CN109939122A

CN109939122A - 调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质的应用

Info

Publication number: CN109939122A
Application number: CN201910136592.2A
Authority: CN
Inventors: 柳满然; 侯懿烜; 赵茂嘉; 杜燕娥
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: International Institute Of In Vitro Diagnostics Chongqing Medical University
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-02-25
Also published as: CN109939122B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质在制备产品中的应用，一种药物组合物及一种体外非治疗性抑制癌细胞生长的方法。所述抑制调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质为miRNA6778‑5p shRNA或SHMT1 shRNA或经修饰的miRNA6778‑5p shRNA或经修饰的SHMT1 shRNA，所述药物组合物可有效抑制SHMT1基因表达和/或蛋白活性，抑制癌细胞生长；提供的所述一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质在制备产品中的多种应用有助于对癌症，尤其这是胃癌的治疗。

Description

调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质在制备产品中的应用，一种药物组合物及一种体外非治疗性抑制癌细胞生长的方法。

背景技术

胃癌(Gastric cancer,GC)是全球第五大最常见的恶性肿瘤，位居癌症相关死亡率的第三位；在我国，胃癌是继肺癌后导致肿瘤患者死亡的第二大原因。据全球癌症生存趋势监测计划(CONCORD3)最新数据：近年来胃癌发病率虽有所下降，但仍然是生存率最低的恶性肿瘤之一，患者5年生存率仅为30％-40％。

临床上，胃癌的诊断与治疗也面临着几个方面的难题，一是胃癌缺乏明确的早期诊断标志，患者被诊断时通常已发展为晚期，肿瘤恶性程度高、预后差；二是临床治疗手段有限，手术切除是目前治疗胃癌的主要方法，其他方法如放疗、化疗方案的选择和治疗效果有限；三是腹膜播散、血行播散和淋巴结转移是导致晚期患者死亡的主要原因。

肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)是存在于肿瘤组织中的一小部分类似于胚胎干细胞的细胞，具有自我更新、多向分化的能力，被认为是肿瘤起始、发展、转移、抵抗肿瘤治疗和复发的根源。

由于肿瘤干细胞的存在及其特有的生物学特征(如高致瘤、高转移、高药物耐受、多向分化潜能)，使得目前针对消除“快速分裂的肿瘤细胞”的治疗手段，在CSC面前几乎没有多少效用。因此，为了提高胃癌治疗率，对胃癌发生发展，尤其是对其肿瘤干细胞干性维持机制进行深入研究，寻找有效的分子干预靶点，是胃癌基础与临床研究的艰巨任务之一。

本发明申请人在对肿瘤干细胞干性维持机制的研究过程中，发现高表达的Drosha非依赖的miRNA6778-5p(miR6778-5p)靶向YWHAE，解除了对c-MYC的抑制作用，形成c-MYC对SHMT1转录的反馈调控，维持SHMT1的较高水平和活性；而SHMT1 则通过调控丝氨酸与甘氨酸转换参与胞质一碳代谢，影响和维持GCSC的干性以及抵抗 5-氟尿嘧啶等抗癌化疗药物的作用(如图1所示)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提出一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质在制备产品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质为miRNA6778-5p shRNA或SHMT1 shRNA或经修饰的miRNA6778-5p shRNA或经修饰的SHMT1 shRNA，所述产品功能选自下述中的至少一种：

1)下调SHMT1基因表达和/或蛋白活性；2)维持YWHAE对c-MYC的抑制作用； 3)降低胃癌干细胞的干性；4)降低对抗癌药物的耐药性；5)抑制癌细胞的生长和转移；6)促进癌细胞的凋亡。

进一步，所述癌细胞包括但不局限于胃癌细胞。

更进一步，所述胃癌细胞可为MGC-803、SGC-7901、NUGC-3。

优选为MGC-803细胞。

进一步，所述抗癌药物为5-氟尿嘧啶。

进一步，所述miR6778-5p来源于SHMT1内含子，所述miRNA6778-5p的 pre-miRNA的3’末端与其宿主基因SHMT1的5号内含子中的剪接受体相匹配，并且 miRNA6778-5p的pre-miRNA结构通常在剪接受体区域富含嘧啶碱基，且miRNA6778-5p 的pre-miRNA 3’末端有碱基突出。

