CN109942826A - 一种氧化还原响应超支化聚壳多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氧化还原响应超支化聚壳多糖及其制备方法和应用。本发明采用含二硫键的双官能团试剂交联低分子量超支化聚合物，然后在该交联超支化聚合物骨架上接枝壳多糖，制备了含二硫键的超支化高分子骨架为内核、壳多糖为端基的氧化还原响应超支化聚壳多糖。本发明提供的氧化还原响应超支化聚壳多糖具有特殊的超支化结构，克服了原有线型壳聚糖的结构局限性，同时由于超支化聚壳多糖外围为pKa约6.5的壳多糖具有pH敏感电荷反转和氧化还原降解的环境响应特征。该环境响应超支化壳聚糖表现出优良的生物相容性和高效的基因递送性能，在基因治疗和基因编辑领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种氧化还原响应超支化聚壳多糖的药物和基因载体，具体地说，涉及一种氧化还原响应兼具pH响应的超支化壳多糖缀合物及其在基因药物递送领域的应用，属于药物递送领域新型药物载体的制备方法与技术。
背景技术
基因治疗通过将外源基因导入到靶细胞内以修复导致疾病的缺陷基因或者抑制导致疾病的有害基因，从而使机体恢复正常功能，达到治疗疾病的目的【1.中国发明专利，授权号ZL201010601008.5，发明名称为：用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用】。基因治疗技术为常规医疗手段难以治愈的疾病提供了新的治疗方法。基因编辑是指通过精确识别目标DNA片段中的靶点核苷酸序列，利用核酶内切酶等手段进行切割，形成DNA双链断裂，利用细胞体内的天然修复机制，完成基因敲出、插入和置换。分子生物学的发展和基因编辑技术的成熟，推动了基因治疗的临床应用，使其不仅在治疗遗传性先天疾病和恶性肿瘤等领域发挥优势，并且越来越广泛的应用于各种普遍性疾病的治疗。对于基因治疗和基因编辑来讲，临床应用的关键仍然在于开发安全、高效的基因递送载体。
壳多糖作为自然界中为数不多的碱性多糖，因具有良好的生物相容性和生物降解性，以及强的基因压缩能力，作为基因递送载体被广泛研究，然而壳多糖在生理pH条件下的难溶性限制了壳聚糖基因载体的进一步开发。超支化多糖是一类具有高度支化结构的多糖大分子，其分子内部存在很多空腔，外围则有大量功能化糖端基，超支化多糖这种独特的支化分子结构赋予它相对于传统超支化聚合物和线性聚多糖许多独特的功能，可用于超分子封装，在药物控制释放领域具有广泛的应用前景。由于超支化聚合物高度支化的分子结构，有利于打破壳聚糖分子链间的氢键，增加其溶解性，因此超支化壳多糖有望成为安全高效的基因载体，然而，迄今为止，自然界中尚未发现天然超支化聚壳多糖。
将糖等功能分子缀合到超支化聚合物上，构建超支化功能性缀合物，已解决临床及基础医学中的很多问题。在超支化聚合物末端缀合壳多糖，制备超支化聚壳多糖，有望解决传统壳多糖基因载体溶解性不好及由于链缠绕作用导致的细胞内基因释放困难这一问题。另一方面，人体病变部位(如肿瘤)的细胞外和细胞内存在明显的氧化还原环境差异，细胞外倾向于氧化性环境，以保持细胞膜蛋白等二硫键的稳定性，而细胞内则是过度表达的高浓度谷胱甘肽形成的还原性环境【2.Chem Soc Rev,2013,42(17):7289-325.Functionalblock copolymer assemblies responsive to tumor and intracellularmicroenvironments for site-specific drug delivery and enhanced imagingperformance】。同时，人体内还存在pH梯度差异，病变部位的pH值(<6.5)通常低于生理pH值(7.2～7.4)。因此可以利用病变部位细胞内外环境的氧化还原物质和酸性物质浓度的梯度差异，采用环境敏感的化学键设计具有环境刺激响应性能的超支化聚壳多糖基因载体有望进一步解决载体压缩与释放DNA的矛盾，实现对基因的控制释放，提高载体的基因递送效率。从目前文献的调研结果看，尚未有任何报道氧化还原响应超支化壳聚多糖及其在基因治疗和基因编辑领域的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有基因治疗和基因编辑载体的缺陷，提供一种氧化还原响应超支化聚壳多糖及其制备方法和应用。
本发明的发明构思是：本发明采用含二硫键的双官能团试剂交联低分子量超支化聚合物，然后在该交联超支化聚合物骨架上接枝壳多糖，制备了含二硫键的超支化高分子骨架为内核、壳多糖为端基的氧化还原响应超支化聚壳多糖。通过改变交联高分子骨架的类型和大小，以及高分子骨架、双官能团偶联试剂和壳多糖的投料比，可以合成不同结构的氧化还原响应超支化聚壳多糖。本发明提供的氧化还原响应超支化聚壳多糖具有特殊的超支化结构，克服了原有线型壳聚糖的结构局限性，同时由于超支化聚壳多糖外围为pKa约6.5的壳多糖、且具有二硫键交联的超支化聚合物内核，因此具有pH敏感电荷反转和氧化还原降解的环境响应特征。本发明还提供制备的氧化还原响应超支化聚壳多糖作为药物和基因载体的应用，该环境响应超支化壳聚糖表现出优良的生物相容性和高效的基因递送性能，在基因治疗和基因编辑领域具有广阔的应用前景。
本发明的目的在于提供一种氧化还原响应超支化聚壳多糖的制备方法：
首先将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯或者胱胺双丙烯酰胺双官能团偶联试剂溶解于二甲亚砜或者甲醇溶剂，搅拌状态下，缓慢滴加低分子量超支化聚乙烯亚胺、超支化聚酰胺胺、超支化聚赖氨酸中的一种的溶液，20～50℃反应0.5～5h，将反应液透析纯化并冷冻干燥，制备得到氧化还原超支化高分子骨架。然后将二酸二琥珀酰亚胺酯双官能团偶联试剂溶解于甲醇或者二甲亚砜溶剂，搅拌状态下，缓慢滴加1-5％壳多糖水溶液或DMF或DMSO，20～50℃反应0.5～5h，再缓慢滴加上述氧化还原超支化高分子骨架的水溶液，继续在20～50℃反应0.5～5h后，将反应液透析并经冷冻干燥，制备得到氧化还原响应超支化聚壳多糖。
