CN109628571A - 放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法,不同LET射线全肺照射后3周的全基因组转录组学分析筛选出相关敏感基因组合,该特异性基因组合对高LET射线无反应,但接受低LET射线照射后能够驱动该基因组合出现显著高调,基于该特征性生物学转录水平改变,可在接受射线3周内根据关键基因标志物的mRNA水平准确测定,可用来鉴别对X线及低LET射线敏感的差异个体。针对接受X线及低LET射线辐射后,根据肺组织相关辐射敏感基因转录表达水平改变而为评估放射性肺炎发生风险的提供辅助。
Description
技术领域
本发明属放射性肺炎相关敏感基因定量检测方法,涉及X线与低线性能量传递射线电离辐射放疗后根据小鼠肺组织相关辐射敏感基因转录水平改变而建立的一种快速间质性肺炎风险定量评估检测手段。
背景技术
放射性肺炎是正常肺组织因放射线暴露后出现的亚急性炎症反应。通常可于放疗期间或结束后1-6月内发生。其临床症状可出现持续性干咳、呼吸急促、轻度发烧,偶见高热。放射性肺炎的发生除个体敏感性差异外,通常与放射剂量、受照射肺体积以及间隔时间有关。由于临床肿瘤放射治疗主要采用三维适应放疗、调强放疗与螺旋断层放疗、伽马刀等手段为主,主要依赖X线、电子线、γ射线等低LET射线。本发明检测方法所包含的基因标志物对 X线及低线性能量传递射线具有高度敏感性,但对高线性能量传递(high-linearenergy transfer,high-LET)射线(如重离子、α粒子、氦离子)无辐射敏感性,因此可以用来提示正常组织X线辐射暴露后的辐射敏感性与肺炎发生的风险。
放射性间质性肺炎是肺癌、乳腺癌、食管癌、恶性淋巴瘤或胸部其他恶性肿瘤、骨髓移植预处理,经放疗在放射野内的正常肺组织受到损伤而引起的炎症反应。其发生率达5%~15%,影像学改变的发生率则高达15%~100%。放射线对肺实质组织的损伤较为严重,可继发为放射性肺纤维化,某些情况下甚至是致死的直接原因。放射性肺炎是限制胸部肿瘤放疗剂量的关键因素之一,从而影响了肿瘤局部控制率及放疗后患者的生存质量。
放射性肺炎多于放疗后2~3周出现症状,常有刺激性、干性咳嗽、伴气急、心悸和胸痛,不发热或低热、偶有高热。多数于放疗结束一个月后,肺部出阴影或CT上呈急性渗出性改变。急性期在照射的肺野上出现弥温性片状模糊阴影,其间隐约可见网状影,酷似支气管肺炎或肺水肿。血常规可出现炎症反应异常,如中性粒细胞比例升高。肺放射性肺炎和纤维化都会引起限制性通气功能障碍,肺顺应性减低,伴通气/血流比例降低和弥散功能减低,导致缺氧。有时胸片尚未发现异常,而肺功能检查已显示变化。
放射性肺炎临床症状、放射学改变(X线胸片、CT)、肺功能检查等往往需要在放疗结束后一个出现阳性。这意味着当前常规辅助检查需在接受第一次放疗照射后的两个半月到三个月(一次放射治疗疗程大约需6-7周+照射后3-4周)后才出现阳性。放射性肺炎出现临床症状或辅助检查阳性前为潜伏期,该阶段为疾病隐匿期、持续时间将近两个月左右。如果能在此阶段对潜伏发展的放射性肺炎加以诊断,尽早采用有效治疗手段如采用类固醇激素(如泼尼松)、抗炎药物加以干预,从早期抑制放射性炎症反应的发生、发展,则可以很大程度上缓解甚至逆转间质性肺炎的发生。这将为胸部放疗的患者缓解肺炎的不适症状、减少间质性肺炎与纤维化的发生,起到了决定性的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对接受X线及低LET射线辐射后,根据肺组织相关辐射敏感基因转录表达水平改变而评估放射性肺炎发生风险的评估方法。本发明利用小鼠接受不同LET 射线全肺照射后3周的全基因组转录组学分析筛选出相关敏感基因组合。该特异性基因组合对高LET射线无反应,但接受低LET射线照射后能够驱动该基因组合出现显著高调,基于该特征性生物学转录水平改变,可用来鉴别对X线及低LET射线敏感的差异个体,提示肺炎发生的风险大小。具体通过以下步骤实现:
(1)小鼠接受不同射线类型、不同剂量辐射后3周取肺组织做基因芯片或实时定量聚合酶链式反应。不同射线类型、不同剂量选择X射线20Gy,重离子射线12.5Gy。
(2)根据不同线性能量传递(LET)射线、不同剂量照射后3周肺组织全基因组转录水平分析筛选出的辐射敏感基因组合:LOC236604、Tmod2(tropomodulin 2,原肌球调节蛋白 2)、Dhcr24(24-Dehydrocholesterol Reductase,24-脱氢胆固醇还原酶)、LOC100040592 (hydroxymethylglutaryl-CoA synthase,cytoplasmic-like,细胞质样羟甲基戊二酰辅酶 A合酶)、Iqgap3(IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 3,含IQ模序的GTP 酶活化蛋白3)、Mdk(Midkine,中期因子)、Prss35(Serine Protease 35,丝氨酸蛋白酶35)、Stbd1(Starch Binding Domain 1,淀粉结合域1)、Mcam(Melanoma CellAdhesion Molecule,黑色素瘤细胞粘附分子)、Lbh(limb bud and heart development,LBH蛋白) 进行基因芯片或者实时定量聚合酶链式反应实验,测定以上8个基因在肺组织中的表达水平。其中不同线性能量传递(LET)射线、不同剂量照射选择X射线20Gy,重离子射线12.5Gy。