本发明的目的之二在于提供一种药物组合物。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述药物组合物包括作为活性成分的一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质，所述一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质为miRNA6778-5p shRNA或 SHMT1shRNA或经修饰的miRNA6778-5p shRNA或经修饰的SHMT1 shRNA，所述药物组合物具有下述至少一种功效：

药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物优选被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/ 千克体重-约5毫克/千克体重。此外，还可与其他治疗剂(如抗肿瘤剂)一起使用(包括之前、之中或之后使用)。具体剂量应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。所述的药物组合物还可包括额外的抗癌药物。

需要的时候，在上述药物组合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

进一步，所述癌细胞包括但不局限于胃癌细胞。

更进一步，所述胃癌细胞可为MGC-803、SGC-7901、NUGC-3

优选为MGC-803细胞。

进一步，所述抗癌药物为5-氟尿嘧啶。

进一步，所述miRNA6778-5p来源于SHMT1内含子，所述miRNA6778-5p的 pre-miRNA的3’末端与其宿主基因SHMT1的5号内含子中的剪接受体相匹配，并且miRNA6778-5p的pre-miRNA结构通常在剪接受体区域富含嘧啶碱基，且miRNA6778-5p 的pre-miRNA 3’末端有碱基突出。

本发明的目的之三在于提供一种体外非治疗性抑制癌细胞生长的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种体外非治疗性抑制癌细胞生长的方法使用了所述药物组合物。

进一步，所述方法为在添加所述一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质的条件下，培养癌细胞，抑制SHMT1基因表达和/或蛋白活性，从而抑制癌细胞生长。

本发明的有益效果在于：

本发明经过试验验证证明所述新结构的miRNA6778-5p能维持SHMT1的较高水平和活性，SHMT1则通过调控丝氨酸与甘氨酸转换参与胞质一碳代谢，影响和维持GCSC 的干性以及抵抗替加氟等抗癌化疗药物的作用。

本发明提供的所述药物组合物可有效抑制SHMT1基因表达和/或蛋白活性，抑制癌细胞生长；提供的所述一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质在制备产品中的多种应用有助于对癌症，尤其这是胃癌的治疗。

附图说明

图1为SHMT1/miR6778-5p/SHMT1通路参与GCSC的干性的机制。

图2为miR6778-5p结构示意图。

图3：CHIP实验验证c-MYC可与SHMT1启动子区域结合。

图4：为双荧光素酶试验验证了c-MYC是SHMT1的转录调控基因。

图5为MGC-803/Drosha KD细胞中发现了c-MYC的mRNA水平的增高。

图6为MGC-803/Drosha KD细胞中发现了c-MYC的蛋白表达水平的增高。

图7为在Drosha KD胃癌细胞中干扰miR6778-5p的表达对胃癌干细胞形成的影响。

图8为在Drosha KD胃癌细胞中干扰miR6778-5p的表达对胃癌干细胞形成效率的影响。

图9为在Drosha KD胃癌细胞中干扰miR6778-5p的表达胃癌干细胞球体积的影响。

图10为在Drosha KD胃癌细胞中干扰miR6778-5p的表达对胃癌干细胞相关干性基因蛋白水平的影响。

图11为Drosha WT细胞中过表达miR6778-5p对胃癌干细胞形成的影响。

图12为Drosha WT细胞中过表达miR6778-5p对胃癌干细胞形成效率的影响。

图13为Drosha WT细胞中过表达miR6778-5p对胃癌干细胞球体积的影响。

图14为Drosha WT细胞中过表达miR6778-5p对胃癌干细胞相关干性基因蛋白水平的影响。

图15敲除miR6778-5p会抑制肿瘤的生长。

图16过表达YWHAE抑制GCSC成球能力验证。

图17敲低YWAHE促进GCSC成球能力验证.

