图1示出了来自NCI抑制剂文库的被鉴定为DEPTOR-mTOR相互作用的抑制剂的命中化合物。

图2示出了化合物B(NSC126405)的示例性结构修饰。

图3A-图3C绘示了本文公开的化合物的示例性测定数据。图3A示出了在将8226细胞暴露于0.5uM的药物6小时后的免疫印迹，随后针对磷酸化p70S6K、总p70或肌动蛋白的表达进行免疫印迹。B-1＝来自NCI的化合物B；B-2＝在UCLA合成的化合物B。图3B示出了来自4次独立实验(n＝4)(其中衍生物以0.5uM使用)的p70磷酸化数据的汇总，平均值±SD；下栏示出了来自MTT细胞毒性测定(n＝4)的IC₅₀，平均值±SD。图3C示出了四种最初测试的衍生物(4b、3d、3e和3f)的MTT细胞毒性数据(平均值+/-SE，n＝3)。

图4A-图4E绘示了本文公开的化合物的示例性测定数据。图4A示出了由于衍生物浓度增加导致的相对于化合物B的p70磷酸化的代表性实验(暴露为6小时)。图4B示出了p70磷酸化数据(平均值±SD，n＝4)的汇总，所述p70磷酸化数据显示为在暴露于增加浓度的衍生物6小时后磷酸化p70/总p70的密度计量比相对于化合物B(化合物B任意保持在‘1’)的倍数增加。图4C示出了由于衍生物引起的上调的p21表达。图4D示出了所有衍生物相对于化合物B的MTT细胞毒性测定(48小时测定)，平均值±SD，n＝4。图4E示出了暴露于不同衍生物后48小时的细胞凋亡％(平均值±SD，n＝4)。

图5A-图5E绘示了本文公开的化合物的示例性测定数据。图5A示出了药物B和衍生物对8226MM细胞或PBL的IC₅₀(48小时测定，结果是5次独立实验的平均值)。治疗指数(TI)计算为IC₅₀PBL/IC₅₀8226细胞。图5B显示用DMSO或药物B处理(6小时)8226细胞，随后进行DEPTOR的免疫沉淀，并且然后针对DEPTOR或结合的mTOR对沉淀物进行免疫印迹。图5C显示用DMSO或0.5uM衍生物处理(6小时)8226细胞，随后进行类似的共免疫沉淀测定。图5D显示用表达shRAPTOR的慢病毒或对照shSCRAMBLE感染8226细胞，随后针对RAPTOR、磷酸化p70、总p70、DEPTOR或微管蛋白进行免疫印迹测定。图5E显示将表达shSCRAMBLE或shRAPTOR的MM细胞与增加浓度的衍生物一起孵育，随后进行MTT测定(48小时)。与对照shSCRAMBLE细胞相比，在RAPTOR沉默的细胞中诱导的细胞毒性(即，减小的细胞存活率)显著降低(p<0.05)。

图6A-图6D绘示了本文公开的化合物的示例性测定数据。当针对骨髓瘤细胞系8226(图6A)、OPM2(图6B)和H929(图6C)测试时，化合物3g展示出相对于药物NSC126405的提高的治疗指数。图6D突出示出了3g和化合物B(NSC126405)的IC₅₀数据。图6E示出了暴露于3g和化合物B(NSC126405)后48小时的凋亡％。

图7A-图7F绘示了本文公开的化合物的示例性测定数据。图7A绘示了显示化合物3g抑制DEPTOR与mTOR结合的数据。图7B、图7C和图D绘示了显示化合物3g诱导DEPTOR的快速蛋白酶体依赖性降解的数据。图7E和图7F绘示了显示通过进一步DEPTOR转染以过表达蛋白质而使抗肿瘤效应减弱的数据。

图8A和图8B绘示了化合物3g的示例性测定数据，所述数据显示在骨髓瘤生长的皮下异种移植肿瘤模型中，3g似乎比NSC 126405(图8A)更有效，对正常WBC计数的影响最小(图8B)。分析了外周血中的白细胞(WBC)、血细胞比容(HCT)、血红蛋白浓度(HgI)和血小板计数。

具体实施方式

在某些方面，本发明提供了取代的腙化合物及其药物组合物。具体地，此类取代的腙化合物可用作DEPTOR抑制剂，并且因此可用作抗癌剂。

I.化合物

在某些实施方案中，本发明涉及具有式(I)的结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中

A是任选取代的氨基、烷基氨基、环烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、酰氨基、二酰氨基、或

R¹、R²、R³和R⁴对于每次出现各自独立地是H、卤基或任选取代的烷基；并且

R⁵对于每次出现独立地是H或任选取代的烷基，优选支链烷基、最优选叔丁基。

在某些实施方案中，R¹是卤基，例如Cl。在某些实施方案中，R²是卤基，例如Cl。在某些实施方案中，R³是卤基，例如Cl。在某些实施方案中，R⁴是卤基，例如Cl。在一些实施方案中，R¹、R²、R³和R⁴各自是卤基，优选各自是F或Cl、最优选Cl。

在某些实施方案中，A是-NHR⁶或-NR⁶R⁷(优选-NHR⁶)；

R⁶和R⁷对于每次出现各自独立地是任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基(例如苯基)或任选取代的杂芳基；优选任选取代的烷基或任选取代的芳基(例如，任选取代的苯基)。当R⁶或R⁷是取代的苯基时，取代基优选位于环的间位和对位。因此，在某些优选的此类实施方案中，R⁶是其中R⁸、R⁹和R¹⁰对于每次出现各自独立地是H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基或吸电子取代基(例如卤素、氰基、硝基、羰基、磺酰基等；即，不具有可以给予电子至苯环的孤对的取代基(诸如氨基、羟基、烷氧基等))，优选H、卤基或任选取代的烷基。在一些实施方案中，R⁸和R⁹是H并且R¹⁰是卤基。在其他实施方案中，R⁹是H并且R⁸和R¹⁰是卤基。在还其他实施方案中，R⁸和R⁹是H并且R¹⁰是任选取代的低级烷基，例如-CH₃或-CF₃。

在某些实施方案中，A是优选；其中

R¹¹是任选取代的烷基或任选取代的芳基或杂芳基(例如，任选取代的苯基)；并且

R¹²是任选取代的芳基或杂芳基(例如，任选取代的苯基)。

在某些实施方案中，R¹¹是苯基，其任选地被吸电子取代基(例如卤素、氰基、硝基、羰基、磺酰基等；即，不具有可以给予电子至苯环的孤对的取代基(诸如氨基、羟基、烷氧基等))，优选H、卤基或任选取代的烷基取代。在某些实施方案中，R¹¹是并且R¹³是H、卤基或任选取代的烷基。在一些实施方案中，R¹³是F。在其他实施方案中，R¹³是任选取代的低级烷基。

在某些实施方案中，R¹²是苯基，其任选地被吸电子取代基(例如卤素、氰基、硝基、羰基、磺酰基等；即，不具有可以给予电子至苯环的孤对的取代基(诸如氨基、羟基、烷氧基等))，优选H、卤基或任选取代的烷基取代。

在某些优选的实施方案中，R¹¹和R¹²是相同的。

在某些实施方案中，R⁵是任选取代的低级烷基。

在某些实施方案中，A是

在某些实施方案中，本发明的化合物可以是式I的化合物的前药，例如，其中母体化合物中的羟基以酯或碳酸酯形式存在，或母体化合物中存在的羧酸以酯形式存在。在某些此类实施方案中，前药在体内代谢成活性母体化合物(例如，酯被水解成对应的羟基或羧酸)。

在某些实施方案中，本发明的化合物可以是外消旋的。在某些实施方案中，本发明的化合物可以富含一种对映体。例如，本发明的化合物可以具有大于30％的ee、40％的ee、50％的ee、60％的ee、70％的ee、80％的ee、90％的ee或甚至95％或更大的ee。本发明的化合物具有多于一个的立体中心。因此，本发明的化合物可以富含一种或多种非对映异构体。例如，本发明的化合物可以具有大于30％的de、40％的de、50％的de、60％的de、70％的de、80％的de、90％的de、或甚至95％或更大的de。

在某些实施方案中，如下文将详细描述的，本发明涉及用式I的化合物或其药学上可接受的盐治疗或预防癌症的方法。在某些实施方案中，可以富集治疗性制剂以提供化合物(例如式I的)的主要一种对映异构体。对映异构体富集的混合物可以包含，例如，至少60摩尔％的一种对映异构体，或更优选至少75、90、95或甚至99摩尔％。在某些实施方案中，富含一种对映异构体的化合物基本上不含另一种对映异构体，其中基本上不含意指与例如组合物或化合物混合物中的另一种对映异构体的量相比所考虑物质占小于10％、或小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％。例如，如果组合物或化合物混合物含有98克第一对映异构体和2克第二对映异构体，则可以说它含有98摩尔％的第一对映异构体和仅2％的第二对映异构体。

在某些实施方案中，可以富集治疗制剂以提供化合物(例如式I的)的主要一种非对映异构体。非对映异构体富集的混合物可以包含，例如，至少60摩尔％的一种非对映异构体，或更优选至少75、90、95或甚至99摩尔％。

在某些实施方案中，本发明提供了适用于在人患者中治疗癌症的药物制剂，所述药物制剂包含有效量的任何式I的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，药物制剂可以用于治疗或预防如本文所述的疾患或疾病。在某些实施方案中，药物制剂具有足够低的热原活性以适合在人患者中使用。

任何上述结构的化合物可以用于制造用于治疗本文公开的任何疾病或疾患的药物。

II.药物组合物

在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含式I的化合物和药学上可接受的载体。

本发明的组合物和方法可以用于治疗有需要的个体。在某些实施方案中，个体是哺乳动物诸如人或非人哺乳动物。当施用至动物诸如人时，所述组合物或化合物优选作为药物组合物施用，所述药物组合物包含例如本发明的化合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域熟知的，并且包括例如水性溶液(诸如水或生理缓冲盐水)或其他溶剂或媒介物，诸如二醇、甘油、油(诸如橄榄油)或可注射的有机酯。在优选的实施方案中，当此类药物组合物是用于人施用，特别是用于侵入性施用途径(即，规避通过上皮细胞屏障进行的转运或扩散的途径，诸如注射或植入)时，水性溶液是无热原的，或基本上无热原的。可以选择赋形剂，例如以实现剂的延迟释放或选择性地靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是呈剂量单位的形式，诸如片剂、胶囊(包括分散型胶囊(sprinklecapsule)和明胶胶囊)、颗粒、用于复原的亲液物、粉剂、溶液、糖浆、栓剂、注射剂等。组合物还可以存在于透皮递送系统，例如皮肤贴剂中。组合物还可以存在于适于局部(topical)施用的溶液，诸如滴眼剂中。