(3)本发明包含的辐射敏感基因组合对高LET射线(如重离子射线)无辐射反应,但接受低LET射线辐射(如X线、电子线、γ射线、同位素碘131)后引起转录水平的明显高调。根据10个特异性X射线敏感基因(LOC236604、Tmod2、Dhcr24、LOC100040592、Iqgap3、Mdk、Prss35、Stbd1、Mcam、Lbh)转录水平高调表达倍数的平均值,即可确定是否为低LET射线暴露。所述定量检测10个基因中至少一种基因的引物为以下8对引物(SEQ:NO.1-16)中的一对:
Tmod2
Tmod2-F:CTTGGCAAACTCTCAGAAGAGGA(SEQ:NO.1)
Tmod2-R:GCAGGTGTTCTCGGTCAAATGG(SEQ:NO.2)
Dhcr24
Dhcr24-F:CTGGAGAACCACTTCGTGGAAG(SEQ:NO.3)
Dhcr24-R:CTCCACATGCTTGAAGAACCAGG(SEQ:NO.4)
Iqgap3
Iqgap3-F:GACAACGGAAGGCTTACCAGGA(SEQ:NO.5)
Iqgap3-R:GTATCGCAGACGCCTGAGGTAT(SEQ:NO.6)
Mdk
Mdk-F:GAAGAAGGCGCGGTACAATG(SEQ:NO.7)
Mdk-R:GAGGTGCAGGGCTTAGTCA(SEQ:NO.8)
Prss35
Prss35-F:CCCTCTCTGATGGGTCGGAAA(SEQ:NO.9)
Prss35-R:TTCCTGACATTCGATGCCACA(SEQ:NO.10)
Stbd1
Stbd1-F:TCGAGAAAGCAACGGACATTT(SEQ:NO.11)
Stbd1-R:CCACACTGCCAGCTACTTTG(SEQ:NO.12)
Mcam
Mcam-F:AAGCTGGTCACTTTAACCACC(SEQ:NO.13)
Mcam-R:ATTCACTCTTACGAGTCGGGG(SEQ:NO.14)
Lbh
Lbh-F:CTGCTCTGACTATCTGAGATCGG(SEQ:NO.15)
Lbh-R:CGGTCAAAGTCTGATGGGTCC(SEQ:NO.16)。
本发明利用小鼠接受不同LET射线全肺照射后3周的全基因组转录组学分析筛选出相关敏感基因组合。该特异性基因组合对高LET射线无反应,但接受低LET射线照射后能够驱动该基因组合出现显著高调,基于该特征性生物学转录水平改变,可用来鉴别对X线及低LET 射线敏感的差异个体,提示肺炎发生的风险大小。本发明是一种针对放射性肺炎潜伏期(临床症状隐匿期)相关敏感基因的定量检测方法,在机体接受射线暴露后的炎症初始阶段即可进行肺炎敏感基因定量检测。本方法可在接受射线3周内根据关键基因标志物的mRNA水平准确鉴别出现放射性肺炎的风险,为筛选出辐射敏感人群并给予相应辅助性或治疗性干预措施提供辅助。针对接受X线及低LET射线辐射后,根据肺组织相关辐射敏感基因转录表达水平改变而为评估放射性肺炎发生风险的提供辅助。
附图说明
图1:C57BL/6小鼠接受X线20Gy照射后3周相比空白对照组(0Gy),肺组织全基因组转录水平分析后分别获得剂量依赖的上调基因(dose-dependent up-regulation genes)子集,进行火山图差异基因分析。
图2:X线照射组火山图获得差异基因进行KEGG信号通路富集分析,提示与细胞因子- 细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、p53信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗、IL-17信号通路等生物学过程具有高度相关性。
图3:C57BL/6小鼠接受X线20Gy照射或重离子(Carbon-ions)12.5Gy(即生物学等效剂量20GyE)后3周,肺组织全基因组转录水平分析后分别获得剂量依赖的上调基因子集,进行火山图差异基因分析。
图4:X线相对空白对照高调差异基因子集(图1)、X线相对重离子高调差异基因子集 (图3)经维恩图分析获得42个高度表达基因热图。该基因子集在X线照射后3周呈高表达,但在重离子照射后呈稍高表达或无明显变化。
图5:经维恩图分析获得基因中筛选获得10个特异性敏感基因热图。该基因组合可以有效提示正常肺组织接受X线或低LET射线的高度特异性,但在重离子照射无显著改变。
图6:经筛选获得的10个特异性敏感基因在X射线照射后3周基因相对表达值(log2fold change)。该特异性基因组合在X线照射后显著高调,在重离子照射无明显改变。