图18 YWHAE沉默导致Drosha WT细胞中c-MYC和SHMT1蛋白水平增高。

图19过表达YWHAE显着降低Drosha KD细胞中c-MYC和SHMT1蛋白水平。

图20c-MYC和SHMT1的蛋白水平在Drosha和miRNA6778双重敲低的胃癌细胞中显着降低。

图21c-MYC和SHMT1的蛋白水平在miR6778-5p过表达的胃癌细胞中则显著增加。

图22胃癌肿瘤中发现SHMT1的高表达。

图23敲低SHMT1后胃癌干细胞相关基因蛋白表达量评估。

图24将SHMT1转染到MGC-803和SGC-7901细胞后胃癌干细胞相关基因蛋白表达量评估。

图25 SHMT1的敲低可以抑制肿瘤的形成。

图26为qRT-PCR检测SHMT2与MTHFD2的表达量。

图27为western blot检测SHMT2与MTHFD2的表达量。

图28为干细胞成球图(x100；Scale bar:100μm)。

图29为Drosha WT GCSC和Drosha KD GCSC中叶酸物质的相对水平。

图30为同位素示踪分析在含有[2,3,3-2H]-Serine的培养基中培养Drosha WT和Drosha KD胃癌干细胞衍生的相对M+1和M+2dTTP。

图31为同位素示踪分析在含有[2,3,3-2H]-Serine的培养基中培养相关GCSC，M+1和M+2dTTP的含量。

图32为同位素示踪分析在含有[2,3,3-2H]-Serine的培养基中培养相关GCSC，甲酰基-THF和5,10-mTHF的含量。

图33胃癌干细胞成球图。

图34qRT-PCR检测的胃肿瘤组织及其对照正常组织，5-FU敏感或耐受胃癌肿瘤中miR6778-5p，SHMT1和CD44水平。

图35体内成瘤实验。

图36为体内成瘤实验的肿瘤体积的数据分析。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实验条件和方法

细胞培养及干细胞培养

人胃癌MGC-803，MGC-803 Drosha knockdown敲掉(MGC-803/Drosha KD)细胞培养于含有10％FBS及1％双抗的DMEM培养基中。人胃癌SGC-7901及SGC-7901 Droshaknockdown敲掉(SGC-7901/Drosha KD)细胞培养于含10％FBS及1％双抗的1640 培养基中。并将细胞放于细胞孵育箱内(条件：37℃，5％CO2)生长，待细胞生长良好且密度到90％左右时，用胰酶消化细胞用于后续传代或冻存细胞。

用胰酶消化不同细胞系的胃癌细胞，用牛鲍计数板计数细胞：3X10⁴。将计数好的单个细胞悬液用含有0.4％BSA，20μl/ml B27，20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，10ng/ml表皮生长因子(EGF)和2μg/mL肝素的DMEM/F12干细胞培养基培养，4-7 天后收集细胞上清(MGC803：4-6天；SGC-7901：5-7天)，室温360r/min离心5min 收集上清中悬浮细胞球，用胰酶消化成单个细胞，3×10⁴个/ml单个细胞继续在无血清干细胞培养基中培养成第二代和第三代胃癌干细胞。

病毒构建及稳定细胞株的构建

人工分别合成microRNA6778-5p(miR6778-5p)及SHMT1成熟序列，经酶切、纯化、连接，克隆到pBABE-puro，经测序证实获得pBABE-miR6778-5p及p-BABE-SHMT1 过表达质粒。与病毒包被系统质粒分别构建miR6778-5p，SHMT1过表达逆转录病毒。同样地，人工合成特异靶向miR6778-5p，YWHAE的干扰序列，经退火、载体酶切线性化、纯化、连接，克隆到pLVX-sh1-puro；测序鉴定，构建pLVX-shRNA/miRNA6778-5p 及pLVX-shRNA/YWHAE干扰质粒，最终，获得miR6778-5p及YWHAE沉默表达慢病毒。pcDNA3-YWHAE过表达质粒是从Addgene网站上获得，而SHMT1及SHMT2 沉默表达慢病毒则购于汉恒生物科技(中国上海)。序列如下：

Gene name	Sequence
		miR6778-5p sh RNA	SEQ ID NO.1
SHMT1 shRNA 1#	SEQ ID NO.2
		SHMT1 sh RNA2#	SEQ ID NO.3
YWHAE shRNA	SEQ ID NO.4

用胰酶消化生长良好的胃癌细胞并计数，将1.0x10⁵/ml(MGC-803)或1.5x10⁵/ml(SGC-7901)细胞分别接种于6孔板中。待细胞贴壁后更换无双抗的培养基，加入 polybrene至终浓度为6μg/ml，再加入病毒进行培养，24h后更换新鲜培养基继续培养。 72h后，加入puromycin(MGC-803细胞：2μg/ml；SGC-7901细胞：3ug/ml)筛选细胞。连续培养7天后，将puromycin浓度减半继续培养直至14天，以获得稳定细胞株。