药学上可接受的载体可以含有生理学上可接受的剂，所述剂例如用于稳定、增加溶解度或增加化合物诸如本发明化合物的吸收。此类生理学上可接受的剂包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的剂)的选择取决于例如组合物的施用途径。制剂或药物组合物可以是自乳化药物递送系统或自微乳化药物递送系统。药物组合物(制剂)也可以是脂质体或其他聚合物基质，其可以将例如本发明的化合物掺入其中。脂质体(例如，其可以包括磷脂质或其他脂质)是制备和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的且可代谢的载体。

本文采用的短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。各种载体在可与配制品的其他成分相容并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格式溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药物配制品中采用的其他无毒相容性物质。

药物组合物(制剂)可以通过多种施用途径施用至受试者，所述施用途径包括，例如，经口施用(例如灌服剂(如在水性或非水性溶液或悬浮液中)、片剂、胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、大丸剂、粉剂、颗粒、用于施用至舌的糊剂)；通过口腔黏膜的吸收(例如以舌下方式)；经肛门、直肠或阴道施用(例如，作为阴道栓剂、膏剂或泡沫剂)；经胃肠外施用(包括例如作为无菌溶液或悬浮液的肌肉内、静脉内、皮下或鞘内施用)；鼻内施用；腹膜内施用；皮下施用；经皮施用(例如作为贴剂施用至皮肤)；以及局部施用(例如，作为霜剂、软膏剂或喷雾剂施用至皮肤，或作为滴眼剂)。化合物还可以被配制用于吸入。在某些实施方案中，化合物可以简单地溶解于或悬浮于无菌水中。适当的施用途径和适用于所述施用途径的组合物的细节可以见于例如美国专利号6,110,973、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896，以及其中引用的专利中。

配制品可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域中熟知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据被治疗的宿主、具体施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。一般来讲，在100％的范围中，该量的范围为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％、最优选约10％至约30％。

用于制备这些配制品或组合物的方法包括使活性化合物(诸如本发明的化合物)与载体和任选的一种或多种辅助成分联合的步骤。一般来讲，通过将本发明的化合物与液体载体、或细分的固体载体，或两者均匀且密切地联合，并且然后(如果必要)使产物成形来制备配制品。

适合用于口服施用的本发明配制品可以呈以下形式：胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(lozenge)(使用经调味的基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、亲液物、粉剂、颗粒，或作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆、或作为软锭剂(pastille)(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等，每种均含有预定量的本发明化合物作为活性成分。组合物或化合物还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。

为了制备用于口服施用的固体剂型(胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒等)，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下中的任一种进行混合：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液延迟剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；(10)络合剂，诸如改性和未改性的环糊精；以及(11)着色剂。在胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以用作软质和硬质填充的明胶胶囊中的填充剂，所述胶囊使用此类赋形剂诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。

可以任选地与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制来制备片剂。可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羧基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压制片剂。可以通过在合适机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。

药物组合物的片剂和其他固体剂型，诸如糖衣丸、胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、丸剂和颗粒，可以任选地具有刻痕或用包衣或外壳制备，所述包衣或外壳诸如肠溶包衣或在药物配制领域中熟知的其他包衣。还可以使用例如用于提供所需释放曲线的不同比率的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球将它们配制成用于提供其中活性成分的缓释或控释。可以通过例如通过细菌滞留过滤器过滤或通过掺入呈无菌固体组合物的形式的灭菌剂将它们灭菌，所述无菌固体组合物可以在临使用前溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。这些组合物还可以任选地含有遮光剂并且还可以为仅在或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分还可以呈微囊化的形式并且适当时具有一种或多种上述赋形剂。

可用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、用于复原的亲液物、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分之外，液体剂型可以含有通常在本领域中使用的惰性稀释剂，诸如，例如水或其他溶剂、环糊精及其衍生物、增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。

除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香料和防腐剂。

除活性化合物之外，悬浮液还可以含有助悬剂，例如像乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。

用于直肠、阴道或尿道施用的药物组合物的配制品可以呈现为栓剂，所述栓剂可以通过将一种或多种活性化合物与一种或多种适合的无刺激性赋形剂或载体(包括，例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备并且所述栓剂在室温下为固体，但在体温下为液体并且因此在直肠或阴道腔中将融化并且释放活性化合物。

用于施用至口腔的药物组合物的配制品可以呈现为漱口水、口腔喷雾剂或口腔膏剂。

另选地或另外地，可以配制组合物用于通过导管、支架、线或其他腔内装置递送。通过此类装置的递送对于递送至膀胱、尿道、输尿管、直肠或肠尤其有用。

适合用于阴道施用的配制品还包括含有本领域已知适当的此类载体的阴道栓剂、止血栓、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂配制品。

用于局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

除活性化合物之外，剂膏、糊剂、霜剂和凝胶可以含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。

除活性化合物之外，粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外地含有常规推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃(诸如丁烷或丙烷)。

透皮贴剂具有提供本发明化合物控制递送至身体的附加优点。此类剂型可以通过将活性化合物溶解于或分散于适当的介质中来制得。吸收促进剂也可以用于增加化合物穿过皮肤的通量。该通量的速率可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。

眼科配制品、眼用膏剂、粉剂、溶液等也涵盖于本发明的范围内。示例性眼科配制品描述于美国公布号2005/0080056、2005/0059744、2005/0031697和2005/004074以及美国专利号6,583,124中，所述专利的内容通过引用并入本文。如果需要，液体眼科配制品具有与泪液、房水或玻璃体液相似的特性或与此类流体相容。优选的施用途径是局部施用(例如，局部施用，诸如滴眼剂，或通过植入物施用)。

如本文所用，短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射来施用，并且包括而不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适合于肠胃外施用的药物组合物包含一种或多种活性化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在临使用前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，所述组合可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使配制品与预期受体的血液等渗的溶质，或助悬剂或增稠剂。

可用于本发明的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂加以维持。

这些组合物也可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等确保防止微生物的作用。还可能合乎需要的是在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延迟吸收。

在一些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液态悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小和晶形。另选地，通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来完成肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。

通过在诸如聚乳酸交酯-聚乙交酯的生物可降解聚合物中形成主题化合物的微胶囊化基质来制备可注射储库形式。根据药物与聚合物的比率和所采用的具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库式可注射配制品。

对于在本发明的方法中的使用，活性化合物可以本身给予或作为含有例如0.1％至99.5％(更优选0.5％至90％)的活性成分与药学上可接受的载体的组合的药物组合物给予。

引入方法也可以通过可再充装或生物可降解的装置提供。近年来，已经开发并测试了各种缓释聚合物装置用于药物(包括蛋白质生物药物)的控制递送。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括生物可降解和非生物可降解聚合物，可以用于形成用于在特定靶位点持续释放化合物的植入物。

药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能有所变化，以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望的治疗应答而对患者无毒的活性成分的量。

选择的剂量水平将取决于多种因素，包括采用的特定化合物或化合物组合，或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与采用的一种或多种特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、疾患、总体健康状况和先前病史以及在医学领域熟知的类似因素。

具有本领域中普通技能的医师或兽医能够容易地确定所需药物组合物的治疗有效量并开出处方。例如，医师或兽医可以以低于为实现期望的治疗效果所需水平的水平开始药物组合物或化合物的剂量并且逐渐增加剂量直至实现期望的效果。“治疗有效量”意指足以引发期望的治疗效果的化合物的浓度。通常应当理解，化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其他因素可以包括但不限于患者疾患的严重程度、所治疗的病症、化合物的稳定性，以及(如果需要)与本发明化合物一起施用的另一类治疗剂。通过多次施用所述剂可以递送更大的总剂量。确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的(Isselbacher等人(1996)Harrison’s Principles of InternalMedicine第13版,1814-1882，通过引用并入本文)。

一般来讲，本发明的组合物和方法中使用的活性化合物的适合日剂量将为作为化合物有效产生治疗效果的最低剂量的那个量。这种有效剂量将通常取决于上述因素。

如果需要，活性化合物的有效日剂量可以任选地以单位剂型作为在全天内以适当间隔分开施用的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。在本发明的某些实施方案中，活性化合物可以每日施用两次或三次。在优选的实施方案中，活性化合物将每日施用一次。

接受该治疗的患者可以是有需要的任何动物，包括灵长类动物、特别是人，和其他哺乳动物，诸如马、牛、猪和绵羊；以及一般而言的家禽和宠物。

在某些实施方案中，本发明的化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合施用。如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗化合物的任何施用形式，使得在先前施用的治疗性化合物在体内仍有效的同时施用第二种化合物(例如，两种化合物同时在患者中有效，这可包括两种化合物的协同作用)。例如，不同的治疗化合物可以在相同的配制品中或在单独的配制品中同时或依序施用。在某些实施方案中，不同的治疗性化合物可以在彼此的1小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或一周内施用。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同的治疗性化合物的组合效果。

在某些实施方案中，本发明的化合物与一种或多种另外的治疗剂(例如，一种或多种另外的化学治疗剂)联合施用相对于本发明的化合物(例如式I的化合物)或一种或多种另外的治疗剂的每次单独施用提供改善的功效。在某些此类实施方案中，联合施用提供累加效果，其中累加效果是指单独施用本发明的化合物和一种或多种另外的治疗剂的每种效果的总和。

本发明包括本发明的化合物的药学上可接受的盐在本发明的组合物和方法中的用途。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”包括衍生自无机酸或有机酸的盐，所述无机酸或有机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、磷酸、甲酸、乙酸、乳酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、乙醇酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸、丙二酸、三氟乙酸、三氯乙酸、萘-2-磺酸和其他酸。药学上可接受的盐形式可以包括其中构成盐的分子的比例不是1:1的形式。例如，盐可以包含每分子碱多于一个的无机酸或有机酸分子，诸如每分子式I的化合物两个盐酸分子。作为另一个实例，盐可以包含每分子碱少于一个的无机酸或有机酸分子，诸如每分子酒石酸两分子式I的化合物。

在进一步的实施方案中，本发明考虑的盐包括但不限于烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。在某些实施方案中，本发明考虑的盐包括但不限于L-精氨酸、苯乙苄胺(benenthamine)、苄星青霉素、甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、氢化胺、1H-咪唑、锂、L-赖氨酸、镁、4-(2-羟乙基)吗啉、哌嗪、钾、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠、三乙醇胺、氨丁三醇和锌盐。在某些实施方案中，本发明考虑的盐包括但不限于Na、Ca、K、Mg、Zn或其他金属的盐。

