CN109913543A - 辐射敏感基因标记物及在x射线辐射剂量监测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了辐射敏感基因标记物及在X射线辐射剂量监测中的应用。该辐射敏感基因标记物包括三个上调基因标记物和两个下调基因标记物；所述上调基因标记物包括Phlda3、Fgg和Kng1；所述下调基因标记物包括Ptprb和Kti。基于该辐射敏感基因标记物的表达水平构建的剂量‑效应曲线能够有效确定受辐射剂量的范围，从而能够有效监测X射线照射剂量的高低，进而准确提示基于生物学效应的X射线照射的参考剂量，用于核辐射损伤评估。

Description

辐射敏感基因标记物及在X射线辐射剂量监测中的应用

技术领域

本发明属于放射损伤生物剂量检测技术领域，具体涉及辐射敏感基因标记物及在X射线辐射剂量监测中的应用。

背景技术

X射线是包括临床肿瘤放射治疗在内广泛应用的一种电离辐射，其具有强穿透效应、荧光效应、基因组DNA损伤及细胞杀伤等生物效应，这些特性使X射线在工业及生物医学领域发挥了重要作用。X线目前已被广泛应用于工业勘探、武器装甲及金属质量检测等工业、制造、运输、军事领域。X线在医学上也具有极其重要的诊断及治疗价值，包括计算机断层扫描成像(Computed Tomography，CT)检查、基于数字 X线摄影(Digital Radiography，DR)或数字减影血管造影(Digital Subtraction Angiography，DSA)的结构性心脏病、肿瘤栓塞和消融等介入手术、基于直线加速器的各种肿瘤放射治疗手段以及小剂量关节炎治疗等等。

高剂量或长期低剂量X射线受照累积对从业人员及检查对象的健康影响已经成为目前广泛关注的问题。X线对机体造成的不可逆损伤，有可能引发恶性肿瘤(如甲状腺癌、乳腺癌等)、血液系统疾病及对个组织器官的炎症反应和纤维化等不良结局。建立有效放射防护综合措施成为辐射研究领域的重要内容，而有效的X射线剂量监测是进行有效防护的重要前提。目前对于X射线辐射剂量的监测，主要依靠传统物理手段。但由于生物个体差异，对辐射敏感性及其后续影响存在着很大的差异。

因此传统物理剂量检测无法评估射线对生物个体造成的远期生物学效应。而基于生物学方法监测X射线辐射剂量，根据机体生物学改变和辐射剂量的相关性，直接通过分子生物学指标提示X射线辐射参考剂量，为辐射损伤预防、评价和救治提供了崭新的思路。

目前对于生物辐射剂量研究，多采用检测某一特定生物学标志物水平，从而计算该标志物与辐射剂量的相关性。而这些用于检测的生物学标志物，往往来源于文献报道的辐射相关标志物或热点研究基因，这使相关生物剂量计的研究和应用存在一定局限性，若能大范围有效筛查辐射敏感的基因标记物，可提高生物学剂量检测方法的特异性和敏感性。全基因组芯片可在短时间内，小样本量的前提下进行大范围辐射敏感基因筛查。

发明内容

基于现有技术中存在的问题，本发明的第一目的在于提供辐射敏感基因标记物，该辐射敏感基因标记物被申请人证实对不同剂量、不同分次照射的X线均具有显著敏感性；

本发明的第二目的在于提供辐射敏感基因标记物在X射线辐射剂量监测中的应用，基于该辐射敏感基因标记物的表达水平构建的剂量-效应曲线能够有效确定受辐射剂量的范围，从而能够有效监测X射线照射剂量的高低，进而准确提示基于生物学效应的X射线照射的参考剂量，用于核辐射损伤评估；

本发明的第三目的在于提供一种用于检测评估X射线辐射剂量的试剂盒及其应用，采用含有本发明辐射敏感基因标记物的试剂盒能够更加快速、便捷的对X射线辐射损伤的个体进行风险评估；

本发明的第四目的在于提供一种获得本发明辐射敏感基因标记物的方法，采用全基因组芯片在短时间内、小样本量的前提下进行大范围辐射敏感基因筛查，从而获得本发明辐射敏感基因标记物。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

第一方面，本发明提供的辐射敏感基因标记物，该辐射敏感基因标记物包括三个上调基因标记物和两个下调基因标记物；所述上调基因标记物包括Phlda3(PleckstrinHomology Like Domain Family A Member 3，PH同源域家族A成员3)、Fgg(FibrinogenGamma Chain，纤维蛋白原γ链)，Kng1(Kininogen 1，激肽原1)；所述下调基因标记物包括Ptprb(Protein Tyrosine Phosphatase,Receptor Type B，蛋白质酪氨酸磷酸酶， B型受体)，Kit(KIT Proto-Oncogene Receptor Tyrosine Kinase，KIT原癌基因受体酪氨酸激酶)。