进一步地，所述壳多糖的分子量Mw为300-3500Da，聚合度2-20；脱乙酰度为65-95％。所述氧化还原响应超支化聚合物骨架内核为由低分子量超支化聚乙烯亚胺、超支化聚酰胺胺、超支化聚赖氨酸中的一种通过二硫键交联形成，超支化聚乙烯亚胺、超支化聚酰胺胺、超支化聚赖氨酸结构上富含氨基，更易于交联形成超支化结构，对于低分子量超支化聚乙烯亚胺、超支化聚酰胺胺、超支化聚赖氨酸而言分子量越小，氧化还原响应越明显，毒性越低，但如果分子量过小反而不易于骨架的制备或很难形成超支化结构，造成超支化结构中空隙增多。因此，分子量需在Mw＝600～5000范围内。
进一步地，所述二酸二琥珀酰亚胺酯双官能团偶联试剂为双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双琥珀酰亚胺己二酸酯、双琥珀酰亚胺丁二酸酯中的一种或几种，二酸二琥珀酰亚胺酯双官能团偶联试剂或壳多糖的用量为超支化聚合物重复单元摩尔当量的0.1-1倍，优选为0.3-0.6倍，反应条件为20-50℃搅拌反应0.5～5h，优选为25～35℃、1～3h。
本发明还请求保护采用上述方法制备的氧化还原响应超支化聚壳多糖。
本发明同时请求保护所制备的氧化还原响应超支化聚壳多糖作为药物基因载体的应用，尤其是在基因递送中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明采用二硫键交联低分子量超支化聚合物制备氧化还原响应超支化聚合物，将其作为骨架内核，通过在其端基缀合壳多糖，制备了氧化还原响应超支化聚壳多糖。
2.本发明通过制备氧化还原响应超支化聚壳多糖，显著改善壳聚糖胞内基因释放能力和溶解性，并通过pH响应电荷反转性能，增强的药物基因递送载体，提高细胞摄入能力，循环稳定性和细胞粘附，增强对药物的控制释放能力，实现安全高效的基因递送。
附图说明
图1为实施例1所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖的FTIR谱图；
图2为实施例1所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖的1HNMR谱图；
图3为实施例1所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖与pGFP-N1复合物的TEM照片；
图4为实施例1和实施例3所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖对pGFP-N1的环境响应释放性能考察；其中，图4A为实施例1，图4B为实施例3；(0:marker,1:pDNA,lane 2-9：含10μg/μL DTT 0,1,2,4,6,8,10,12μL)；
图5为实施例1所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖与pGFP-N1形成的复合物对pH响应的细胞摄入性能考察；
图6为实施例1所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖转染pGFP-N1的结果；
图7为本发明实施例1和实施例3所制备氧化还原响应超支化聚壳多糖的细胞毒性，其中，A为实施例1在HeLa细胞中的毒性，B为实施例1在MCF-7细胞中的毒性，C为实施例3在HeLa细胞中的毒性，D为实施例3在MCF-7细胞中的毒性。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和附图仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g聚乙烯亚胺(MW＝1800Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例2
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g聚乙烯亚胺(MW＝600Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例3
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚酰胺胺(MW＝1430Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例4
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚酰胺胺(MW＝3256Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例5
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝1000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例6
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝2000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例7
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝3000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例8
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g聚乙烯亚胺(MW＝1800Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例9