药学上可接受的酸加成盐也可以作为各种溶剂合物存在，诸如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等一起存在。也可以制备此类溶剂合物的混合物。这种溶剂合物的来源可以是来自结晶的溶剂，在制备或结晶的溶剂中固有的，或者对于这种溶剂是外来物。

润湿剂、乳化剂和润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香料、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

III.DEPTOR抑制剂的用途

在某些方面，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用例如治疗有效量的式I的化合物或本文公开的组合物。

在某些实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、甲状腺癌或肺癌。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的细胞的特征在于DEPTOR的过表达。

在某些实施方案中，本发明提供了抑制癌细胞增殖的方法，所述方法包括使癌细胞与有效量的式I的化合物接触。在一些实施方案中，DEPTOR在癌细胞中过表达。

本发明还提供了抑制细胞中DEPTOR活性的方法，所述方法包括使细胞与式I的化合物或本文公开的组合物接触。在一些实施方案中，细胞过表达DEPTOR。在一些实施方案中，细胞是癌细胞。此类方法可以在体内或体外进行。

在某些实施方案中，癌症是实体瘤。受试者通常是被诊断为患有癌性肿瘤的受试者或者先前已经过癌性肿瘤治疗的受试者(例如，其中肿瘤先前已通过手术除去)。癌性肿瘤可以是原发性肿瘤和/或继发性(例如转移性)肿瘤。

在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，受试者在癌性细胞中具有高DEPTOR表达。

IV.定义

术语“酰基”是本领域公认的并且是指由通式烃基C(O)-，优选烷基C(O)-表示的基团。

术语“酰氨基”是本领域公认的并且是指被酰基取代的氨基并且可以例如由式烃基C(O)NH-表示。

术语“酰氧基”是本领域公认的并且是指由通式烃基C(O)O-，优选烷基C(O)O-表示的基团。

术语“烷氧基”是指具有连接于其的氧的烷基，优选低级烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、-OCF₃、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。

术语“环烷氧基”是指具有连接于其的氧的环烷基。

术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基并且可以由通式烷基-O-烷基表示。

术语“烷基氨基烷基”是指被烷基氨基的烷基。

如本文所用，术语“烯基”是指含有至少一个双键并且旨在包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”两者的脂族基团，后者是指具有取代烯基的一个或多个碳上的氢的取代基的烯基部分。此类取代基可以出现在一个或多个碳上，所述一个或多个碳包括在或不包括在一个或多个双键中。此外，此类取代基包括，如下文讨论的考虑用于烷基的所有取代基，除非稳定性是不允许的。例如，考虑用一个或多个烷基、碳环基、芳基、杂环基或杂芳基取代烯基。

“烷基”或“烷烃”是完全饱和的直链或支链的非芳族烃。通常，除非另外定义，否则直链或支链烷基具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子。直链和支链烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C₁-C₆直链或支链烷基也称为“低级烷基”。

此外，如在整个说明书、实施例和权利要求中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”两者，后者是指具有替代烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分。如果没有另外说明，此类取代基可以包括，例如，卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸根、膦酸根、次膦酸根、氨基、酰胺基、脒基、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员应当理解，如果适当，烃链上取代的部分本身可以被取代。例如，取代烷基的取代基可以包括取代和未取代形式的氨基、叠氮基、亚氨基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸根和次膦酸根)、磺酰基(包括硫酸根、磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸根)和甲硅烷基，以及醚、烷基硫、羰基(包括酮、醛、羧酸盐和酯)、-CF₃、-CN等。示例性取代的烷基如下所述。环烷基可以进一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF₃、-CN等取代。

术语“C_x-y“当与化学部分(诸如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基)结合使用时意指包括链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“C_x-y烷基”是指取代或未取代的饱和烃基，包括在链中含有x至y个碳的直链烷基和支链烷基，包括卤代烷基诸如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。C₀烷基指示氢，其中基团位于末端位置，如果是内部则为键。术语“C_2-y烯基”和“C_2-y炔基”是指长度和可能取代类似于上述烷基但分别含有至少一个双键或三键的取代或未取代的不饱和脂族基团。

如本文所用，术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基取代的氨基。

如本文所用，术语“烷硫基”是指被烷基取代的硫醇基团并且可以由通式烷基S-表示。

如本文所用，术语“炔基”是指含有至少一个三键并且旨在包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”两者的脂族基团，后者是指具有替代炔基的一个或多个碳上的氢的取代基的炔基部分。此类取代基可以出现在一个或多个碳上，所述一个或多个碳包括在或不包括在一个或多个三键中。此外，此类取代基包括，如上文讨论的考虑用于烷基的所有取代基，除非稳定性是不允许的。例如，考虑用一个或多个烷基、碳环基、芳基、杂环基或杂芳基取代炔基。

如本文所用，术语“酰胺”是指基团

其中每个R¹⁰⁰独立地表示氢或烃基，或者两个R¹⁰⁰与它们所连接的N原子一起完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

术语“胺”和“氨基”是本领域公认的并且是指未取代的和取代的胺及其盐，例如可以由下式表示的部分

其中每个R¹⁰⁰独立地表示氢或烃基，或者两个R¹⁰⁰与它们所连接的N原子一起完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

如本文所用，术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。

如本文所用，术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。

如本文所用，术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子是碳。优选地，环是5至7元环，更优选是6元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳为两个相邻环共用，其中至少一个环是芳族的，例如，其他环可以为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。

术语“芳基氨基”是指通过氨基连接的如本文所定义的芳基或杂芳基。

术语“氨基甲酸酯”是指本领域公认的并且是指基团

其中R⁹⁰和R¹⁰⁰独立地表示氢或烃基，诸如烷基，或者R⁹⁰和R¹⁰⁰与一个或多个间插原子一起完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

如本文所用，术语“碳环”和“碳环的”是指其中环的每个原子是碳的饱和或不饱和的环。术语碳环包括芳族碳环和非芳族碳环两者。非芳族碳环包括其中所有碳原子都是饱和的环烷烃环和含有至少一个双键的环烯烃环。“碳环”包括5-7元单环和8-12元双环。双环碳环的每个环可以选自饱和环、不饱和环和芳族环。碳环包括双环分子，其中在两个环之间共享一个、两个或三个或更多个原子。术语“稠合碳环”是指双环碳环，其中每个环与另一个环共享两个相邻的原子。稠合碳环的每个环可以选自饱和环、不饱和环和芳族环。在示例性实施方案中，芳族环(例如苯基)可以稠合至饱和或不饱和的环，例如环己烷、环戊烷或环己烯。饱和双环、不饱和双环和芳族双环的任何组合在化合价允许时包括在碳环的定义中。示例性“碳环”包括环戊烷、环己烷、双环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性稠合碳环包括十氢化萘、萘、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1H-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可以在能够带有氢原子的任何一个或多个位置被取代。

“环烷基”基团是完全饱和的环烃。“环烷基”包括单环和双环。通常，除非另外定义，否则单环环烷基具有3至约10个碳原子，更通常地3至8个碳原子。双环环烷基的第二环可以选自饱和环、不饱和环和芳族环。环烷基包括双环分子，其中在两个环之间共享一个、两个或三个或更多个原子。术语“稠合环烷基”是指双环环烷基，其中每个环与另一个环共享两个相邻的原子。稠合双环环烷基的第二环可以选自饱和环、不饱和环和芳族环。“环烯基”基团是含有一个或多个双键的环烃。

如本文所用，术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基。

术语“碳酸酯”是本领域公认的并且是指基团-OCO₂-R¹⁰⁰，其中R¹⁰⁰表示烃基。

如本文所用，术语“羧基”是指由式-CO₂H表示的基团。

如本文所用，术语“酯”是指基团-C(O)OR¹⁰⁰，其中R¹⁰⁰表示烃基。

如本文所用，术语“醚”是指通过氧与另一个烃基连接的烃基。因此，烃基的醚取代基可以是烃基-O-。醚可以是对称的或不对称的。醚的实例包括但不限于杂环-O-杂环和芳基-O-杂环。醚包括“烷氧基烷基”，其可以由通式烷基-O-烷基表示。

如本文所用，术语“卤基”和“卤素”意指卤素并且包括氯、氟、溴和碘。

如本文所用，术语“杂芳烷基(hetaralkyl/heteroaralkyl)”是指被杂芳基取代的烷基。

如本文所用，术语“杂烷基”是指碳原子和至少一个杂原子的饱和或不饱和的链，其中没有两个杂原子是相邻的。

如本文所用，术语“杂烷基氨基”是指被杂烷基取代的氨基。

术语“杂芳基(heteroaryl/hetaryl)”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选5至7元环，更优选5至6元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选一至四个杂原子、更优选一个或两个杂原子。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳为两个相邻环共用，其中至少一个环是杂芳族的，例如，其他环可以为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。

如本文所用，术语“杂原子”意指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧和硫。

术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，优选3至10元环，更优选3至7元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选一至四个杂原子、更优选一个或两个杂原子。术语“杂环基”和“杂环的”还包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳为两个相邻环共用，其中至少一个环是杂环的，例如，其他环可以为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。杂环基也可以被氧代基团取代。例如，“杂环基”涵盖吡咯烷和吡咯烷酮。

如本文所用，术语“杂环基氨基”是指被杂环基取代的氨基。

如本文所用，术语“杂环烷基”是指被杂环基团取代的烷基。

如本文所用，术语“杂环烷基氨基”是指被杂环烷基取代的氨基。

如本文所用，术语“烃基”是指通过不具有＝O或＝S取代基的碳原子键合的基团，并且通常具有至少一个碳-氢键和主要碳主链，但是可以任选地包含杂原子。因此，出于本申请的目的，像甲基、乙氧基乙基，2-吡啶基和三氟甲基的基团被认为是烃基，但取代基诸如乙酰基(在连接碳上具有＝O取代基)和乙氧基(通过氧而不是碳连接的)不是烃基。烃基包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环基、烷基、烯基、炔基及其组合。

如本文所用，术语“羟基烷基”是指被羟基取代的烷基。

术语“低级”当与化学部分(诸如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基)结合使用时意指包括取代基中有十个或更少非氢原子，优选六个或更少非氢原子的基团。“低级烷基”例如是指含有十个或更少碳原子，优选六个或更少碳原子的烷基。在某些实施方案中，本文所定义的酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别是低级酰基、低级酰氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基，无论它们单独出现还是与其他取代基组合出现，诸如，在表述羟基烷基和芳烷基中(在这种情况下，例如，当对烷基取代基中的碳原子进行计数时，不计芳基内的原子)。