稳定细胞株：过表达细胞株：MGC-803/Drosha WT/miR6778-5p，MGC-803/DroshaWT/SHMT1，MGC-803/Drosha KD/YWHAE，SGC-7901/Drosha WT/miR6778-5p， SGC-7901/Drosha WT/SHMT1，SGC-7901/Drosha KD/YWHAE；敲低细胞株： MGC-803/Drosha WT/miR6778-5p KD，MGC-803/Drosha KD/miR6778-5p KD， MGC-803/Drosha KD/SHMT1 KD，MGC-803/Drosha WT/YWHAE KD，SGC-7901/Drosha WT/miR6778-5p KD，SGC-7901/DroshaKD/miR6778-5p KD，SGC-7901/Drosha KD/SHMT1 KD，SGC-7901/Drosha WT/YWHAE KD。

细胞蛋白及干细胞蛋白提取的提取

待细胞密度达90％时，弃去细胞培养基，用PBS洗涤3次，再加入PBS刮细胞于 10ml玻璃管中，离心收集细胞于1.5ml EP管(干细胞传代培养3次后，离心收集细胞于1.5ml EP管)。弃去PBS，将配制好的细胞裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)加入EP管内，冰上放置30min裂解细胞(每5min在震荡仪上震荡15s)。放入4℃高速离心机内离心(12000r/min，30min)。离心结束后，吸取上清液于新EP管内，加入5X Loading buffer缓冲液(上清液：缓冲液＝4:1)。将EP管置于100℃沸水中煮5min，然后放于-40℃保存。

蛋白浓度测定

根据待测蛋白管数及8个标准曲线管配制BCA工作液(A液：B液＝50:1)。

PBS(μl)	20	19	18	16	12	8	4	0
									蛋标(μl)	0	1	2	4	8	12	16	20

待测样本：2μl+18μl PBS

向每孔中加入200μl BCA工作液，将其放于37℃水浴箱40min。

取出96孔板，放入分光光度计中，562nm波长处检查吸光度。

细胞及干细胞RNA的提取

待细胞密度达90％时，弃去细胞培养基，用PBS洗涤3次，加入1ml Trizol于冰上裂解10min，刮下细胞并收集其于1.5ml EP管(干细胞传代培养3次后，离心收集细胞于1.5mlEP管，PBS洗涤2次，弃去PBS，加入1ml Trizol裂解细胞)。加入200μl氯仿萃取，剧烈震荡30s，冰上静置10min。将EP管放入4℃高速离心机中离离心 (12000r/min，15min)。吸取400μl上清液于新EP管内，再加入400μl异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min，然后再用4℃高速离心机(12000r/min，10min)。弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤，再离心(7500r/ml，5min)，共3次。DEPC水溶解混匀，测 RNA浓度。

RNA逆转录为cDNA检测

根据以下操作进行：

去除DNA

程序：42℃2min，4℃保存。

逆转录为cDNA

5x prime Script buffer	4ul
		Prime Script RT Enzyme	1ul
RT primer mix	1ul
		Stepl反应液	10ul
RNase-free H20	Up to 20ul

37℃15min，85℃5s，4℃保存。

qRT-PCR

设计各相关基因的引物，PCR反应体系如下：

SYBR premix Ex Taq II(2x)	10μL
		Forward primer	0.8μL
Reverse primer	0.8μL
		cDNA	2μL
ddH<sub>2</sub>O	up to 20μL

94℃30s，95℃10s，根据不同引物设置退火温度退火30s，72℃延伸20s，40个循环。

蛋白免疫印迹实验(western blot，WB)