上述的辐射敏感基因标记物中，优选地，所述上调基因标记物中，

所述Phlda3的核苷酸序列如下：

CCCAAAGAAGGGCTGGCTGTTCTTCATGGCGTGCTAAGCCAGTGCCTCAG (如SEQ ID NO：1所示)(5’-3’)；

所述Fgg的核苷酸序列如下

CTCCATCGGAGAAGGACAGCAGCATCACATGGGGGGATCCAAACAGGCTG (如SEQ ID NO：2所示)(5’-3’)；

所述Kng1的核苷酸序列如下：

AGCAGTAGTCCCAGCAATGACCCAGAGGGAAGGACCAGAAGAATCCTGGG (如SEQ ID NO：3所示)(5’-3’)。

上述的辐射敏感基因标记物中，优选地，所述下调基因标记物中，

所述Ptprb的核苷酸序列如下：

TTAAGAATTCACCTGAAGATCCCCTGGATAAAAGCGTTTCACTGTGTGAC (如SEQ ID NO：4所示)(5’-3’)；

所述Kti的核苷酸序列如下：

TTATGTTACCCCCTGTTGCAGCCAGCTCCCTTAGGAATGACAGCAGTAGC (如SEQ ID NO：5所示)(5’-3’)。

第二方面，本发明还提供上述辐射敏感基因标记物在X射线辐射剂量监测中的应用。

上述的应用中，优选地，该应用包括以下步骤：

步骤一，对生物体进行X射线长期慢性照射，检测生物体内辐射敏感基因标记物Phlda3、Fgg、Kng1、Ptprb和Kti的基因表达水平；

步骤二，将步骤一中敏感基因标记物的基因表达水平与实际辐射剂量进行线性或非线性回归分析，从而构建获得敏感基因标记物基因表达的剂量-效应曲线；

步骤三，根据剂量-效应曲线确定受辐射剂量的范围，从而能够有效监测X射线照射剂量的高低，进而准确提示基于生物学效应的X射线照射的参考剂量。

上述的应用中，所述生物体可以包括人、动物等。

上述的应用中，优选地，对生物体进行X射线长期慢性照射的方法为梯度剂量(例如：10Gy、15Gy、20Gy、30Gy、40Gy等)并分次照射(例如：10Gy可以通过 5次2Gy；15Gy可以通过5次3Gy；20Gy可以通过5次4Gy；30Gy可以通过5次 6Gy；40Gy可以通过5次8Gy等)。

上述的应用中，优选地，所述敏感基因标记物的基因表达水平为其转录水平差异表达倍数的平均值。

第三方面，本发明还提供一种用于检测评估X射线辐射剂量的试剂盒，所述试剂盒含有上述辐射敏感基因标记物。

第四方面，本发明还提供上述试剂盒在检测评估X射线辐射剂量中的应用。

第五方面，本发明还提供一种以非治疗目的获取上述辐射敏感基因标记物的方法，包括如下步骤：

步骤1，对饲养的同周龄小鼠分组并进行单次及梯度分割剂量的X射线肺部照射，提取肺部mRNA并使用全基因组芯片检测，将检测的芯片信号转换为基于表达值矩阵，得到全基因组表达谱；对基因组表达值矩阵进行log2对数转换，得到基因差异表达倍数；

步骤2，将10Gy的X射线照射组小鼠、20Gy的X射线照射组小鼠分别与0Gy 的对照组小鼠肺部基因表达水平进行比较，得到10Gy的X射线照射组小鼠肺部差异表达基因，和20Gy的X射线照射组小鼠肺部差异表达基因；

步骤3，将上述两组差异表达基因做韦恩图分析，获得同时存于与两组的共同差异基因的组合，即辐射敏感基因标记物。

本发明采取的小鼠模型为小鼠放射性肺损伤模型，其是研究放射性肺炎、肺纤维化与辐射剂量关系、正常组织辐射反应、呼吸系统疾病与免疫应答反应机制的重要工具，在放射生物学、放射治疗学与抗肺损伤药物研发中具有不可替代的作用。放射性肺损伤早期主要表现为放射性肺炎(通常继发于照射后3月内)，由于大量T淋巴细胞受到激活产生免疫应答反应，一种淋巴细胞性肺泡炎；晚期可发展为间质性肺纤维化(照射后6个月左右)。小鼠放射性肺损伤的病理生理学过程与人类极为相似，因此可以作为可靠的参考实验模型。