如本文所用，术语“氧代”是指羰基。当氧代取代基出现在原本饱和的基团上时，诸如在氧代取代的环烷基(例如3-氧代-环丁基)的情况下，取代基仍然旨在是饱和基团。当基团被称为被“氧代”基团取代时，这可以意指羰基部分(即-C(＝O)-)替代亚甲基单元(即-CH₂-)。

术语“多环基”、“多环”和“多环的”是指两个或更多个环(例如，环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子对于两个相邻的环是共同的，例如，环是“稠环”。多环中的每个环可以是取代的或未取代的。在某些实施方案中，多环中的每个环在环中含有3至10个原子，优选5至7个。

术语“甲硅烷基”是指其上连接有三个烃基部分的硅部分。

术语“取代的”是指具有替代主链的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。应当理解，“取代”或“被...取代”包括隐含条件，即这种取代符合被取代原子和取代基的允许化合价，并且取代产生稳定化合物，所述化合物例如不会自发地诸如通过重排、环化、消除等进行转化。如本文所用，术语“取代的”设想包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广泛的方面，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支链和非支链、碳环和杂环以及芳族和非芳族取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个以及相同或不同的。出于本发明的目的，杂原子诸如氮可以具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价的本文所述有机化合物的任何可允许的取代基。取代基可以包括本文所述的任何取代基，例如，卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸根、膦酸根、次膦酸根、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员应当理解，如果适当，取代基本身可以被取代。除非特别说明为“未取代的”，否则本文对化学部分的提及应当理解为包括取代的变体。例如，对“芳基”基团或部分的提及隐含地包括取代和未取代的变体两者。

术语“硫酸根”是本领域公认的并且是指基团-OSO₃H或其药学上可接受的盐。

术语“磺酰胺”是本领域公认的并且是指由以下通式表示的基团

其中R⁹和R¹⁰独立地表示氢或烃基，诸如烷基，或者R⁹和R¹⁰与一个或多个间插原子一起完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

术语“亚砜”是本领域公认的并且是指基团-S(O)-R¹⁰⁰，其中R¹⁰⁰表示烃基。

术语“磺酸根”是本领域公认的并且是指基团SO₃H或其药学上可接受的盐。

术语“砜”是本领域公认的并且是指基团-S(O)₂-R¹⁰⁰，其中R¹⁰⁰表示烃基。

如本文所用，术语“硫代烷基”是指被硫醇基团取代的烷基。

如本文所用，术语“硫酯”是指基团-C(O)SR¹⁰⁰或-SC(O)R¹⁰⁰，其中R¹⁰⁰表示烃基。

如本文所用，术语“硫醚”等同于醚，其中氧被硫替代。

术语“尿素”是本领域公认的并且可以由以下通式表示

其中R⁹⁰和R¹⁰⁰独立地表示氢或烃基，诸如烷基，或者与R¹⁰⁰一起出现的R⁹⁰与间插原子完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

“保护基团”是指当与分子中的反应性官能团连接时，掩蔽、降低或阻止官能团的反应性的一组原子。通常，可以在合成过程中根据需要选择性地除去保护基团。保护基团的实例可以见于Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Chemistry,第3版,1999,John Wiley&Sons,NY和Harrison等人,Compendium of Synthetic Organic Methods,第1-8卷,1971-1996,John Wiley&Sons,NY中。代表性的氮保护基团包括但不限于甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄氧基羰基(“CBZ”)、叔丁氧基羰基(“Boc”)、三甲基甲硅烷基(“TMS”)、2-三甲基甲硅烷基-乙磺酰基(“TES”)、三苯甲基和取代的三苯甲基、烯丙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(”FMOC”)、硝基-藜芦氧基羰基(”NVOC”)等。代表性的羟基保护基团包括但不限于其中羟基被酰化(酯化)或烷基化的那些，诸如苄基和三苯甲基醚，以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚(例如，TMS或TIPS基团)、乙二醇醚，诸如乙二醇和丙二醇衍生物和烯丙基醚。

如本文所用，“预防”病症或疾患的治疗剂是指一种化合物，其在统计学样本中，相对于未治疗对照样本使在所治疗样本中的病症或疾患的发生率降低，或者相对于未治疗对照样本延迟病症或疾患的一种或多种症状的发作或降低其严重程度。

术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域认可的并且包括向宿主施用一种或多种主题组合物。如果在临床表现不希望的疾患(例如宿主动物的疾病或其他不需要的状态)之前施用，则治疗是预防性的(即，其保护宿主免受不希望的疾患的发生)，而如果在出现不希望的疾患之后施用，则治疗是治疗性的(即，其旨在减弱、改善或稳定现有的不希望的疾患或其副作用)。

术语“前药”旨在涵盖在生理条件下转化为本发明的治疗活性剂(例如，式I的化合物)的化合物。用于制备前药的常用方法是包含一个或多个选择的部分，其在生理条件下水解以显示期望的分子。在其他实施方案中，前药通过宿主动物的酶活性进行转化。例如，酯或碳酸酯(例如醇或羧酸的酯或碳酸酯)是本发明的优选前药。在某些实施方案中，上文呈现的配制品中的式I的化合物中的一些或全部可以用对应的合适前药替代，例如，其中母体化合物中的羟基以酯或碳酸酯形式存在，或母体化合物中存在的羧酸以酯形式存在。

V.实施例

实施例1.化学

利用酵母双杂交筛选对来自NCI小分子抑制剂文库的约150,000种化合物进行了预先筛选(pilot screening)，并且鉴定了四种特异性抑制DEPTOR-mTOR相互作用的化合物('命中')(图1)。在这四种化合物中，前两种化合物NSC119055和NSC119670没有提供许多结构变异的机会，因为它们是非常简单的结构。第三种化合物NSC118305呈现出若干个变异位置，但我们担心共轭二烯单元，因为此类聚烯烃单元可能会引起非选择性毒性。实际上，该化合物对正常的造血集落形成细胞是有毒的，当以低至0.5μM使用时完全防止集落形成(未显示)。最终化合物NSC126405对集落形成没有毒性(浓度高达10μM)，且还展示出分子功效(增强的mTORC1活性)和抗MM细胞毒性(MTT测定)。因此，选择所示的最终化合物NSC126405(简称为化合物B)作为用于修饰以试图改善其活性的第一化合物。

化合物B的所有部分的可能修饰示于图2中。由于据报道B的未取代类似物，即去除了氯的那些是相当具反应性的亲核试剂⁵，这可能由于在氨基上带正电荷并且在全氯二烯体系上带负电荷的强烈的共振结构，因此不追求完全未取代的环戊二烯体系，希望更多的取代体系更稳定并且反应性更小。制备了一系列化合物并且测试了它们的生物活性，以便为该系列建立全面的结构-活性关系(SAR)。

首先，对腙单元进行修饰并且特别是改变腙胺氮上的取代基，即化合物B的顶部部分，如图2所示。这些化合物的合成是通过两种相对简单的途径完成的(方案1)。⁹因此，可商购获得的六氯环戊二烯1与选择的肼单元2在THF中的缩合通常进行得非常好。也可以使用肼的HCl盐和添加的碱。⁶最好的程序常常是在作为溶剂的吡啶中使用肼HCl盐。通常通过硅胶快速柱色谱法纯化所需的化合物3，并且也可以将若干种重结晶。通过该途径制备母体化合物B，产率为62％。制备若干种N-烷基衍生物3a-3c，并且还是使用该途径以通过使用烷基肼或N-氨基苯胺2制备一些N-芳基衍生物3d-3l，其中R¹和/或R²是芳基。化合物3a-3l通常颜色很深，例如深橙色或红色。⁷

方案1.试剂和条件：(a)2游离形式，THF，22℃；(b)2HCl盐，TEA，THF，22℃；(c)2HCl盐，Pyr，22℃。

接下来，制备若干种N-单-和二-酰基衍生物。参见4a-4f(方案2)。⁹如图所示，在碱存在下，通过母体化合物B与酸酐或酰基氯的选择性单酰化合成单酰基化合物4a、4c-4d。如果使两当量的酰基氯与B和碱反应，则获得二酰化衍生物4b、4e-4f。还使用二碳酸二叔丁酯或对应的烷基氧基羰基氯从B制备一些N-单-氨基甲酰基衍生物4g-4i。

方案2.试剂和条件：(a)(RCO)₂O或RCOCl，TEA，THF，22℃，0.5-3h；(b)(ROCO)₂O或ROCOCl，pyr，DMAP，THF，0至22℃，16-24h。

由于有人担心具有二氯烯烃单元的化合物可能会显示一些非特异性毒性，因此引入了一些环状和非环状部分来代替四氯环戊二烯环系(方案3)。^10,11为了进一步扩展我们的底物范围，进行了对分子底部部分的修饰。通过简单的酮、芴酮和呫吨酮5与肼或肼HCl盐和KOH在回流的乙醇中反应制备腙6a¹⁰、6b¹¹和6d。苯甲酮肼6c是可商购获得的。通过用二碳酸二叔丁酯和吡啶和DMAP在THF中处理肼，由6a制备N-Boc衍生物6e。¹²腙6a-6e的产率通常相当好。另外，制备了茚满酮、环戊酮和苯乙酮的未取代腙，但这些化合物在二聚吖嗪的重排方面是不稳定的。⁸

方案3.试剂和条件：(a)N₂H₄，EtOH或三乙二醇(TEG)，回流；(b)H₂N-NHR HCl，KOH，EtOH，回流；(c)6a，二碳酸二叔丁酯，pyr，DMAP，THF，0至22℃，3h。