将分离胶加入玻璃板中，静置30min。

将浓缩胶加入玻璃板，并插入梳齿。静置30min后，拔下梳齿，往内外槽中加入1XSDS缓冲液。

电泳：第一步：80mV，100mA，30min；第二步：100mV，100mA，2hour。

活化PVDF膜：甲醇15s，蒸馏水2min，之后放入转膜液内。

切胶：根据所需蛋白分子量大小剪切凝胶。

转膜：210mV，210mA，转膜时间根据蛋白分子量决定。

封闭：用5％脱脂牛奶封闭2h。

孵育抗体：TBS洗膜后，滴加稀释的一抗，4℃孵育过夜。16h后，用TBST及TBS 洗去一抗，滴加二抗，室温孵育2h。

显色：TBST及TBS洗膜后，加入发光底物，用凝胶成像仪曝光条带。

荧光素酶报告实验

(1)构建包含miR6778-5p及其靶基因YWHAE互补结合序列的野生型(WT)及突变型(MUT)荧光素酶报告质粒：

①利用TargetScan7.2数据库预测得到miR6778-5p与YWHAE3’UTR区域相互结合的序列，选取靶序列及其上下游60bp长度的序列，俩端加上酶切位点的粘性末端，构建野生型荧光素酶报告质粒。突变荧光素酶报告质粒只需将靶序列上任意碱基突变，其余与野生型相同。

GENE	Sequence
		WTYWHAE3'UTR	F:SEQ ID NO.5；R：SEQ ID NO.6
MUTYWHAE3'UTR	F:SEQ ID NO.7；R：SEQ ID NO.8

②酶切：将PMIR-report质粒酶切。

HindⅢ	1μl
		SpeⅠ	1μl
10xM buffer	1μl
		质粒	1μg
超纯水	加到10μl

放于37℃水浴箱水浴6-8h。

③酶切产物回收：运用TIANGEN试剂盒回收产物。

④合成退火片段：

10x无Mg2的PCR buffer	80μl
		超纯水	10μl
10xM buffer	1μl
		F	5μl
R	5μl

放入94℃水中，自然冷却至室温。

⑤连接退火片段和载体

T4连接酶	1μl
		10xT4连接酶buffer	1μl
H2O	加至10μl

震荡混匀，16℃连接过夜。

⑥转染感受态

将连接产物加入200μlDH5α感受态细菌中，冰上30min，42℃90s，再冰上2min。加入800μl不含抗生素的LB培养基，37℃震摇1h。弃去上层液体，留大约80μl重悬沉淀，将其涂于含有Amp的LB固体培养板上，37℃过夜。

⑦挑取单克隆细菌，并扩增。

⑧质粒提取：运用TIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，并送测序。

(2)构建具有c-MYC结合序列(WT)的SHMT1启动子或不具有c-MYC结合序列(MUT)的SHMT1启动子的荧光素酶报告质粒：操作同上。

(3)荧光素酶报告实验：

将细胞铺板于12孔板，待细胞密度达70％时，按照脂质体2000说明方法转染质粒。转染48h后，收集细胞，按Promega双荧光素酶试剂盒标准操作。

染色质免疫沉淀分析(CHIP)

使用chip Kit(Thermo，MA，USA)，用c-MYC和IgG抗体进行ChIP测定。用于扩增潜在SHMT1结合位点的引物如下：F:SEQ ID NO.9；R：SEQ ID NO.10。

动物实验

将胃癌干细胞(1×10⁵)与100μL PBS混合并皮下注射到4周龄雌性裸鼠中。每五天使用卡尺测量肿瘤体积(体积＝1/2[L×W²])。小鼠注射的细胞： MGC-803/Drosha KD/miR6778-5p KD，MGC-803/Drosha KD/SHMT1 KD和对照细胞MGC-803/Drosha KD。在给小鼠注射细胞5天后给予小鼠丝氨酸(0.8mM)和5-FU (30mg/kg)治疗。四周后，对动物实施安乐死。将肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中并进行免疫组织化学(IHC)。

组织包埋

组织固定且取材：将肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中。

脱水：将组织依次放入50％酒精—70％酒精—80％酒精—90％酒精—95％酒精—100％酒精—100％酒精，每次30min。

透明：将组织依次放入100％乙醇+二甲苯(1:1)—二甲苯，每次至少30min。

浸蜡：将组织依次放入二甲苯与石蜡混合液(1:1)，30min—石蜡(Ⅰ)、石蜡(Ⅱ)、石蜡(Ⅲ)总共2h。

包埋及切片：浸蜡后的组织块置于盛有熔化石蜡的模具中，并使之凝固成蜡块。随后在切片机上进行组织切片。

免疫组织化学(IHC)