本发明的有益效果：

(1)本发明的辐射敏感基因标记物对不同剂量、不同分次照射的X线均具有显著敏感性，基于该辐射敏感基因标记物的表达水平构建的剂量-效应曲线能够有效确定受辐射剂量的范围，从而能够有效监测X射线照射剂量的高低，进而准确提示基于生物学效应的X射线照射的参考剂量，用于核辐射损伤评估；

(2)采用含有本发明辐射敏感基因标记物的试剂盒能够更加快速、便捷的对X 射线辐射损伤的个体进行风险评估；

(3)采用全基因组芯片在短时间内、小样本量的前提下进行大范围辐射敏感基因筛查，从而能够获得本发明辐射敏感基因标记物。

附图说明

图1为本发明实施例1中差异表达基因火山图(中等剂量X线(10Gy)与对照组(0Gy)、高剂量X线(20Gy)与对照组(0Gy)差异基因筛选)。

图2为本发明实施例1中差异表达基因热图(I：中等剂量X线(10Gy)照射后低调基因热图；II：中等剂量X线(10Gy)照射后高调基因热图；III：高剂量X线 (20Gy)照射后低调基因热图；IV：高剂量X线(20Gy)照射后高调基因热图)。

图3为本发明实施例1中的中、高剂量X线照射后显著差异基因经维恩图分析获得共同差异表达基因，以及最显著5个共同差异基因(即X线敏感基因组合)热图。

图4为本发明实施例2中X线敏感基因组合(5个共同差异基因)在不同剂量、分次照射条件下的基因表达热图与差异倍数柱状图。

图5为本发明实施例2中X线敏感基因组合的剂量-效应曲线(上：三个上调基因标志物(Phlda3、Fgg、Kng1)的非线性回归模型(图5中的(a)；下：两个下调基因标志物(Ptprtb、Kit)的线性回归模型(图5中的(b))。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

以下实施例中所采用的化学试剂等，若无特殊说明，均为市售获得。

实施例1辐射敏感基因标记物的筛选获取

1、动物实验照射及分组：采用8-10周龄C57BL6雌性小鼠，SPF级饲养，饲养条件为：温度(23±1)℃，相对湿度55％±5％，压力差≤10Pa，每日光照12h，自由摄食饮水。

2、使用异氟烷诱导配合氯胺酮麻醉小鼠，妥善固定，分别给予10Gy、20Gy全肺野X线直线加速器射，空白对照组不接受X线照射(0Gy)。对照组与各剂量实验组每组均随机分配12只小鼠。小鼠于照射后24周断颈处死，取新鲜肺部组织，肺部组织用TRIzol处理后置于-20℃冻存备用。

3、RNeasy Mini Kit(Qiagen)用于肺部RNA提取：使用DNase I(Qiagen)去除DNA，排除DNA污染，无核酸酶水洗脱纯化RNA，RNA样本置于-20.0℃冻存备用。采用 NanoDropND-1000(PEQlab)分光光度计初步测定RNA浓度，2100Bioanalyzer(Agilent) 进一步测定RNA浓度，确认样本纯度。采用全基因组表达芯片(Mouse Sentrix-6V2 Whole GenomeBeadChip，Illumina)进行RNA检测，使用自带软件包处理芯片信号并生成基因表达矩阵，形成全基因组表达谱(一)。

4、参照图1，将10Gy组、20Gy组小鼠肺组织mRNA水平空白组小鼠肺组织 mRNA水平分别与进行比较。本研究采用R-studio V3.4.2进行统计分析，包括表达值 log2对数转换，RMA方法进行数据背景校正、标准化、数据汇总并报告差异表达基因，设定基因表达变化倍数(FC)大于或小于2倍，即log2(FC)>1，且p<0.05为差异表达基因。

采用two-way ANOVA分析基因表达组间差异，设定p<0.05有统计学差异。10GyX 射线照射组小鼠、20GyX射线照射组小鼠肺部差异基因，图中各实心圆点与全基因组芯片中各检测基因对应，设定log2(基因表达变化倍速)绝对值>1，p值<0.05为差异表达基因(如图2所示)。其中10GyX射线照射组小鼠有125个基因出现差异表达，包括93个基因表达下调(I区)，32个基因表达上调(II区)，20GyX射线照射组小鼠有387个基因出现差异表达，包括151个基因表达下调(III区)，236个基因表达下调(IV区)。