最后，制备肟衍生物7a，并且从六氯环戊二烯1制备二甲氧基类似物7b(方案4)。¹³

方案4.试剂和条件：(1)羟胺HCl，KOH，MeOH，回流，8h；(b)KOH，MeOH，22℃，18h。

实施例2：化学合成

下文描述了制备本发明的化合物的方法中使用的一般程序。

除非另外说明，否则所有反应均在露天条件下进行。在氩气氛下从二苯甲酮羰游基中蒸馏出四氢呋喃(THF)。在氩气氛下从氢化钙中蒸馏出甲醇、二氯甲烷(DCM)和三乙胺(TEA)。六氯环戊二烯购自中国的Chemieliva Pharmaceutical Co.，并且各种肼购自Sigma-Aldrich,Alfa Aesar和TCI，纯度≥95％，如果需要，根据文献程序纯化所有其他溶剂或试剂。在Bruker光谱仪上以500MHz记录¹H-NMR光谱，并且关于氘化溶剂信号(CHCl₃δ7.26；DMSOδ2.48ppm)进行报告。¹H NMR光谱的数据报告如下：化学位移(δppm)、多重性、偶合常数(Hz)和积分。分裂模式(splitting pattern)指定如下：s，单峰；d，双重峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，双双重峰；dt，双三重峰；td，三双重峰；tt，三三重峰；qd，四双重峰；qt，四三重峰；m，多重峰；以及br，宽峰。在Bruker光谱仪上以125MHz记录¹³C-NMR光谱，并且关于氘化溶剂信号(CHCl₃δ77.0；DMSOδ40.0ppm)进行报告。在Bruker光谱仪上以376.3MHz记录¹⁹F-NMR光谱，并且关于苯中的外部氟利昂-113进行报告(δ-73.75ppm)。根据化学位移报告¹³C和¹⁹F NMR光谱的数据。化学位移以百万分率(ppm，δ)报告。使用Buchi B-545熔点装置获得熔点并且未经校正。在UV光(254和365nm)下用硅胶TLC板监测反应，然后用茚三酮或磷钼酸染色溶液进行可视化。在硅胶60，230-400目上进行柱色谱。在配备有ID-CUBE离子源和Vapur界面(IonSense)的Thermo Exactive Plus MSD(Thermo Scientific)上收集DART-HRMS光谱。源极和MSD均通过Excalibur，3.0版控制。化合物的纯度通过高场质子和碳NMR测定并且为≥95％。

(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(B)。在0℃下，向六氯-环戊二烯(1.6mL，10.0mmol，1.0当量)在四氢呋喃(50mL)中的溶液滴加一水合肼(1.45mL，30.0mmol，3.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌10min，然后真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈红棕色固体的所需产物B(1.44g，62％)：Rf＝0.4(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 187-189℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ10.67(d,J＝3.2Hz,1H),9.93(d,J＝3.6Hz,1H)；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.09(br,2H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz)δ129.2,125.6,119.8,118.2,104.2；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ132.7,131.2,124.6,119.5,105.8ppm；DART-HRMS实测值230.88672[M+H]⁺，对于C₅H₃Cl₄N₂的计算值230.90448。

用于合成烷基和芳基腙的代表性程序。

方法A.1,1-二甲基-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3a)。在0℃下，向六氯环戊二烯(0.16mL，1.0mmol，1.0当量)在四氢呋喃(10mL)中的溶液滴加不对称二甲基肼(0.23mL，3.0mmol，3.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(80mL)稀释并且用水(2X 20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈深棕色固体的所需产物3a(254mg，98％)：Rf＝0.45(己烷/乙酸乙酯，3:1，v/v)；mp69-71℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ3.59(s,6H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ129.5,128.4,121.8,119.4,103.0,50.5ppm；DART-HRMS实测值258.93448[M+H]⁺，对于C₇H₇Cl₄N₂的计算值258.93634。

1-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)-2-苯基肼(3d)。深棕色固体(94％产率)：Rf＝0.65(己烷/乙酸乙酯，3:1，v/v)；mp 130-131℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.7(s,1H),7.40(td,J＝7.5,1.5Hz,2H),7.34(dd,J＝9.0,1.0Hz,2H),7.15(tt,J＝7.5,1.0Hz,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ141.4,130.94,130.91,129.7,124.9,123.9,119.4,115.1,104.9ppm；DART-HRMS实测值306.91754[M+H]⁺，对于C₁₁H₇Cl₄N₂的计算值306.93634。

1-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)肼(3g)。红棕色固体(46％产率)：Rf＝0.45(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)；mp146-148℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.69(s,1H),7.53-7.52(m,3H),7.38(d,J＝5.0Hz,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ142.0,132.2(q,J_CF＝32.0Hz,1C),130.3,126.9,125.2,124.8,122.6,121.1(q,J_CF＝3.5Hz,1C),119.8,117.9,111.7(q,J_CF＝3.8Hz,1C),105.4；¹⁹F NMR(CDCl₃,376MHz,¹H-dc)δ-62.90ppm；DART-HRMS实测值374.90492[M+H]⁺，对于C₁₂H₆Cl₄F₃N₂的计算值374.92372。

1-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)-2-(间甲苯基)肼(3h)。红棕色固体(32％产率)：Rf＝0.65(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 139-141℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ11.55(s,1H),7.36(s,1H),7.34(d,J＝9.0Hz,1H),7.30(t,J＝7.5Hz,1H),7.00(d,J＝7.5Hz,1H)；¹³CNMR(CDCl₃,125MHz)δ141.4,139.8,130.8,130.7,129.5,125.9,123.7,119.3,115.6,112.3,104.8,21.5ppm；DART-HRMS实测值320.93277[M+H]⁺，对于C₁₂H₈Cl₄N₂的计算值320.95199。

方法B.1-环己基-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3b)。向环己基肼HCl(527mg，3.5mmol，3.5当量)在四氢呋喃(5mL)中的悬浮液添加三乙胺(0.49mL，3.5mmol，3.5当量)并且将混合物搅拌0.5h。在室温下向六氯环戊二烯(0.16mL，1.0mmol，1.0当量)在四氢呋喃(5mL)中的溶液添加先前通过过滤生成的游离形式的环己基肼。将反应混合物在室温下搅拌12h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(80mL)稀释并且用水(2X 20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(仅己烷)纯化，得到呈红棕色固体的所需产物3b(60mg，19％)：Rf＝0.5(仅己烷)；mp 79-81℃；¹HNMR(DMSO-d₆,500MHz)δ10.36(d,J＝4.0Hz,1H),3.61-3.56(m,1H),1.93-1.89(m,2H),1.76-1.72(m,2H),1.60-1.56(m,1H),1.53(qd,J＝12.5,3.5Hz,2H),1.31(qt,J＝12.5,3.5Hz,2H),1.13(qt,J＝12.5,3.5Hz,1H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz)δ127.3,124.6,118.7,117.2,103.5,61.4,31.6,25.3,24.7ppm；DART-HRMS实测值312.96460[M+H]⁺，对于C₁₁H₁₃Cl₄N₂的计算值312.98329。

1-(叔丁基)-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3c)。红色固体(5％产率)：Rf＝0.4(仅己烷)；mp 80-82℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ9.98(s,1H),1.34(s,9H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ127.3,125.1,119.1,117.3,103.9,59.2,28.2ppm；DART-HRMS实测值286.96594[M+H]⁺，对于C₉H₁₁Cl₄N₂的计算值286.96764。

1-(3,5-二氯苯基)-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3f)。棕色固体(16％产率)：Rf＝0.6(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 188-190℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.52(s,1H),7.22(d,J＝2.0Hz,2H),7.10(t,J＝2.0Hz,1H；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ143.3,136.2,133.0,132.7,125.7,124.3,119.9,113.4,105.6ppm；DART-HRMS实测值374.83957[M+H]⁺，对于C₁₁H₅Cl₄N₂的计算值374.85839。

方法C.1-(3-氟苯基)-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3e)。在室温下向六氯环戊二烯(0.16mL，1.0mmol，1.0当量)在吡啶(5mL)中的溶液添加3-氟苯基肼HCl(244mg，1.5mmol，1.5eq)。将反应混合物在室温下搅拌12h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(80mL)稀释并且用水(2X 20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(仅己烷)纯化，得到呈棕色固体的所需产物3e(212mg，65％)：Rf＝0.6(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 134-136℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.63(s,1H),7.33(dt,J＝6.5,8.5Hz,1H),7.15(dt,J＝10.0,2.0Hz,1H),7.01(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),6.83(td,J＝8.0,1.5Hz,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ163.8(d,J_CF＝245.3Hz,1C),143.2(d,J_CF＝10.4Hz,1C),131.9,131.7,131.0(d,J_CF＝9.4Hz,1C),124.8,119.7,1115.(d,J_CF＝21.5Hz,1C),110.7(d,J_CF＝2.9Hz,1C),105.3,102.3(d,J_CF＝26.8Hz,1C)；¹⁹FNMR(CDCl₃,376MHz,¹H-dc)δ-110.42ppm；DART-HRMS实测值324.90814[M+H]⁺，对于C₁₁H₆Cl₄FN₂的计算值324.92691。

1-(3-甲氧基苯基)-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3i)。红棕色固体(50％产率)：Rf＝0.4(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)；mp 123-125℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.66(s,1H),7.27(t,J＝8.0Hz,1H),6.96(s,1H),6.84(dd,J＝8.0,1.0Hz,1H),6.69(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),3.85(s,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ161.0,142.7,131.0,130.9,130.5,124.0,119.4,110.7,107.7,105.0,100.6,55.4ppm；DART-HRMS实测值336.92801[M+H]⁺，对于C₁₂H₈Cl₄N₂O的计算值336.94690。

1-(2-氟苯基)-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3j)。红棕色固体(52％产率)：Rf＝0.6(己烷/乙酸乙酯，20:1，v/v)；mp 120-122℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ11.16(s,1H),7.65(t,J＝8.0Hz,1H),7.36(dd,J＝10.0Hz,1H),7.29(t,J＝7.5Hz,1H),7.20(dd,J＝12.5,6.0Hz,1H),3.32(s,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ151.1(d,J_CF＝242.4Hz,1C),132.7,131.8,130.1,(d,J_CF＝8.4Hz,1C),125.3(d,J_CF＝3.5Hz,1C),124.8,124.6(d,J_CF＝7.3Hz,1C),119.5,115.6,115.5(d,J_CF＝17.4Hz,1C),105.6；¹⁹F NMR(CDCl₃,376MHz,¹H-dc)δ-135.16ppm；DART-HRMS实测值324.90775[M+H]⁺，对于C₁₁H₆Cl₄FN₂的计算值324.92691。

1-(4-氟苯基)-2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(3k)。棕色固体(48％产率)：Rf＝0.6(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 147-149℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ11.64(s,1H),7.59-7.56(m,2H),7.30-7.26(m,2H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ160.0(d,J_CF＝243.3Hz,1C),137.8,131.0,130.9,124.1,119.4,116.5(d,J_CF＝23.1Hz,1C),116.4(d,J_CF＝7.9Hz,1C),104.9；¹⁹F NMR(CDCl₃,376MHz,¹H-dc)δ-117.44ppm；DART-HRMS实测值324.90593[M+H]⁺，对于C₁₁H₆Cl₄FN₂的计算值324.92691。

2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)-1,1-二苯基肼(3l)。深红色固体(78％产率)：Rf＝0.6(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)；mp 128-130℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ7.48(t,J＝7.5Hz,4H),7.37(t,J＝7.0Hz,2H),7.34(d,J＝7.5Hz,4H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz)δ146.5,132.2,131.7,130.4,128.3,123.6,123.0,121.7,106.4ppm；DART-HRMS实测值381.95616[M]⁺，对于C₁₇H₁₀Cl₄N₂的计算值381.95981。