脱蜡：将组织切片放入80℃烤箱30min。再将其分别按次序放入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，二甲苯Ⅲ中各10min。

水化：将组织片依次放入100％乙醇Ⅰ，100％乙醇Ⅱ，95％乙醇，75％乙醇，50％乙醇各5min。

抗原修复：将水化好的片子放入含有枸橼酸钠的液体中，高压下修复5min，然后待其自然冷却。

封闭：滴加过氧化物酶10min，PBS洗3次。再滴加山羊血清进行封闭，10min。

一抗孵育：滴加一抗，4℃过夜。

二抗孵育：孵育一抗16h后，PBS洗3次，再滴加生物素标记羊抗兔IgG工作液，室温15min。

显色底物孵育：PBS洗涤切片3次后，滴加HRP标记链霉亲和素工作液，室温孵育15min.

DAB显色：PBS洗涤切片3次后滴加足量新鲜配制的DAB溶液进行显色，显微镜下显色效果满意(即阳性部位棕色染色明显而背景未变黄时)后将切片置于清水中冲洗终止显色。

复染：苏木素复染5s，流水冲洗2min。

封片：滴加中性树脂封片。

代谢检测

同位素标记：将MGC-803细胞(1.5×10 5)接种在6孔板中并在DMEM中培养24 小时。用PBS洗涤细胞并更换为测定培养基(测定培养基成分：MEM(Invitrogen)， MEM维生素溶液(sigma)和D-葡萄糖溶液(sigma))。培养细胞3小时后，用含有同位素的测定培养基(成分：(MEM(Invitrogen)，MEM维生素溶液(sigma)，D- 葡萄糖溶液(sigma)和2,3,3-²H-丝氨酸(Cambridge Isotope))替换培养16h。

干细胞培养：使用无血清培养基干细胞培养基培养同位素处理过的细胞，并在提取代谢物之前每7天传代一次。

细胞送样前处理：小心地从6孔板收集细胞并离心以弃去上清液。用1ml冰冷的PBS洗涤后，向细胞混合物中加入0.4ml预冷的甲醇，并在-80℃静置30分钟，然后加入0.4mlddH2O。收集细胞，送上海谱领公司检测代谢物。

实施例1 MiR6778-5p来源鉴定

SHMT1 5号内含子突变质粒购买于复能公司。序列如下：

Gene name	Primer
		SHMT1	F:SEQ ID NO.11；R：SEQ ID NO.12
5'splicesite mutation	F:SEQ ID NO.13；R：SEQ ID NO.14
		3'splice site mutation	F:SEQ ID NO.15；R：SEQ ID NO.16

将上述质粒分别导入MGC-803胃癌细胞中；72h后，提取RNA；PCR扩增转入片段的转录前体，琼脂糖凝胶电泳分析野生型微小基因与突变型微小基因转录本的剪切情况；qRT-PCR检测细胞中miR6778-5p表达水平的改变，以进一步证实miR6778-5p 来源于SHMT1内含子。结果证明：与导入野生型微小基因相比，在导入突变型微小基因的胃癌细胞中，miR6778-5p的表达量是下调的，所述miR6778-5p的结构如图2所示， miRNA6778-5p是我们预测的5’tail mirtron，miRNA6778-5p的pre-miRNA的3’末端与其宿主基因SHMT1的5号内含子中的剪接受体(AG)相匹配，并且miR6778-5p的 pre-miRNA结构通常在AG剪接受体区域富含嘧啶碱基，除此之外，miR6778-5p的 pre-miRNA3’末端有碱基突出。

实施例2 c-MYC是SHMT1的转录调控基因

运用染色质免疫沉淀试验(CHIP)和双荧光素酶试验验证了c-MYC是SHMT1的转录调控基因(图3和图4)。同样地，我们在MGC-803/Drosha KD细胞中发现了c-MYC 的表达水平的增高(图5和图6)。