5.参照图2，绘制差异各组差异表达基因表达值热图报告，I、II、III、IV分别对应10GyX射线照射组小鼠下调表达基因、10GyX射线照射组小鼠上调表达基因、 20GyX射线照射组小鼠下调表达基因及20GyX射线照射组小鼠上调表达基因的具体表达情况。

6、参照图3，将10Gy组、20Gy组小鼠的差异表达基因进行韦恩图分析，得到 10y组、20Gy组共同的差异表达基因，并取其中差异最显著5个基因，其包括3个上调表达基因：Phlda3，Fgg，Kng1，以及2个下调基因：Ptprb，Kit，作为X射线辐射敏感基因，及辐射敏感基因标记物。在全基因组表达谱(一)中查找上述5个X 射线辐射敏感基因对应表达值，并绘制基因表达值热图报告。

本实施获取的敏感基因标记物的核苷酸序列如下：

所述Phlda3的核苷酸序列如下：

CCCAAAGAAGGGCTGGCTGTTCTTCATGGCGTGCTAAGCCAGTGCCTCAG (如SEQ ID NO：1所示)(5’-3’)；

所述Fgg的核苷酸序列如下

CTCCATCGGAGAAGGACAGCAGCATCACATGGGGGGATCCAAACAGGCTG (如SEQ ID NO：2所示)(5’-3’)；

所述Kng1的核苷酸序列如下：

AGCAGTAGTCCCAGCAATGACCCAGAGGGAAGGACCAGAAGAATCCTGGG (如SEQ ID NO：3所示)(5’-3’)。

所述Ptprb的核苷酸序列如下：

TTAAGAATTCACCTGAAGATCCCCTGGATAAAAGCGTTTCACTGTGTGAC (如SEQ ID NO：4所示)(5’-3’)；

所述Kti的核苷酸序列如下：

TTATGTTACCCCCTGTTGCAGCCAGCTCCCTTAGGAATGACAGCAGTAGC (如SEQ ID NO：5所示)(5’-3’)。

实施例2

本实施例提供上述实施例1获得的辐射敏感基因标记物在X射线辐射剂量监测中的应用。

1、本实施例采用8周龄C57BL6雌性小鼠，共48只小鼠分为三组，6只小鼠未接受X射线照射(空白组)，6只小鼠接受5次2Gy的X射线照射(10Gy组)，6只小鼠接受5次3Gy的X射线照射(15Gy组)，6只小鼠接受5次4Gy的X射线照射 (20Gy组)，12只小鼠接受5次6Gy的X射线照射(30Gy组)，12只小鼠接受5次 8Gy的X射线照射(40Gy组)。

使用异氟烷诱导配合氯胺酮麻醉小鼠，妥善固定，10Gy组、15Gy组、20Gy组、30Gy组、40Gy组小鼠按设定剂量分别进行肺部X射线照射，空白组小鼠固定后不进行射线照射。所有小鼠均于24周予以断颈处死，取新鲜肺部组织，肺部组织用 TRIzol处理后置于-20℃冻存备用。

2.RNeasy Mini Kit(Qiagen)用于肺部RNA提取，使用DNase I(Qiagen)去除DNA，排除DNA污染，无核酸酶水洗脱纯化RNA，RNA样本置于-20.0℃冻存备用。采用 NanoDropND-1000(PEQlab)分光光度计初步测定RNA浓度，2100Bioanalyzer (Agilent)进一步测定RNA浓度，确认样本纯度。采用全基因组表达芯片进行RNA检测，使用自带软件包处理芯片信号并生成基因表达矩阵，形成全基因组表达谱(二)。

3、本实施例采用R-studio V3.4.2进行统计分析，包括表达值log2对数转换，RMA方法进行数据背景校正、标准化、数据汇总并报告差异表达基因，设定基因表达变化倍数(FC)大于或小于2倍，即log2(FC)绝对值>1，且p<0.05为差异表达基因。采用2way-ANOVA分析基因表达组间差异，设定p<0.05有统计学差异。

4.参照图4，在全基因组表达谱(二)中查找实施例获得的X射线辐射敏感基因，包括3个上调表达基因：Phlda3，Fgg，Kng1，以及2个下调基因：Ptprb，Kit的对应表达值，并绘制基因表达值热图报告以及基因表达值柱状图报告。

5.参照图5，在接受梯度X射线辐射的小鼠肺部，获得X射线辐射敏感基因表达值的基础上，本发明将X射线梯度辐射总剂量，和X射线辐射敏感基因的表达值进行回归分析，根据基因芯片结果，分别取上调、下调基因转录水平改变(log2FC) 的平均值作为纵坐标(即y代表所选基因标志物转录水平(log2FC)的平均值)；不同梯度照射剂量作为横坐标(即x代表辐射总剂量大小)，建立剂量-效应曲线。拟合方程如下：

