CN109916896A - 一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及临床体外诊断试剂技术领域,特别涉及一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法。该干化学试剂片包含三个叠层,依次为支持层、试剂层和扩散层;试剂层中的试剂包括亲水性胶体、非离子型表面活性剂、碱性试剂;扩散层中的试剂包括亲水性高分子聚合物、非离子型表面活性剂、颗粒物质。本发明干化学试剂片检测结果准确性高,精密度好,稳定性好,保存期长,操作简便,适用范围广,无需专业人才等优点,很好的补充了湿化学法的不足之处,其测定准确度和精密度已经接近湿化学测定方法,在临床快速检测领域提供了极大的便利。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外诊断试剂技术领域,特别涉及一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法。
背景技术
血红蛋白又称血色素,是红细胞的主要组成部分,能与氧结合,运输氧和二氧化碳。血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。人体内的血红蛋白由四个亚基构成,分别为两个α亚基和两个β亚基,在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成,肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形,把血红素分子抱在里面,这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子,在卟啉分子中心,由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合,珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合,当血红蛋白不与氧结合的时候,有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合,而当血红蛋白载氧的时候,就由氧分子顶替水的位置。
血红蛋白增高、降低的临床意义基本和红细胞计数的临床意义相似,但血红蛋白能更好地反映贫血的程度。血红蛋白增多生理见于高原居民、胎儿和新生儿,剧烈活动、恐惧、冷水浴等;病理性见于严重的先天性及后天性心肺疾患和血管畸形,如法氏四联症、发绀型先天性心脏病、阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动脉瘘或肺静脉瘘及携氧能力低的异常血红蛋白病等;也见于某些肿瘤或肾脏疾病,如肾癌、肝细胞癌、肾胚胎瘤及肾盂积水、多囊肾等。血红蛋白减少生理见于3个月的婴儿至15岁以前的儿童,一般可较正常人的低10%-20%。妊娠中期和后期、老年人血红蛋白含量减少。病理性见于骨髓造血功能衰竭,因造血物质缺乏或利用障碍所致的贫血,因红细胞膜、酶遗传性的缺陷或外来因素所致红细胞破坏过多而导致的贫血,心脏体外循环的大手术或某些生物性和化学性等因素所致的溶血性贫血以及某些急性或慢性失血所致的贫血。
根据血红蛋白理化原理而立的定量测定方法已有十余种,例如高铁血红蛋白法(HiCN法)、硫酸铜比重法、碱性羟基高铁血红素法(简称AHD-575)。但符合临床常规检验要求:准确,简便,安全,经济,并得到公认的方法很少,其中以氰化高铁血红蛋白法(HiCN法)较为理想,是目前唯一的标准化参考方法。但是氰化高铁血红蛋白法试剂中含有剧毒的氰化钾,且对不同种类的血红蛋白反应时间明显不同。碱性羟基高铁血红素法(简称AHD-575)的试剂稳定,无毒,对各种血红蛋白及其衍生物的转化能力一致。从而克服了HiCN法的一些不足之处。
目前血红蛋白普遍采用液体试剂在大型的全自动生化分析仪测定。设备本身较为昂贵,不具有经济性;同时需要专业技术人才操作仪器,不具有应有的普适性。检测手续繁琐、流程长、等待时间长,分析过程较为复杂,给患者带来了巨大的时间负担。
即时检验是一项新兴的技术领域,主要应用干化学试剂,容易使用和小型化。主要应用于急诊、现场检测。具有简便、快速、灵活以及无需专业人员操作等优点。目前国内基本为定性或半定量测定,这种干化学试剂片均是由滤纸、纤维素片、多孔胶膜等一类片层物质预先固定全部试剂,测量线性范围不大。定量检测的干化学试剂卡都为国外生产。以强生公司和富士公司为代表的多层膜干片法,利用感光胶片的涂层技术将试剂层、辅助试剂层、光漫射层和分布层等试剂涂布在透明支持层上,从支持层的反面测定反射率的变化。上述干化学试剂片虽能定量检测,但分布层或扩散层需用到有机试剂,对材料设备要求高,生产工艺复杂,并且对制备人员健康危害极大,污染环境。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法。该干化学试剂片检测结果准确性高,精密度好,稳定性好,保存期长,操作简便,适用范围广。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片,包含三个叠层,依次为支持层、试剂层和扩散层;
试剂层中的试剂包括亲水性胶体、非离子型表面活性剂、碱性试剂;各组分用量为:
亲水性胶体 10~100g/m2;
非离子型表面活性剂 1.0~100g/m2;
碱性试剂 0.01~10mol/m2。
检测原理为:液体样本滴加在试剂片扩散层被均匀分布,而试剂层中的非离子表面活性剂与碱性试剂可连续释放到扩散层中,样本中血红蛋白及其衍生物,在碱性环境下与试剂中的非离子型表面活性剂发生反应,迅速形成稳定的碱羟高铁非离子表面活性剂复合物,该复合物在波长575nm处有一吸收峰,特定的时间内,在575nm波长下经反射分光光度法测量反射率的变化,通过标准曲线计算血红蛋白的含量。
在扩散层滴加样本,在相反的一面测定,显色强度高,减少加样端测定产生的气泡,过量液体、浊度而造成的干扰。同时由于试剂层为亲水胶体,具有很高的显色匀度。本发明干化学试剂片用于定量检测血红蛋白的含量,可用于临床快速检测,具有良好的经济效益和应用。
本发明试剂层中的非离子表面活性剂与碱性试剂可连续释放到扩散层中,本发明扩散层采用粒径均一的微球制备,能使大分子血红蛋白扩散均一。非离子表面活性剂与碱性试剂可连续释放到反应层中与血红蛋白进行反应,可使显色均一,实现快速准确的定量分析检测,提高检测精确度、灵敏度。
作为优选,试剂层对可扩散物质的渗透性低于扩散层。
作为优选,试剂层中,非离子型表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯80、山梨醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚中的一种或几种。
优选地,非离子型表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚。
作为优选,碱性试剂为氢氧化钠或碳酸钠。
优选地,碱性试剂为碳酸钠。
作为优选,试剂层中各组分用量为:
亲水性胶体 20~70g/m2;
非离子型表面活性剂 5~50g/m2;
碱性试剂 0.1~10mol/m2。
作为优选,亲水性胶体选自聚乙烯醇、支链淀粉、纤维素酯、琼脂糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯亚胺、环氧树脂、聚氨酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物中的一种或多种。
作为优选,试剂层中亲水性胶体为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。
作为优选,扩散层由亲水性高分子聚合物、非离子型表面活性剂、颗粒物质组成;扩散层中各组分用量为:
亲水性高分子聚合物 10~100g/m2;
非离子型表面活性剂 0.1~100g/m2;
颗粒物质 100~500g/m2。
作为优选,扩散层中,亲水性高分子聚合物选自聚氨酯、聚酰胺、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、支链淀粉、黄原胶、海藻酸钠、阿拉伯树胶、桃胶、壳聚糖、聚乙烯乙酸酯中的一种或多种;
优选地,亲水性高分子聚合物为聚氨酯。
非离子型表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚;
颗粒物质选自微晶胶体、二氧化硅微球、树脂珠、玻璃珠、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯微球、纤维素酯中的一种或多种,粒径为1~100微米。
优选地,颗粒物质优选25~50微米粒径。
作为优选,支持层为聚对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物,其厚度为50~300微米。
优选地,支持层厚度为100~200微米。
本发明还提供了该干化学试剂片的制备方法,包括如下步骤:
将试剂液试剂涂覆在支持层上,干燥;再将扩散液试剂喷涂在干燥后的试剂层上,得到依次包括支持层、试剂层和扩散层的干化学试剂片;
试剂层中的试剂包括亲水性胶体、非离子型表面活性剂、碱性试剂;各组分用量为:
亲水性胶体 10~100g/m2;
非离子型表面活性剂 1.0~100g/m2;
碱性试剂 0.01~10mol/m2。
作为优选,支持层的表面经过紫外照射、电晕或涂覆底层处理。
作为优选,试剂层的涂覆方法为流平、挂流、滚粘或涂布。
优选地,试剂层的涂覆方法为涂布。
作为优选,扩散层的涂覆方法为喷涂。
本发明提供了一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法。该干化学试剂片包含三个叠层,依次为支持层、试剂层和扩散层;试剂层中的试剂包括亲水性胶体、非离子型表面活性剂、碱性试剂;各组分用量为:亲水性胶体10~100g/m2;非离子型表面活性剂1.0~100g/m2;碱性试剂0.01~10mol/m2;扩散层中的试剂包括亲水性高分子聚合物、非离子型表面活性剂、颗粒物质。与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)操作过程简单,试剂无需配制,直接滴加样本检测。
(2)试剂片干燥无水分,试剂片稳定性良好。
(3)结果准确性高,可减少内源性干扰。
(4)检测结果重复性好,可进行定量检测,线性范围宽。
(5)制备过程简便,易操作,危害性、污染性小,无毒。