实施例3 miR6778-5p维持GCSC干性特征

之前的研究发现，核Drosha的丢失会影响胃癌细胞的侵袭及迁移。然而，同样也发现了胃癌细胞的生长和胃癌干细胞自我更新几乎没有变化，是miR6778-5p维持了 Drosha敲低的胃癌细胞的恶性特征。在Drosha KD胃癌细胞中干扰miR6778-5p的表达，显著降低了胃癌干细胞形成效率、球体积及相关干性基因蛋白水平，而在Drosha WT细胞中敲低miR6778-5p，胃癌干细胞形成效率、球体积及相关干性基因蛋白水平则轻微下降(图7-10)。随后，在Drosha WT细胞中过表达miR6778-5p，与对照组相比，胃癌干细胞球形成效率、球体积及相关干性基因蛋白水平增加(图11-14)。同样的，在老鼠体内也发现了敲除miR6778-5p会抑制肿瘤的生长(图15)。

实施例4 miR6778-5p的靶基因YWHAE

运用qRT-PCR验证发现YWHAE在Drosha敲低的细胞中降低最明显。运用TargetScan7.2数据库预测了miR6778-5p与YWAHE3’UTR处的结合位点，并运用荧光素酶报告实验及western blot验证了miR6778-5p对YWHAE的靶向调控。在Drosha敲低(Drosha KD)或Drosha野生型(Drosha WT)胃癌细胞中分别过表达YWHAE和敲低YWHAE，发现YWHAE可抑制GCSC的成球能力(图16-17)；YWHAE通过c-MYC 影响SHMT1的表达；YWHAE沉默导致Drosha WT细胞中c-MYC和SHMT1蛋白水平增高(图18)，而过表达YWHAE显着降低Drosha KD细胞中c-MYC和SHMT1蛋白水平(图19)。另外，c-MYC和SHMT1的蛋白水平在Drosha和miRNA6778双重敲低的胃癌细胞中显着降低(图20)，而在miR6778-5p过表达的胃癌细胞中则显著增加(图21)。

实施例5 SHMT1与GCSC干性特征

通过生物信息学，在胃癌肿瘤中发现SHMT1的高表达(图22)；在Drosha敲低(Drosha KD)或Drosha野生型(Drosha WT)胃癌细胞分别敲低SHMT1和过表达 SHMT1，发现敲低SHMT1后，可以降低GCSC的成球能力，而过表达SHMT1后，则增强了胃癌干细胞的成球能力(图23-24)；同样地，动物实验也证明SHMT1的敲低可以抑制肿瘤的形成(图25)。

实施例6 miR6778-5p调节SHMT1调控胃癌干细胞的细胞质一碳代谢

在Drosha敲低(Drosha KD)的胃癌干细胞中我们发现了SHMT2和MTHFD2的表达量的降低(图26-27)，而SHMT1则是增加的，这些发现提示Drosha非依赖性的 miR6778-5p可以通过调节YWHAE/SHMT1轴来调控胃癌干细胞的细胞质一碳代谢，而不是典型的线粒体一碳代谢。在胃癌Drosha KD细胞中敲低的miR6778-5p(标记为 miR KD)或SHMT1，干细胞成球能力和球体大小显着下降；然而，在Drosha-WT中则是敲低SHMT2才明显降低干细胞成球能力和球体大小；丝氨酸补充可以恢复胃癌干细胞成球能力，表明一碳代谢对胃癌干细胞形成很重要，并且Drosha KD后胞质一碳代谢取代了Drosha WT中线粒体一碳代谢对胃癌干细胞的维持作用中(图28)。采用同位素追踪，发现与Drosha WT相比，在Drosha KD的GCSC中检测更多的N5，N10-亚甲基四氢叶酸(5,10-mTHF)和M+2dTTP以及较少的10-甲酰基-THF和M+1dTTP(图 29-30)；在Drosha WT胃癌干细胞中敲低的SHMT2降低了M+1dTTP的生成，但是，在Drosha KD胃癌干细胞中敲低miR6778-5p，SHMT1或SHMT2不影响M+1dTTP的生成，相反，miR6778-5p，SHMT1或SHMT2的丢失对Drosha WT胃癌干细胞的M+2 dTTP几乎没有影响，但沉默miR6778-5p或SHMT1，则显着降低了Drosha KD胃癌干细胞中的M+2dTTP(图31)。对于甲酰基-THF和5,10-mTHF也有相似的结果(图 32)；