图7:经分析筛获得的10个特异性敏感基因在空白对照组、X射线照射组、重离子照射组的平均值(相对表达值log2fold change)。X线照射后的基因表达量均值显著高于空白对照(P<0.0001)与重离子照射组(P<0.05)。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。
实施例1基于辐射敏感基因组合对X线或低LET射线辐射的生物学检测方法
1.动物实验照射及分组:采用8-10周龄C57BL6雌性小鼠,SPF级饲养,饲养条件为,温度(23±1)℃,相对湿度55%±5%,压力差≤10Pa,每日光照12h,自由摄食饮水;
2.照射前经异氟烷诱导麻醉后,转移至专用小鼠胸部照射装置并妥善固定。采用X线或重离子(碳离子,carbon-ions)进行全肺野照射;
3.照射及分组包括空白对照组(0Gy)、X线单次20Gy照射组、重离子单次12.5Gy照射组;
4.照射后第3周取新鲜肺组织、经总RNA抽提试剂(Trizol)处理后采用RNeasyMini 试剂盒分离提取总RNA。为了避免DNA污染,用DNase I处理RNA。纯化的RNA在45.0μl无核酸酶的水中洗脱,并-20.0℃储存。使用NanoDrop ND-1000分光光度计评估RNA浓度和纯度。使用2100Bioanalyzer和相应的RNA Nano Chip测定RNA样品的完整性和纯度。基于全基因组基因表达阵列对样品进行分析。使用自带软件包进行表达矩阵的生成,数据注释和处理。在随后的统计测试中,对数据进行log2转换以说明基因的表达上升或者下降。为分析不同时间点辐射与基因表达趋势关系,采用R语言软件包进行聚类分析,包括主成分分析,层次聚类,K均值聚类和自组织映射来识别剂量相关基因表达。
参照图1:C57BL/6小鼠接受X线20Gy照射后3周相比空白对照组(0Gy),肺组织全基因组转录水平分析后分别获得剂量依赖的上调基因(dose-dependent up-regulationgenes)子集,进行火山图差异基因分析。设定表达变化倍数>1.5倍,p值<0.05的基因为差异表达基因。
参照图2:对X线照射组上调表达的差异基因进行KEGG信号通路富集分析,提示与细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、p53信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、内分泌抵抗、IL-17信号通路等生物学过程具有高度相关性。
参照图3:C57BL/6小鼠接受X线20Gy照射或重离子(Carbon-ions)12.5Gy(即生物学等效剂量20GyE)后3周,肺组织全基因组转录水平分析后分别获得剂量依赖的上调基因子集,进行火山图差异基因分析。设定表达变化倍数>1.5倍,p值<0.05的基因为差异表达基因。
参照图4:X线相对空白对照高调差异基因子集(图1)、X线相对重离子高调差异基因子集(图3)经维恩图分析获得42个高度表达基因热图。该基因子集在X线照射后3周呈高表达,但在重离子照射后呈稍高表达或无明显变化。
参照图5,本发明方法基于LOC236604、Tmod2、Dhcr24、LOC100040592、Iqgap3、Mdk、Prss35、Stbd1、Mcam、Lbh等10个基因组合,分别对不同射线照射后小鼠肺组织基因表达水平进行热图分析显示:基因表达量在X射线照射后3周显著上调;上述基因表达量不随重离子射线照射而明显改变。
参照图6,10个特异性敏感基因在X射线、重离子射线照射后的基因表达值差异,重离子射线照射组无明显辐射反应。
参照图7,10个特异性敏感基因在X射线、重离子射线照射后的基因表达差异倍数平均值,X线组与空白对照(P<0.0001)、X线组与重离子(P<0.05)表达差异均具有统计学意义。
序列表
<110> 浙江省肿瘤医院
<120> 放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> tmod2-f
<400> 1
cttggcaaac tctcagaaga gga 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> tmod2-r
<400> 2
gcaggtgttc tcggtcaaat gg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> dhcr24-f
<400> 3
ctggagaacc acttcgtgga ag 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> dhcr24-r
<400> 4
ctccacatgc ttgaagaacc agg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> iqgap3-f
<400> 5
gacaacggaa ggcttaccag ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> iqgap3-r
<400> 6
gtatcgcaga cgcctgaggt at 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> mdk-f