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g聚乙烯亚胺(MW＝600Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例10
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚酰胺胺(MW＝1430Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例11
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚酰胺胺(MW＝3256Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例12
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝1000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例13
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝2000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例14
取0.006g胱胺双丙烯酰胺溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝3000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.4g二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例15
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g聚乙烯亚胺(MW＝1800Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.35g二(N-羟基琥珀酰亚胺)己二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例16
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g聚乙烯亚胺(MW＝600Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.35g二(N-羟基琥珀酰亚胺)己二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例17
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚酰胺胺(MW＝1430Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.35g二(N-羟基琥珀酰亚胺)己二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例18
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚酰胺胺(MW＝3256Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.35g二(N-羟基琥珀酰亚胺)己二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例19
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝1000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.35g二(N-羟基琥珀酰亚胺)己二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
实施例20
取0.012g 3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯溶于10mL二甲基亚砜，将0.5g超支化聚赖氨酸(MW＝2000Da)缓慢滴加到上述溶液中常温下反应3h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，再经冷冻干燥处理得到固体氧化还原响应超支化高分子。取0.35g二(N-羟基琥珀酰亚胺)己二酸酯溶于10mL二甲亚砜中，另取0.5g壳多糖(MW＝1000Da)溶于20mL超纯水中，在搅拌状态下缓慢滴加(滴加约30min)，取0.05g制备的氧化还原响应超支化高分子骨架溶于20mL超纯水中，再将此溶液缓慢滴加到上述溶液中(滴加约30min)，常温下搅拌反应4h，将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，去离子水透析后冷冻干燥处理，制得氧化还原响应超支化聚壳多糖ss-HBPC。
性能测试
由聚乙烯亚胺与3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯或者胱胺双丙烯酰胺双官能团偶联试剂构成的氧化还原响应超支化高分子骨架制备所得的ss-HBPC具有如下典型结构：
其中，R＝(CH2)n，n＝0～4。
以下性能测试以实施例1和实施例3制备所得ss-HBPC为例进行详细说明。氧化还原响应超支化聚壳多糖环境响应基因释放性能评价
采用琼脂糖凝胶电泳考察氧化还原响应超支化聚壳多糖环境刺激响应的pGFP-N1释放性能。新鲜制备复合物，加入不同浓度的二硫苏糖醇(DTT)，分别于37℃孵育1h后，再分别加入3μL的6×Loadingbuffer混合均匀，上样，于电压为90V，电流为45A下进行琼脂糖凝胶电泳实验。50min后停止，在凝胶成像系统下观察并拍照，通过观察pGFP-N1的荧光条带从点样孔中泳出的情况，评价氧化还原响应超支化聚壳多糖的环境响应基因释放性能，结果见图4所示。从图4可以看出，实施例1和实施例3所制备的氧化还原响应超支化聚壳多糖在DTT含量分别为8μL和6μL时，出现明显的pGFP-N1释放现象，说明实施例1和实施例3制备的超支化壳聚糖具有氧化还原响应释放pGFP-N1的性能。