5-氟尿嘧啶(5-FU；一碳代谢破坏剂，即阻止dTTP合成)是胃癌化疗常用药，与Drosha KD的相比，5-FU可以降低Drosha WT GCSC的形成，沉默miR6778-5p或SHMT1 则可显著增加Drosha KD胃癌细胞对5-FU的敏感性(图33)；与癌旁组织相比，在胃癌组织中检测到高水平的SHMT1和CD44，并且与5-FU敏感性肿瘤相比，在5-FU抗性胃肿瘤中检测出更多的miR6778-5p，SHMT1和CD44(图34)，IHC和动物实验同样证实了上述体外实验的数据和结论，表明miR6778-5p-SHMT1信号轴介导的胞质一碳代谢对维持胃癌干细胞具有潜力(图35-36)。

实施例7药物组合物

药物组合物包括作为活性成分的抑制SHMT1基因表达和/或蛋白活性的物质，所述抑制SHMT1基因表达和/或蛋白活性的物质为miRNA6778-5p shRNA或SHMT1 shRNA 或经修饰的miRNA6778-5p shRNA或经修饰的SHMT1 shRNA，所述药物组合物具有以下功效：

所述药物组合物与生理盐水宜在无菌条件下制造成水针剂，具体剂量因病人健康状况等因素调整。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

acctgcctcc tgtcctccca ct 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

taggctcttg cttaaataat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aagctatgac tctggaattt t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ctgagtgaag aaagctata 19

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ctagtaggca gaccttgcct actttactct cccactctaa ggagacacat gcaccggaa 59

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agctttccgg tgcatgtgtc tccttagagt gggagagtam gttccgtagg tctgccta 58

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ctagtaggca gaccttgcct actttactga gggtgtctaa ggagacacat gcaccggaa 59

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

agctttccgg tgcatgtgtc tccttagaca ccctcagtma gttccgtagg tctgccta 58

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

acatagttag acccccatct c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

cgcgtgtgtg atagcatctc g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gctcccctgc aaactttgct 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ctgcgatgat cagcttcggg t 21

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ccttgcccta caagctaagc atgtgttgg 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

tagattcaaa gaagatggac gtggcagag 29

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

ccctgacatt ccacacgtga acccagatac 30

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

aggccaggtt caggctgctt cctcc 25

Claims

1.一种调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质在制备产品中的应用，其特征在于，所述抑制调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质为miRNA6778-5p shRNA或SHMT1 shRNA或经修饰的miRNA6778-5p shRNA或经修饰的SHMT1 shRNA，所述产品功能选自下述中的至少一种：

1)下调SHMT1基因表达和/或蛋白活性；2)维持YWHAE对c-MYC的抑制作用；3)降低胃癌干细胞的干性；4)降低对抗癌药物的耐药性；5)抑制癌细胞的生长和转移；6)促进癌细胞的凋亡。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌细胞包括但不局限于胃癌细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物为5-氟尿嘧啶。

4.根据权利要求1所述的应用，所述miRNA6778-5p来源于SHMT1内含子，所述miRNA6778-5p的pre-miRNA的3’末端与其宿主基因SHMT1的5号内含子中的剪接受体相匹配，并且miRNA6778-5p的pre-miRNA结构通常在剪接受体区域富含嘧啶碱基，且miRNA6778-5p的pre-miRNA 3’末端有碱基突出。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括作为活性成分的调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质，所述调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质为miRNA6778-5p shRNA或SHMT1 shRNA或经修饰的miRNA6778-5p shRNA或经修饰的SHMT1 shRNA，所述药物组合物具有下述至少一种功效：

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述癌细胞包括但不局限于胃癌细胞。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述抗癌药物为5-氟尿嘧啶。

8.根据权利要求5所述的组合物，所述miR6778-5p来源于SHMT1内含子，所述miRNA6778-5p的pre-miRNA的3’末端与其宿主基因SHMT1的5号内含子中的剪接受体相匹配，并且miRNA6778-5p的pre-miRNA结构通常在剪接受体区域富含嘧啶碱基，且miRNA6778-5p的pre-miRNA 3’末端有碱基突出。

9.一种体外非治疗性抑制癌细胞生长的方法，其特征在于，使用权利要求5-8任一项所述的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法为在添加所述调控一碳代谢影响肿瘤干细胞干性的物质的条件下，培养癌细胞，抑制SHMT1基因表达和/或蛋白活性，从而抑制癌细胞生长。