图5中的(a)：y＝A1+(A2-A1)/(1+10^((LOGx0-x)*p))

其中，A1＝-0.06553±0.18433(bottom asymptote，最低点)，A2＝1.48593±0.15206 (top asymptote，最高点)，LOGx0＝19.98411±2.74032(center，中心点)，p＝0.07618± 0.0284(hill slope，曲线斜率)；

图5中的(b)：y＝a+b*x

a＝0.02218±0.13125(intercept，截距)，b＝-0.03551±0.00434(slope，斜率)。

由回归模型表明，不论是上调表达的X射线辐射敏感基因，或是下调表达的X 射线辐射敏感基因，其基因表达值与梯度辐射总剂量回归分析相关性良好，R²分别为0.90和0.89。

由此可以表明，基于该辐射敏感基因标记物的表达水平构建的剂量-效应曲线能够有效确定受辐射剂量的范围，从而能够有效监测X射线照射剂量的高低，进而准确提示基于生物学效应的X射线照射的参考剂量，用于核辐射损伤评估。

将本发明辐射敏感基因标记物做成用于检测评估X射线辐射剂量的试剂盒，能够更加快速、便捷的对X射线辐射损伤的个体进行风险评估，有助于市场化销售使用。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神、所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 辐射敏感基因标记物及在X射线辐射剂量监测中的应用

<130> GAI18CN6322

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> Phlda3

<400> 1

cccaaagaag ggctggctgt tcttcatggc gtgctaagcc agtgcctcag 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> Fgg

<400> 2

ctccatcgga gaaggacagc agcatcacat ggggggatcc aaacaggctg 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Kng1

<400> 3

agcagtagtc ccagcaatga cccagaggga aggaccagaa gaatcctggg 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Ptprb

<400> 4

ttaagaattc acctgaagat cccctggata aaagcgtttc actgtgtgac 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Kit

<400> 5

ttatgttacc ccctgttgca gccagctccc ttaggaatga cagcagtagc 50

Claims (10)

1.辐射敏感基因标记物，其特征在于：该辐射敏感基因标记物包括三个上调基因标记物和两个下调基因标记物；所述上调基因标记物包括Phlda3、Fgg和Kng1；所述下调基因标记物包括Ptprb和Kti。

2.根据权利要求1所述的辐射敏感基因标记物，其特征在于：所述上调基因标记物中，所述Phlda3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述Fgg的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述Kng1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的辐射敏感基因标记物，其特征在于，所述下调基因标记物中，所述Ptprb的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述Kti的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.权利要求1-3任一项所述辐射敏感基因标记物在X射线辐射剂量监测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：

步骤一，对生物体进行X射线长期慢性照射，检测生物体内辐射敏感基因标记物Phlda3、Fgg、Kng1、Ptprb和Kti的基因表达水平；

步骤二，将步骤一中敏感基因标记物的基因表达水平与实际辐射剂量进行线性或非线性回归分析，从而构建获得敏感基因标记物基因表达的剂量-效应曲线；

步骤三，根据剂量-效应曲线确定受辐射剂量的范围，从而能够有效监测X射线照射剂量的高低，进而准确提示基于生物学效应的X射线照射的参考剂量。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：对生物体进行X射线长期慢性照射的方法为梯度剂量并分次照射。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述敏感基因标记物的基因表达水平为其转录水平差异表达倍数的平均值。

8.一种用于检测评估X射线辐射剂量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述辐射敏感基因标记物。

9.权利要求8所述试剂盒在检测评估X射线辐射剂量中的应用。

10.一种以非治疗目的获取权利要求1-3任一项所述辐射敏感基因标记物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，对饲养的同周龄小鼠分组并进行单次及梯度分割剂量的X射线肺部照射，提取肺部mRNA并使用全基因组芯片检测，将检测的芯片信号转换为基于表达值矩阵，得到全基因组表达谱；对基因组表达值矩阵进行log2对数转换，得到基因差异表达倍数；

步骤2，将10Gy的X射线照射组小鼠、20Gy的X射线照射组小鼠分别与0Gy的对照组小鼠肺部基因表达水平进行比较，得到10Gy的X射线照射组小鼠肺部差异表达基因，和20Gy的X射线照射组小鼠肺部差异表达基因；

步骤3，将上述两组差异表达基因做韦恩图分析，获得同时存于与两组的共同差异基因的组合，即该辐射敏感基因标记物。