用于合成单酰腙和二酰腙的代表性程序。

方法A.N'-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)苯甲酰肼(4a)。在冰浴中向(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(B，116mg，0.5mmol，1.0当量)在四氢呋喃(10mL)中的溶液滴加苯甲酸酐(113mg，0.5mmol，1.0当量)和三乙胺(0.07mL，0.5mmol，1.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(150mL)稀释并且用水(2X 50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈棕色固体的所需产物4a(239mg，71％)：Rf＝0.45(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 170-172℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ11.98(s,1H),7.93(d,J＝7.5Hz,2H),7.69(t,J＝7.5Hz,1H),7.59(t,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz)δ164.8,140.8,135.0,133.7,132.1,129.5,129.3,128.7,120.8,109.7ppm；DART-HRMS实测值334.91239[M+H]⁺，对于C₁₂H₇Cl₄N₂O的计算值334.93125。

N-苯甲酰-N'-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)苯甲酰肼(4b)。深棕色固体(52％产率)：Rf＝0.65(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 123-124℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ7.15(dd,J＝8.5,1.0Hz,2H),8.02(dd,J＝8.5,1.0Hz,2H),7.68(tt,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.56(t,J＝7.5Hz,1H),7.53(t,J＝7.5Hz,2H),7.48(t,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ162.1,151.0,149.4,137.7,134.4,132.6,132.5,130.6,130.0,128.9,128.8,128.1,127.6,120.2,112.4ppm；DART-HRMS实测值438.93702[M+H]⁺，对于C₁₉H₁₁Cl₄N₂O₂的计算值438.95747。

N'-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)乙酰肼(4c)。棕色固体(89％产率)：Rf＝0.7(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 145-147℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.62(s,1H),2.42(s,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ173.6,136.3,135.1,129.1,120.9,107.5,19.6ppm；DART-HRMS实测值272.89722[M+H]⁺，对于C₇H₄Cl₄N₂O的计算值272.91560。

N'-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)特戊酸酰肼(4d)。红棕色固体(71％产率)：Rf＝0.5(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 156-158℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ11.17(s,1H),1.24(s,9H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz)δ175.4,139.5,134.5,128.7,120.7,109.3,39.3,27.0ppm；DART-HRMS实测值314.94314[M+H]⁺，对于C₁₀H₁₁Cl₄N₂O的计算值314.96255。

4-氟-N-(4-氟苯甲酰)-N'-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)苯甲酰肼(4e)。棕色固体(67％产率)：Rf＝0.75(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 126-128℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.17(dd,J＝8.5,5.0Hz,2H),8.03(dd,J＝9.0,5.0Hz,2H),7.20(t,J＝9.0Hz,2H),7.17(t,J＝8.5Hz,2H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ166.6(d,J_CF＝255.4Hz,1C),165.5(d,J_CF＝253.5Hz,1C),161.1,150.9,149.9,138.0,133.4(d,J_CF＝9.6Hz,1C),132.8,130.6(d,J_CF＝9.0Hz,1C),126.2(d,J_CF＝3.0Hz,1C),123.7(d,J_CF＝2.9Hz,1C),120.2,116.3(d,J_CF＝9.3Hz,1C),116.2(d,J_CF＝9.3Hz,1C),112.3；¹⁹F NMR(CDCl₃,376MHz,¹H-dc)δ-102.42,-105.37ppm；DART-HRMS实测值474.91973[M+H]⁺，对于C₁₉H₉Cl₄F₂N₂O₂的计算值474.93862。

4-甲基-N-(4-甲基苯甲酰)-N'-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)苯甲酰肼(4f)。棕色固体(48％产率)：Rf＝0.75(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 147-149℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.03(d,J＝8.0Hz,2H),7.91(d,J＝8.0Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),7.27(d,J＝10.5Hz,2H),2.46(s,3H),2.42(s,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ162.2,151.8,149.4,145.3,143.3,137.5,132.3,130.7,129.7,129.5,128.2,127.4,127.9,120.2,112.3ppm；DART-HRMS实测值466.97013[M+H]⁺，对于C₂₁H₁₅Cl₄N₂O₂的计算值466.98877。

方法B.2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼-1-羧酸叔丁酯(4g)。在室温下向(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼(B，116mg，0.5mmol，1.0当量)在四氢呋喃(10mL)中的溶液添加吡啶(0.04mL，0.5mmol，1.0当量)和4-二甲基氨基吡啶(12mg，0.1mmol，0.2当量)并且将混合物在冰浴中冷却。在0℃下向混合物滴加在四氢呋喃(2mL)中的二碳酸二叔丁酯(164mg，0.75mmol，1.5当量)。移去冰浴并且将反应混合物温热至室温并在室温下搅拌16h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(100mL)稀释并且用水(2X 30mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，20:1，v/v)纯化，得到呈橙色固体的所需产物4h(90mg，54％)：Rf＝0.5(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 108-110℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.22(s,1H),1.56(s,9H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ150.5,135.9,135.7,128.2,121.4,107.2,84.2,28.0ppm；DART-HRMS实测值330.95319[M+H]⁺，对于C₁₀H₁₁Cl₄N₂O₂的计算值330.95747。

2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼-1-羧酸丙-2-炔-1-基酯(4h)。红色固体(19％和30％RSM)：Rf＝0.5(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 170-172℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.37(s,1H),4.91(d,J＝2.5Hz,2H),2.58(t,J＝2.5Hz,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ151.3,137.4,136.9,129.2,121.5,107.4,76.5,76.3,54.6ppm；DART-HRMS实测值312.90698[M+H]⁺，对于C₉H₅Cl₄N₂O₂的计算值312.91052

2-(全氯环戊-2,4-二烯-1-亚基)肼-1-羧酸2-甲基丁-3-炔-2-基酯(4i)。红色固体(50％产率)：Rf＝0.5(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 143-145℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ10.27(s,1H),2.62(s,1H),1.80(s,6H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ149.9,136.6,136.2,128.6,121.5,107.3,83.5,75.2,73.6,28.9ppm；DART-HRMS实测值340.98938[M+H]⁺，对于C₁₁H₉Cl₄N₂O₂的计算值340.94182。

(9H-芴-9-亚基)肼(6a)。在室温下向芴-9-酮(360mg，2.0mmol，1.0当量)的乙醇(10mL)溶液滴加一水合肼(0.29mL，6.0mmol，3.0当量)。将反应混合物回流6h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(100mL)稀释并且用水(2X 30mL)和盐水(40mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈黄色固体的所需产物6a(315mg，81％)：Rf＝0.15(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)；mp152-154℃；1H NMR(CDCl₃,500MHz)δ7.91(d,J＝7.5Hz,1H),7.77(d,J＝7.5Hz,1H),7.73(d,J＝7.0Hz,1H),7.65(d,J＝7.5Hz,1H),7.44(t,J＝7.5Hz,1H),7.37-7.29(d,3H),6.41(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ145.6,141.3,138.6,137.7,130.2,129.7,128.5,127.9,127.7,125.5,120.8,120.5,119.5ppm；DART-HRMS实测值195.09088[M+H]⁺，对于C₁₃H₁₁N₂的计算值195.09222。

(9H-呫吨-9-亚基)肼(6b)。黄色固体(21％产率)：Rf＝0.3(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 126-128℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(d,J＝7.5Hz,1H),7.43(t,J＝7.5Hz,1H),7.34-7.30(m,2H),7.21(t,J＝7.5Hz,1H),7.18-7.15(m,2H),5.80(br,2H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ154.0,151.8,135.9,130.8,129.4,127.4,124.1,123.9,123.3,122.6,118.2,117.5,116.5ppm；DART-HRMS实测值211.08521[M+H]⁺，对于C₁₃H₁₁N₂O的计算值211.08714。

1-(9H-芴-9-亚基)-2-(3-氟苯基)肼(6d)。向3-氟苯基肼HCl(325mg，2.0mmol，2.0当量)的乙醇(10mL)悬浮液添加三乙胺(0.29mL，2.1mmol，2.1当量)，并且将混合物搅拌0.5h。向反应混合物添加芴-9-酮(180mg，1.0mmol，1.0当量)并且回流24h。完成后，将混合物真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(100mL)稀释并且用水(2X 30mL)和盐水(40mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈棕色固体的所需产物6d(242mg，84％)：Rf＝0.4(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 159-161℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.80(s,1H),7.90-7.88(m,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.78(d,J＝7.5Hz,1H),7.66-7.65(m,1H),7.45(td,J＝7.5,0.5Hz,1H),7.39-7.27(m,4H),7.18(dt,J＝11.0,2.5,1H),6.98(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.68(td,J＝8.5,2.5Hz,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ164.0(d,J_CF＝242.8Hz,1C),146.2(d,J_CF＝10.6Hz,1C),141.5,141.0,138.1,137.7,130.5(d,J_CF＝9.8Hz,1C),130.1,129.8,128.5,128.0,127.6,124.4,121.1,120.9,119.6,109.3(d,J_CF＝2.5Hz,1C),108.2(d,J_CF＝21.6Hz,1C),101.0(d,J_CF＝26.5Hz,1C)ppm；DART-HRMS实测值289.11254[M+H]⁺，对于C₁₉H₁₄FN₂的计算值289.11355。

2-(9H-芴-9-亚基)肼-1-羧酸叔丁酯(6e)。在室温下向(9H-芴-9-亚基)肼(6a，97mg，0.5mmol，1.0当量)在四氢呋喃(8mL)中的溶液添加吡啶(0.04mL，0.5mmol，1.0当量)和DMAP(12mg，0.1mmol，0.2当量)并且将混合物用冰浴冷却。在0℃下向混合物滴加在四氢呋喃(2mL)中的二碳酸二叔丁酯(164mg，0.75mmol，1.5当量)。移去冰浴并且将反应混合物温热至室温并在室温下搅拌3h，然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯(100mL)稀释并且用水(2X 30mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈黄色固体的所需产物6e(96mg，65％)：Rf＝0.5(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 106-107℃；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.85(s,1H),7.93(d,J＝7.5Hz,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.74(d,J＝7.5Hz,1H),7.61(d,J＝7.5Hz,1H),7.47(t,J＝7.5Hz,1H),7.38-7.35(m,2H),7.31(t,J＝7.5Hz,1H),1.61(s,9H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ152.8,146.1,142.4,139.1,137.1,130.9,129.9,129.8,128.3,127.9,125.3,122.3,120.9,119.5,82.4,28.3ppm；DART-HRMS实测值295.14353[M+H]⁺，对于C₁₈H₁₉N₂O₂的计算值295.14353。