实验表明,本发明所述干化学试剂片检测结果准确性高,精密度好,稳定性好,保存期长,操作简便,适用范围广,无需专业人才等优点,很好的补充了湿化学法的不足之处,其测定准确度和精密度已经接近湿化学测定方法,在临床快速检测领域提供了极大的便利。
具体实施方式
本发明公开了一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片及其制备方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:本发明所述血红蛋白干化学试剂片的制备方法
透明支持层材料采用聚对苯二甲酸乙二醇酯材质,厚度为0.18mm,长度为20cm,宽度为20cm。表面经过紫外照射处理,照射距离10cm,照射时间10分钟。
试剂液试剂的配方如下:
聚乙烯醇 50.0g/m2;
聚乙二醇对异辛基苯基醚 20.0g/m2;
碳酸钠 0.5mol/m2;
扩散液试剂的配方如下:
试剂液均匀涂覆在经过紫外处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯支持层上,放入烘干箱中烘干。反应液喷涂在烘干的试剂层上,放入烘干箱中烘干。
用裁条机将其切割成12mm×12mm大小的试纸片,用铝箔袋密封保存。
测试不同含量的血红蛋白样本,将10μL测试样本滴加于试剂片,用反射式光度计进行测定,测试时间为2分钟。根据标准曲线计算样品中血红蛋白的含量。
实施例2:本发明所述方法的准确度分析
检测样品:20名体检者血样;
对比检测方法:用市售血红蛋白检测试剂盒(高铁血红蛋白法)单一液体试剂在日立7080全自动生化分析仪上检测,由全自动生化分析仪加入2.5μL样本,250μL试剂,37℃反应2分钟,测定546nm吸光度值,根据标准曲线计算样品中血红蛋白的含量。
用实施例1检测方法和对比检测方法分别测定20例样品,检测结果见表1。
表1分析结果
结果显示,根据检测结果计算出的R2值为0.9889,大于0.95,表明本发明所述方法检测结果与对比试剂盒检测结果无明显差异,具有较高准确度(符合度)。
实施例3:本发明所述方法的精密度分析
检测样品:任意一血清样品;
用实施例1检测方法对同一待测样品重复检测10次,检测结果见表2。
表2检测样品血红蛋白含量(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示,标准差率为0.96%,小于标准要求的10%,表明本发明所述方法具有高精密度。
实施例4:本发明所述方法的线性分析
检测样品:高含量血红蛋白样品(200g/L);
将血红蛋白样品稀释成5个不同的含量,依次为0g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L,采用实施例1的检测方法对上述样品的每个含量进行2次检测,计算相关系数R值,检测结果见表3。
表3线性试验结果
结果显示,根据实施例1检测方法得到的检测结果计算出R值为0.9989,接近于1,表明本发明所述方法在0g/L-200g/L的范围内具有良好的线性度。
实施例5:本发明所述血红蛋白干化学试剂片的制备方法
透明支持层材料采用聚对苯二甲酸乙二醇酯材质,厚度为0.178mm,长度为30cm,宽度为20cm。表面经过紫外照射处理,照射距离10cm,照射时间60分钟。
试剂液试剂的配方如下:
聚乙烯吡咯烷酮 30.0g/m2;
聚乙二醇对异辛基苯基醚 10.0g/m2;
碳酸钠 0.3mol/m2;
扩散液试剂的配方如下:
试剂液涂覆在经过紫外处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯支持层上,反应液连续涂覆在试剂层上,放入烘干箱中烘干。
用裁条机将其切割成12mm×12mm大小的试纸片,用铝箔袋密封保存。
测试不同含量的血红蛋白样本,将10μL测试样本滴加于试剂片,用反射式光度计进行测定,测试时间为2分钟。根据标准曲线计算样品中血红蛋白的含量。
实施例6:本发明所述方法的稳定性分析
储存条件:密封放置在2-8℃冰箱中。
检验周期:2-8℃0时、3月、9月、15月、18月、24月。
用实施例5的检测方法在上述检验周期时进行检测,计算准确度,精密度,线性范围,检测结果见表4。
表4稳定性试验结果
结果显示,根据实施例5检测方法得到的检测结果计算出R2值均大于0.95,标准差率均小于标准要求的10%,R值均接近于1,表明本发明所述方法在2-8℃条件下储存24个月,试剂片仍具有良好的准确度,精密度,线性范围。
实施例7:本发明所述方法的抗干扰分析
检测样品:对照血红蛋白标准品(120g/L),对照血红蛋白标准品中加入IgG球蛋白(26g/L);
采用实施例5的检测方法对上述样品进行3次检测,计算实验样本相对于对照样本测量结果所产生偏倚,检测结果见表5。
表5抗干扰试验结果
结果显示,根据实施例5检测方法得到的检测结果计算出的Dobs均小于Dc,未观察到临床显著性影响,表明本发明所述方法在26g/L浓度的球蛋白对测定结果没有明显干扰。
对比例1其他方法血红蛋白干化学试剂片的制备方法
透明支持层材料采用聚对苯二甲酸乙二醇酯材质,厚度为0.20mm,试剂层采用过滤膜。将试剂层浸泡在试剂液中,完全浸湿后取出,刮平。放入30-50℃的干燥箱中,干燥后取出,将试剂层粘贴于支持层上。
试剂液试剂的配方如下:
聚乙烯吡咯烷酮 2.0g/L;
聚乙二醇对异辛基苯基醚 20.0g/L;
碳酸钠 0.5mol/L;
用裁条机将其切割成12mm×12mm大小的试纸片,用铝箔袋密封保存。
测试不同含量的血红蛋白样本,将10μL测试样本滴加于试剂片,用反射式光度计进行测定,测试时间为3分钟。根据标准曲线计算样品中血红蛋白的含量。
对比例2对比例1方法所述方法的精密度分析
检测样品:任意一血清样品;
用对比例1检测方法对同一待测样品重复检测10次,检测结果见表6。
表6检测样品血红蛋白含量(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示,标准差率为3.17%,明显大于实施例标准差率0.96%,表明本发明所述方法具有高精密度。
对比例3对比例1方法所述方法的线性分析
检测样品:高含量血红蛋白样品(200g/L);
将血红蛋白样品稀释成5个不同的含量,依次为0g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L,采用对比例1的检测方法对上述样品的每个含量进行2次检测,计算相关系数R值,检测结果见表7。
表7线性试验结果
结果显示,根据对比例1检测方法得到的检测结果计算出R值为0.9845,而实施例R值0.9889更接近于1,表明本发明所述方法在0g/L-200g/L的范围内具有良好的线性度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种定量检测血红蛋白含量的干化学试剂片,其特征在于,包含三个叠层,依次为支持层、试剂层和扩散层;
所述试剂层中的试剂包括亲水性胶体、非离子型表面活性剂、碱性试剂;各组分用量为:
亲水性胶体 10~100g/m2;
非离子型表面活性剂 1.0~100g/m2;
碱性试剂 0.01~10mol/m2。
2.根据权利要求1所述的干化学试剂片,其特征在于,所述试剂层中,非离子型表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯80、山梨醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚中的一种或几种;碱性试剂为氢氧化钠或碳酸钠。
3.根据权利要求1所述的干化学试剂片,其特征在于,所述试剂层中各组分用量为:
亲水性胶体 20~70g/m2;
非离子型表面活性剂 5~50g/m2;
碱性试剂 0.1~10mol/m2。
4.根据权利要求1所述的干化学试剂片,其特征在于,所述亲水性胶体选自聚乙烯醇、支链淀粉、纤维素酯、琼脂糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯亚胺、环氧树脂、聚氨酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的干化学试剂片,其特征在于,所述扩散层由亲水性高分子聚合物、非离子型表面活性剂、颗粒物质组成;扩散层中各组分用量为:
亲水性高分子聚合物 10~100g/m2;
非离子型表面活性剂 0.1~100g/m2;
颗粒物质 100~500g/m2。
6.根据权利要求5所述的干化学试剂片,其特征在于,所述扩散层中,所述亲水性高分子聚合物选自聚氨酯、聚酰胺、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、支链淀粉、黄原胶、海藻酸钠、阿拉伯树胶、桃胶、壳聚糖、聚乙烯乙酸酯中的一种或多种;
非离子型表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚;
所述颗粒物质选自微晶胶体、二氧化硅微球、树脂珠、玻璃珠、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯微球、纤维素酯中的一种或多种,粒径为1~100微米。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的干化学试剂片,其特征在于,所述支持层为聚对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物,其厚度为50~300微米。
8.如权利要求1至7中任一项所述干化学试剂片的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将试剂液试剂涂覆在支持层上,干燥;再将扩散液试剂喷涂在干燥后的试剂层上,得到依次包括支持层、试剂层和扩散层的干化学试剂片;
所述试剂层中的试剂包括亲水性胶体、非离子型表面活性剂、碱性试剂;各组分用量为:
亲水性胶体 10~100g/m2;
非离子型表面活性剂 1.0~100g/m2;
碱性试剂 0.01~10mol/m2。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述支持层的表面经过紫外照射、电晕或涂覆底层处理。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法,其特征在于,所述试剂层的涂覆方法为流平、挂流、滚粘或涂布。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190621 |