<400> 7
gaagaaggcg cggtacaatg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> mdk-r
<400> 8
gaggtgcagg gcttagtca 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> prss35-f
<400> 9
ccctctctga tgggtcggaa a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> prss35-r
<400> 10
ttcctgacat tcgatgccac a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> stbd1-f
<400> 11
tcgagaaagc aacggacatt t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> stbd1-r
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ccacactgcc agctactttg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> mcam-f
<400> 13
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<212> DNA
<213> mcam-r
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<210> 15
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<212> DNA
<213> lbh-f
<400> 15
ctgctctgac tatctgagat cgg 23
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> lbh-r
<400> 16
cggtcaaagt ctgatgggtc c 21
Claims (4)
1.一种放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)小鼠接受不同射线类型、不同剂量辐射后3周取肺组织做基因芯片或实时定量聚合酶链式反应;
(2)根据不同线性能量传递射线、不同剂量照射后3周肺组织全基因组转录水平分析筛选出的辐射敏感基因组合:LOC236604、Tmod2、Dhcr24、LOC100040592、Iqgap3、Mdk、Prss35、Stbd1、Mcam、Lbh进行基因芯片或者实时定量聚合酶链式反应实验,测定这10个基因在肺组织中的表达水平;
(3)辐射敏感基因组合对高LET射线无辐射反应,但接受低LET射线辐射后引起转录水平的明显高调,根据10个特异性X射线敏感基因(LOC236604、Tmod2、Dhcr24、LOC100040592、Iqgap3、Mdk、Prss35、Stbd1、Mcam、Lbh)转录水平高调表达倍数的平均值,确定是否为低LET射线暴露,所述定量检测10个基因中至少一种基因的引物对为SEQ:NO.1-16中的任一对。
2.根据权利要求1所述的一种放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法,其特征在于,步骤(3)中所述高LET射线为重离子射线,低LET射线选用X线、电子线、γ射线或同位素碘131。
3.根据权利要求1所述的一种放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述不同射线类型、不同剂量,分别为:X射线20Gy,重离子射线12.5Gy。
4.根据权利要求1所述的一种放射性肺炎潜伏期敏感基因定量检测方法,其特征在于,步骤(2)中不同线性能量传递(LET)射线、不同剂量照射,分别为:X射线20Gy,重离子射线12.5Gy。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN113862352A (zh) * | 2020-06-30 | 2021-12-31 | 华南理工大学 | 基于prss35通路检测肝癌或肝癌预后的产品及基于prss35通路的肝癌治疗药剂 |
CN113862352B (zh) * | 2020-06-30 | 2024-01-26 | 华南理工大学 | 基于prss35通路检测肝癌或肝癌预后的产品及基于prss35通路的肝癌治疗药剂 |
CN116843778A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-10-03 | 北京邮电大学 | 一种基于放射学报告生成x线胸片图像的方法及系统 |
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