2,3,4,5-四氯环戊-2,4-二烯-1-酮肟(7a)。在室温下向50mL圆底烧瓶中的羟胺HCl(417mg，6.0mmol，6.0当量)添加甲醇(5mL)和甲醇(5mL)中的氢氧化钾(337mL，6.0mmol，6.0当量)并且将混合物搅拌1h。然后过滤所产生的KCl，并且将羟胺溶液滴加到甲醇(5mL)中的六氯环戊二烯(0.16mL，1.0mmol，1.0当量)，并且将混合物回流6h。在消耗所有六氯环戊二烯后，将混合物真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈红棕色固体的所需产物7a(80mg，34％)：Rf＝0.5(己烷/乙酸乙酯，5:1，v/v)；mp 178-180℃；¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ14.52(s,1H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz)δ145.8,134.2,128.3,119.0,109.3ppm；DART-HRMS实测值231.87045[M+H]⁺，对于C₅HCl₄NO的计算值231.88905。

1,2,3,4-四氯-5,5-二甲氧基环戊-1,3-二烯(7b)。在室温下向六氯环戊二烯(0.48mL，3.0mmol，1.0eq)的甲醇(5mL)溶液滴加甲醇(5mL)中的氢氧化钾(370mL，6.6mmol，2.2当量)，持续30min。将混合物搅拌18h并且将混合物倒至碎冰(70mL)。在冰已融化后，用二氯甲烷(3X 100mL)萃取混合物。将有机层用盐水(100mL)和MgSO4干燥、过滤且真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)纯化，得到呈淡棕色油的所需产物7b(230mg，29％)：Rf＝0.15(己烷/乙酸乙酯，10:1，v/v)；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ3.34(s,6H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ129.4,128.5,104.8,51.9ppm。

实施例3-生物结果和讨论

在针对TORC1活性的测定中，将第一组类似物3a-3f和4a-4b与母体化合物B进行比较。将8226细胞系用于这些实验，因为它展示出DEPTOR的显著过表达。^1,3作为阻止mTOR抑制剂DEPTOR与mTOR结合的药物，有效药物应当增加mTOR激酶活性。在mTORC1中，mTOR使p70S6激酶磷酸化。因此，蛋白质印迹用于测试该二次筛选中p70磷酸化的诱导。在0.5、1和2uM下，并且体外暴露6小时来测试化合物。当以1或2uM使用时，除了单-苯甲酰化的化合物4a(其具有毒性并显示出p70的降解)，所有8种衍生物对p70磷酸化的诱导与母体化合物B的诱导相当。然而，在0.5uM下，三种N-芳基化合物3d-3f和二苯甲酰化化合物4b比母体化合物B更有效地诱导p70磷酸化(图3A中所示的选择的免疫印迹)。相比之下，与化合物B相比，N-烷基化合物3a-3b没有表现出显著的活性增加，而叔丁基化合物3c仅显示出中等的活性。同样，单-苯甲酰化化合物4a具有毒性，甚至在这种低浓度(0.5uM)下也观察到相当多的细胞死亡。在未显示出毒性的较低浓度(0.05-0.2uM)下对化合物4a的后续实验证实p70磷酸化没有增强，这表明化合物4a具有非特异性毒性。来自4次独立实验(其中衍生物以0.5uM使用)的p70磷酸化数据的汇总示出在图3B中。还在48小时MTT测定中针对对相同8226MM细胞系的细胞毒性筛选这些前8种衍生物。这些测定的IC₅₀示出在图3B中的条形图下方，并且一个实验的实例示出在图3C中。通常，类似物显示出分子效应(即增加p70磷酸化的能力)与其抗MM细胞毒性效应之间的相关性。与母体化合物B相比具有增强的分子效应的四种类似物(4b、3d、3e和3f)也显示出较低的IC₅₀。相反，与母体化合物B相比，显示出很少或没有显示出p70磷酸化增强的化合物(3a-3c)对抗MM细胞毒性也没有增强。如上所述，化合物4a具有细胞毒性，而对p70磷酸化没有影响；因此，它的抗MM效应被认为是非特异性的。

基于第一组类似物3a-3f和4a-4b的初始结果，设计并合成了四个类别中的其他类似物，并且评价了它们在p70磷酸化和MTT测定中的分子活性和抗MM细胞毒活性。在处理6小时的8226细胞中测量P70磷酸化。由于母体化合物B在8226细胞暴露于0.5uM后始终无效诱导p70磷酸化，因此使用0.5uM浓度来针对增强的分子活性筛选这些另外的衍生物。MTT(48小时)测定利用了8226细胞以及另外的过表达DEPTOR的MM细胞系MM1.S。一般来讲，MM1.S细胞对母体化合物B的细胞毒活性的敏感性低于8226(对于8226和MM1.S，IC₅₀分别为1.3uM和3.0uM)。所有衍生物的结构和生物活性示出在表1-4中，按结构修饰进行分类。

表1.烷基和芳基类似物3a-l的p70磷酸化和细胞毒性

a)倍数增加，在0.5uM下测量。

首先，由于三种N-芳基化化合物3d-3f显示出有希望的结果，因此制备了在苯环3g-3i的3位上具有吸电子基团或给电子基团的芳基衍生物，以更详细地检查腙上苯基取代基的影响。表1示出化合物3a-3l的p70磷酸化和MTT测定结果。最佳活性是3-三氟甲基苯基类似物3g，即p70磷酸化增加4倍，并且8226和MM1.S MM细胞系的IC₅₀分别为0.17uM和1.0uM。具有给电子基团的类似物3h-3i没有显示出良好的活性。一般来讲，具有更多吸电子取代基的类似物显示出最佳活性，例如3g和3k。还检查了取代基位置的影响。尽管3-氟和4-氟类似物3e和3k在8226和MM1.S细胞系中显示出相似的IC₅₀值，但奇怪的是，4-氟类似物3k在p70磷酸化测定中显示出更好的活性，而2-氟类似物3j显示无活性。最后，二苯基类似物3l没有显示出任何活性。

表2.酰基和氨基甲酸酯衍生物4a-4i的p70磷酸化和细胞毒性

a)倍数增加，在0.5uM下测量；ND，未测定的。

接下来，检查了一系列单-和二-酰基衍生物4a-4f的类似物以及一些氨基甲酸酯衍生物4g-4i(表2)。通过MTT测定再次显示单苯甲酰化类似物4a的假定的非特异性毒性，其中对于8226和MM1.S，IC₅₀值分别为0.6和0.8uM。单乙酰化类似物4c与化合物B处理相比也显示在0.5uM下p70磷酸化没有增加，并且显示出对8226细胞相似的细胞毒性(相比于药物B)。另一方面，单新戊酰化类似物4d显示p70磷酸化显著增加7倍，这与MTT测定中针对两种细胞系的IC₅₀值降低恰好相关，所述IC₅₀值对于8226和MM1.S分别为0.12和2.0uM。

由于N-二苯甲酰化化合物4b在初始测试中非常有希望，因此制备两种另外的二苯甲酰化化合物，其在苯环的4位上具有不同的取代基。如所预期的，化合物4e和4f均显示出p70磷酸化和MTT测定的良好结果。此外，与芳基衍生物的结果一致，在4位上具有吸电子取代基的化合物4e显示出比其他两种二酰基衍生物更好的结果。还制备并检查了氨基甲酸酯衍生物4g-4i。叔丁基氧基羰基类似物4g显示p70磷酸化显著增加6倍并且还显示出增强的细胞毒性，IC₅₀对于8226和MM1.S分别为0.1和0.6uM。制备具有末端乙炔的其他氨基甲酸酯衍生物4h和4i，以用于通过点击化学可能地进一步研究生物素蛋白标记，但是这些化合物显示出mTORC1激活的最小增加。只有简单的炔丙基化合物4h在MTT测定中显示出一些细胞毒性。

比较具有叔丁基单元的三种类似物，即烷基类似物3c、酰基类似物4d和氨基甲酸酯4g可能是有意义的。烷基类似物3c在p70磷酸化中显示出最小活性，而新戊酰基(叔丁基羰基)类似物4d和t-Boc(叔丁基氧基羰基)类似物4g在p70磷酸化和MTT测定中显示出非常好的活性。

表3.衍生物6a-6e的p70磷酸化、细胞毒性和细胞凋亡

a)倍数增加，在0.5uM下测量；ND，未测定的。

接下来，检查具有除四氯环戊二烯环系之外的环状和非环状部分的衍生物6a-6e(表3)。保留作为顶部单元的未取代肼不变化，并且将底部部分修饰为9-芴基6a、9-呫吨基6b和二苯甲酮6c。然而，这些新的类似物在p70磷酸化和MTT测定中均未显示出任何改善。由于3-氟苯基(3e)和t-Boc氨基甲酸酯(4g)类似物在以四氯环戊二烯作为底部单元的情况下显示出增强的生物活性，因此引入在9-芴基支架上的这些取代基以得到类似物6d和6e，但这些类似物由于仍不清楚的原因未显示出任何活性。

最后，检查肟和二甲氧基衍生物7a和7b并且它们在p70磷酸化和MTT细胞毒性测定中均显示出差的活性(表4)。

表4.衍生物7a-7b的p70磷酸化、细胞毒性和细胞凋亡

a)倍数增加，在0.5uM下测量；ND，未测定的。

每个类别中的所有衍生物在分子上成功的衍生物之间显示出粗略的相关性，即能够在0.5uM下增加p70磷酸化，并且是有效的细胞毒性化合物。在p70磷酸化测定中有活性的9种分子(3d、3e、3f、3g、3k、4b、4d、4e和4g)(与0.5uM的化合物B相比增加≥1.8x倍)中，与母体B相比全部均具有增强的细胞毒性效应(即，较低的IC₅₀)。在许多没有分子功效的化合物中(即，p70磷酸化增加<1.8x倍)，只有3种–4a、4f和4h展示出增强的细胞毒性效应，推测这是非特异性的。

根据这些筛选实验，类似物3g、3k、4d、4e和4g被鉴定为p70磷酸化测定中最具活性的化合物。然后更详细地研究这些。如图4A和4B中所示，虽然在1μM下诱导相当量的p70磷酸化，但与较低浓度的母体化合物B相比，这些生物化学修饰的化合物在低至0.25uM时显著更有效。DEPTOR敲低或母体化合物B的另外分子效应是p21表达的上调，^3,4，据信这是由p21靶向miRNA的TORC1依赖性表达降低引起的。³p21的上调表达有助于DEPTOR靶向的抗MM细胞毒性。³如图4C中所示，这些与母体化合物B相比具有增强的TORC1激活的衍生物中的一些也展示出增强的p21表达，进一步强化了它们的生物化学修饰允许更有效的DEPTOR靶向的观点。对于4d、4e、4g和3g清楚地显示这一点。图4D还展示出这些剂在8226MTT测定中增强的抗MM细胞毒性。测试了这些药物增强8226细胞的细胞凋亡的能力，并且如图4E中所示，与母体化合物B相比它们的细胞凋亡活性增强。