氧化还原响应超支化聚壳多糖pH响应细胞摄入性能评价
将处于对数生长期的HeLa细胞接种于24孔板中，于37℃5％CO2培养箱中培养16-24小时，孔板内细胞长到约85％左右时进行加样实验处理。在加样前，用低糖DMEM培养基对孔板进行清洗，根据实验要求在孔内分别加入不同浓度的乳酸，调节pH为7.5、7.0、6.5、6.0，然后将孔板放入37℃5％CO2的培养箱中继续培养5h后，使用流式细胞仪对细胞摄入效率进行检测，结果见图5所示。从图5可以看出，pH＝7.5时，由于壳聚糖不带电荷，摄入率勉强达到40％，随着pH值的降低，摄入率逐渐增减，当pH＝6.0时，壳聚糖氨基向正电性转变，摄入率超过80％。该结果表明，本发明设计的氧化还原超支化聚壳多糖具有pH响应细胞摄入性能。
氧化还原响应超支化聚壳多糖基因递送效率评价
本实施例对超支化聚壳多糖进行基因递送效率评价，其中，递送效率评价中基因药物可采用pGFP-N1质粒为报告基因作为例子进行说明，对氧化还原响应超支化聚壳多糖载体的基因转运性能进行评价。选取实施例1所制备的超支化聚壳多糖，制备不同氮磷比(N/P)的ss-HBPC/pGFP-N1复合物，获得对pGFP-N1具有不同压缩程度的复合物粒子，采用透射电镜(TEM)对复合物粒子的粒径和形貌进行考察，图3给出了N/P＝4时复合物粒子典型的TEM图片。从图3可以看出，该复合物为200nm近球形形貌的粒子，可通过吞噬等途径进入细胞。将培养好的人源乳腺癌MCF-7细胞或人宫颈癌HeLa细胞铺板，在培养箱中培养至细胞融合度达到80％后，将完全培养基吸去，用PBS洗涤两次，加入ss-HBPC/pGFP-N1复合物，进行基因递送效率评价。血清条件下转运时，加入400μL含10％血清的培养基和不同N/P比(质量比)的HBPC(实施例1)与pGFP-N1的复合物(每孔含1μg pGFP-N1)，培养6h后，吸出培养基，换上新鲜的含10％血清的培养基继续培养48h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达量，结果见图6所示。从图6可以看出，实施例1制备的ss-HBPC在N/P为2～6时对HeLa和MCF-7细胞均具有良好的基因递送效率。
氧化还原响应超支化聚壳多糖细胞毒性评价
采用MTT法进行评价超支化聚壳多糖载体分别在HeLa和MCF-7中的细胞毒性，测定结果见图7所示。在96孔细胞培养板上种植细胞，平行3孔，每孔种植5×104个细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至细胞融合度达到85％以上。移去培养基，用PBS洗2次后，加入新鲜培养基、实施例1或实施例3所制备的超支化聚壳多糖，培养24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，37℃继续培养4h，移去培养基，终止培养。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT生成甲臢，每孔加入150μL DMSO使溶解，在37℃继续孵育30min。在多功能酶标仪(Sunrise Tecan)上测定570nm波长各孔的吸收值，检测前震动96孔板自动混匀600s，并采用无细胞的培养基对酶标仪调零。细胞存活率按公式1.1计算：
细胞存活率(％)＝A570SMP/A570CTL×100 (1.1)
其中A570SMP为加入待测载体或复合物的细胞孔板的吸光值，A570CTL为只含培养基的细胞孔板的吸光值。
检测根据图7的毒性评价结果，可以说明本发明制备的超支化聚壳多糖基因载体具有低的细胞毒性，适合用于进一步的体内研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种氧化还原响应超支化聚壳多糖的制备方法，其特征在于，首先将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯或者胱胺双丙烯酰胺双官能团偶联试剂溶解于二甲亚砜或者甲醇溶剂，搅拌状态下，缓慢滴加低分子量超支化聚乙烯亚胺、超支化聚酰胺胺、超支化聚赖氨酸中的一种的溶液，20～50℃反应0.5～5h，将反应液透析纯化并冷冻干燥，制备得到氧化还原超支化高分子骨架；
然后将二酸二琥珀酰亚胺酯双官能团偶联试剂溶解于甲醇或者二甲亚砜溶剂，搅拌状态下，缓慢滴加1-5％壳多糖水溶液或DMF或DMSO，20～50℃反应0.5～5h，再缓慢滴加上述氧化还原超支化高分子骨架的水溶液，继续在20～50℃反应0.5～5h后，将反应液透析并经冷冻干燥，制备得到氧化还原响应超支化聚壳多糖。
2.根据权利要求1所述的氧化还原响应超支化聚壳多糖的制备方法，其特征在于，所述壳多糖的分子量Mw为300-3500Da，聚合度2-20；脱乙酰度为65-95％。
3.根据权利要求1所述氧化还原响应超支化聚壳多糖的制备方法，其特征在于，所述氧化还原超支化高分子骨架内核由低分子量超支化聚乙烯亚胺、超支化聚酰胺胺、超支化聚赖氨酸中的一种通过二硫键交联形成，分子量Mw＝600～5000。
4.根据权利要求1所述的氧化还原响应超支化聚壳多糖的制备方法，其特征在于，所述二酸二琥珀酰亚胺酯双官能团偶联试剂为双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双琥珀酰亚胺己二酸酯、双琥珀酰亚胺丁二酸酯中的一种或几种，二酸二琥珀酰亚胺酯双官能团偶联试剂或壳多糖的用量为超支化聚合物重复单元摩尔当量的0.1-1倍，反应条件为20-50℃搅拌反应0.5～5h。
5.一种氧化还原响应超支化聚壳多糖是按照权利要求1所述方法制备的。
6.如权利要求1所述的氧化还原响应超支化聚壳多糖在药物基因载体上的应用。
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