为了比较抗骨髓瘤功效与非特异性毒性，在其抑制8226MM细胞相对于正常外周血淋巴细胞(PBL)的存活的能力方面将这5种活性衍生物中的每一种与化合物B进行比较。在头对头(head-to-head)实验中，计算并比较每种靶标的IC₅₀值。如图5A中所示，尽管与化合物B相比，每种衍生物展示出对MM细胞的IC₅₀值显著降低，但它们也显示出对PBL的可变增强的毒性。然而，所述衍生物中的三种3g、3k和4g与母体化合物B相比显示出显著改善的治疗指数(TI)。为了进一步支持这三种活性衍生物(3g、3k和4g)诱导MM细胞死亡的能力与其成功干扰DEPTOR/mTOR结合和mTORC1激活特异性相关的事实，进行共免疫沉淀实验。化合物B当以1uM使用时阻止MM细胞中的DEPTOR/mTOR结合但以0.5uM使用时是无效的(图5B)。然而，具有增强的TI的所有三种衍生物当以0.5uM使用时均阻止了DEPTOR/mTOR结合(图5C)。还测试了这些衍生物在具有RAPTOR敲低的同基因系中的抗MM细胞毒性。图5D展示出RAPTOR敲低对mTORC1激活的抑制作用。最后，如图5E所示，当针对RAPTOR沉默的MM细胞进行测试时，MTT细胞毒性测定还证实了由所有三种衍生物诱导的细胞毒性显著降低，这提供了这些衍生物的分子效应与细胞毒性效应相关联的一些支持。

实施例4.生物测定

将以下测定方法用于鉴定和评价有效抑制DEPTOR的式(I)的化合物。

细胞系。8226和MM1.S骨髓瘤细胞系购自ATCC。细胞系通过FISH分析来表征并且显示含有MAF/Ig易位。蛋白质印迹确认了DEPTOR蛋白的显著过表达。对两个细胞系在过去6个月内进行了支原体测试并且均为阴性。蛋白质印迹测定-提取蛋白质并且如前所述通过12.5％SDS-PAGE分离(参见下文的更新参考文献)。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并且利用购自Cell Signaling(Beverly,MA)的特异性抗体检测它们的表达。

MTT测定。通过将在0.1ml完全培养基中的1-2x 10⁴个靶细胞接种到96孔微量滴定板的孔中来进行MTT测定。与化合物一起孵育后，用配备有570nm过滤器的微孔板ELISA读数器(microplate ELISA reader)测定由活细胞进行的MTT至甲臜的还原。对于每组运行一式四份的孔，并且每组的SD总是<平均值的5％。将结果表示为对照的％或存活率％，其中将实验组的OD与对照组(仅用DMSO孵育的细胞)的OD进行比较，其中将后者任意地安排为100％。

细胞凋亡测定。为了鉴定凋亡细胞，使用对激活的半胱天冬酶3(BD Biosciences)具有特异性的藻红蛋白(PE)缀合的抗体。对于染色，将10⁶个细胞用PBS洗涤并且用0.5mlcytofix/cytoperm溶液进行固定和透化。然后将细胞与PE缀合的单克隆抗半胱天冬酶3抗体的1:5稀释液一起孵育30分钟，并且通过流式细胞术分析。

RAPTOR敲低。靶向RAPTOR或乱序序列(scrambled sequence)(对照)的短发夹RNA(shRNA)/pLKO.1获自Addgene。慢病毒由UCLA Vector Core facility生产，并且稳定的细胞系通过用慢病毒转导细胞并在遗传霉素中选择来制备。

统计学分析。通过光密度测定法测定衍生化合物对p70磷酸化的诱导，比较磷酸化p70相对于总p70的免疫印迹信号。然后将该比例与由母体化合物B得到的比率进行比较，其中将后者比率任意地置于‘1’。使用一系列浓度的衍生物测定MTT细胞毒性的IC₅₀。通过减去由DMSO处理的培养物测定的对照细胞凋亡，通过流式细胞术计数药物处理的培养物中的细胞凋亡百分比。DMSO对照培养物中的细胞凋亡百分比(即，激活的半胱天冬酶3的阳性染色)总是<15％。

实施例5-骨髓瘤生长的异种移植肿瘤模型

简而言之，用5x 10⁶个8226细胞皮下激发小鼠，并且当骨髓瘤达到500mm³时，每日用DMSO、化合物B或化合物3g(在20mg/kg下)腹膜内(IP)治疗小鼠，持续4天。每天评估肿瘤大小(平均值+/-SD，n＝5)(图8A)。^*＝与对照(DMSO)不同，p<0.05，^**＝与化合物B不同，p<0.05。治疗4天后，处死小鼠并且分析外周血中的WBC、血细胞比容(HCT)、血红蛋白浓度(HgI)和血小板计数(图8B)。数据是对照的％(在DMSO-Rx'd小鼠中测定)，平均值+/-SD，n＝5。^*＝与DMSO对照不同，p<0.05。

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(7)For a discussion of the source of the color of these compounds andother analogues，see：Griffiths，J.；Lockwood，M.Chromogens based on Non-benzenoidAromatic Systems.Part III.Synthesis，Spectra，and Molecular OrbitalCalculations in the Substituted Fulvene and 6-AzafulveneSeries.J.Chem.Soc.Perkin Trans I 1976，48-54.

(8)A discussion of this novel finding will be the subiect of anupcoming manuscript.

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通过引用并入

本文提到的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，就如同具体且单独地指出每个单独的出版物或专利通过引用并入一样。在冲突的情况下，将以本申请(包括本文的任何定义)为准。

等同物

虽然已经讨论了本发明的具体实施方案，但是以上说明书是说明性的，并非限制性的。在回顾本说明书和下文的权利要求书之后，本发明的许多变型对于本领域技术人员而言将为显而易见的。本发明的整个范围应当通过参考权利要求书与其等效物的整个范围以及说明书连同此类变型来确定。

Claims (44)

1.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式I的结构

其中

A是任选取代的氨基、烷基氨基、环烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、酰氨基、二酰氨基、或

R¹、R²、R³和R⁴对于每次出现各自独立地是H、卤基或任选取代的烷基；并且

R⁵对于每次出现独立地是H或任选取代的烷基。

2.如权利要求1中任一项所述的化合物，其中R¹是卤基。

3.如权利要求2所述的化合物，其中R¹是Cl。

4.如任一项前述权利要求所述的化合物，其中R²是卤基。

5.如权利要求4所述的化合物，其中R²是Cl。

6.如任一项前述权利要求所述的化合物，其中R³是卤基。

7.如权利要求6所述的化合物，其中R³是Cl。

8.如任一项前述权利要求所述的化合物，其中R⁴是卤基。

9.如权利要求8所述的化合物，其中R⁴是Cl。

10.如任一项前述权利要求所述的化合物，其中R¹、R²、R³和R⁴各自为卤基，优选各自为F或Cl。

11.如任一项前述权利要求所述的化合物，其中A是-NHR⁶或-NR⁶R⁷；R⁶和R⁷对于每次出现各自独立地是任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。

12.如权利要求11所述的化合物，其中R⁶和R⁷对于每次出现各自独立地是任选取代的烷基或任选取代的芳基。

13.如权利要求12所述的化合物，其中R⁶和R⁷对于每次出现各自独立地是任选取代的苯基。

14.如权利要求13所述的化合物，其中所述取代基优选位于所述环的间位和对位。

15.如权利要求14所述的化合物，其中R⁶和R⁷对于每次出现各自独立地是

R⁸、R⁹和R¹⁰对于每次出现各自独立地是H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基或吸电子取代基。

16.如权利要求15所述的化合物，其中所述吸电子取代基是卤素或氰基、硝基、羰基或磺酰基。

17.如权利要求15所述的化合物，其中R⁸、R⁹和R¹⁰对于每次出现各自独立地是H、卤基或任选取代的烷基。

18.如权利要求17所述的化合物，其中R⁸和R⁹是H并且R¹⁰是卤基。

19.如权利要求17所述的化合物，其中R⁹是H并且R⁸和R¹⁰是卤基。

20.如权利要求17所述的化合物，其中R⁸和R⁹是H并且R¹⁰是任选取代的低级烷基。

21.如权利要求20所述的化合物，其中R¹⁰是-CH₃或-CF₃。

22.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中A是

R¹¹是任选取代的烷基或任选取代的芳基或杂芳基；并且

R¹²是任选取代的芳基或杂芳基。

23.如权利要求22所述的化合物，其中A是

24.如权利要求22或23所述的化合物，其中R¹¹是任选取代的烷基或苯基；并且

R¹²是任选取代的苯基。

25.如权利要求22-24中任一项所述的化合物，其中R¹¹是任选地被吸电子取代基取代的苯基。

26.如权利要求25所述的化合物，其中所述吸电子取代基是卤素或氰基、硝基、羰基或磺酰基。

27.如权利要求22-24中任一项所述的化合物，其中R¹¹是；并且R¹³是H、卤基或任选取代的烷基。

28.如权利要求27所述的化合物，其中R¹³是F。

29.如权利要求27所述的化合物，其中R¹³是任选取代的低级烷基。

30.如权利要求22-29中任一项所述的化合物，其中R¹¹和R¹²是相同的。

31.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中R⁵是任选取代的支链烷基。

32.如权利要求31所述的化合物，其中R⁵是低级烷基。

33.如权利要求31或32所述的化合物，其中R⁵是叔丁基。

34.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中A是

35.如权利要求34所述的化合物，其中A是

36.一种药物组合物，其包含如任一项前述权利要求所述的化合物和药学上可接受的载体。

37.一种治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-35中任一项所述的化合物或如权利要求36所述的组合物。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、甲状腺癌或肺癌。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤的细胞的特征在于DEPTOR的过表达。

41.一种抑制癌细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述癌细胞与如权利要求1-35中任一项所述的化合物或如权利要求36所述的组合物接触。

42.如权利要求41所述的方法，其中DEPTOR在所述癌细胞中过表达。

43.一种抑制细胞中的DEPTOR活性的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1-35中任一项所述的化合物或如权利要求36所述的组合物接触。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述细胞过表达DEPTOR。