CN109912572B - Egfr抑制剂及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EGFR抑制剂及其医药用途。该化合物为如式I所示的化合物、其药学上可接受的盐、或前药。该化合物能够用于制备成治疗和/或预防癌症的药物。

Description

EGFR抑制剂及其医药用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种EGFR抑制剂及其医药用途。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，是由于人体内细胞的不正常增生所导致。肺癌、消化道肿瘤和肝癌是男性最常见的肿瘤，占所有病例的70％以上(肺癌23％、胃癌15.2％、肝癌13.57％、食管癌10.46％、结直肠癌9.39％)，而乳腺癌、肺癌、消化道肿瘤和肝癌是女性最常见的肿瘤，占所有病例的60％以上(乳腺癌16.97％、肺癌14.85％、结直肠癌9.68％、胃癌8.53％、肝癌6.17％)。随着中国人口老龄化的加剧，癌症的患病率势必增加。另外环境污染情况也增加了一些癌症的患病率，如肺癌。

近十年来，随着人类对肿瘤的认识进一步加深，一些新的技术和治疗手段逐步被应用的临床，比如，小分子靶向药物的研发就取得革命性的进展。基于正常细胞与肿瘤细胞在信号转导方面的差异，小分子靶向药物可以选择性抑制肿瘤细胞的生长，而对正常细胞没有或是有微小的副作用。这在癌症治疗方面比较于传统的肿瘤治疗手段有很大的优势。近几年来就有很多有效治疗癌症的小分子靶向药物成功上市。

作为肺癌驱动基因之一的表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)的发现开启了非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗之门。2002年，首个针对EGFR突变的小分子抑制剂吉非替尼上市，目前涉及EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC的各类研究和相关药物也越来越多。各类指南推荐的TKIs治疗范围涵盖了晚期NSCLC的一、二、三线治疗，甚至维持治疗。EGFR-TKIs不仅引领了肺癌分子靶向治疗的趋势和潮流，也无可争辩的成为肺癌个体化治疗的成功典范。

在我国无论男女肺癌的发病率在各项肿瘤中最高，其五年生存率仅有10％。第一代小分子靶向药物吉非替尼、厄洛替尼在在肺癌的治疗中取得一定疗效，但由于其耐药性，第二代的EGFR阿法替尼上市。第二代抑制剂虽然在一定程度上解决了耐药性的问题，但是，由于其对野生型的EGFR也有很高的抑制导致像腹泻、皮疹等副作用。第三代抑制剂AZD9291(奥希替尼)可以克服第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)T790M突变导致的耐药，其主要针对耐药性的突变EGFR，而不会对野生型EGFR抑制，从而大大减轻了药物的毒副作用。目前AZD9291已经在美国及中国等国家上市。然而，随着时间的推移，服用奥希替尼的患者也会再次产生耐药，这其中就包括C797S突变、活化突变(三重突变)等。

为了解决现有EGFR抑制剂耐药性、选择性差等缺陷，因此仍需开发出更多更安全有效的EGFR抑制剂药物，达到更好的肿瘤治疗效果，以更好的满足临床需求与市场需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的EGFR抑制剂药物的缺陷，而提供一种新型的EGFR抑制剂及其医药用途，该化合物结构新颖、可用于癌症的治疗和/或预防。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种如式I所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或前药，

其中，

所述R₁为选自任选被取代的哌嗪基、或任选被取代的哌啶基；

所述R₂选自C₁-C₆直链或支链烷基、任选地被一个或多个卤素取代的C₁-C₆直链或支链烷基；

所述X为选自NH、O、或S；

根据本发明的实施例，优选R₁为选自下列之一：

根据本发明的实施例，优选X为选自O、或S；

根据本发明的实施例，优选R₂为选自-CH₃、-C₂H₅、-CH(CH₃)₂、-CH₂Cl、或-C₂H₄Cl。

由此，在本说明书通篇中，本领域技术人员可对式I所示化合物中所述R₁、R₂以及X的基团及其取代基进行选择，以提供本发明的实施例中所述的、稳定的式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或前药。

本领域技术人员可以理解，根据本领域中使用的惯例，在本申请的结构式中，

用于描绘化学键，所述化学键为部分或取代基、心结构或骨架结构相连的点。

根据本发明的实施例，本发明所述的式I所示化合物，为如下任一化合物：

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种制备式Ι所示化合物的方法。根据本发明的实施例，制备式Ι所示化合物的方法包括：使所述式1所示化合物与式2所示化合物进行接触，以便获得式I所示化合物，

根据本发明的实施例，上述式1所示化合物中，

所述R₁为选自任选被取代的哌嗪基、或任选被取代的哌啶基；

所述R₂选自C₁-C₆直链或支链烷基、任选地被一个或多个卤素取代的C₁-C₆直链或支链烷基；

所述X为选自NH、O、或S；

根据本发明的实施例，优选R₁为选自下列之一：

根据本发明的实施例，优选X为选自O、或S；

根据本发明的实施例，优选R₂为选自-CH₃、-C₂H₅、-CH(CH₃)₂、-CH₂Cl、或-C₂H₄Cl。

本发明所述式I化合物按照本发明所述的化学合成方法制备得到。发明人发现，利用本发明上述实施例的方法能够快速有效地制备式I所示化合物，且合成路线短、环境友好、目标产物的收率和纯度较高，原料易得、操作及后处理简单、适合工业化生产。在本发明的一个实施例中，式I所示化合物的合成路线为：

本发明化合物可按照本领域技术人员熟知的标准技术来分离和纯化。在纯化化合物时一种特别有用的技术是制备型液相色谱，它采用质谱作为检测从色谱柱中流出的纯化合物的手段。

制备型LC-MS是用于纯化小的有机分子、如本文所述化合物的标准有效方法。可以改变液相色谱(LC)和质谱(MS)的方法，以使粗品更好地分离和提高MS对样品的检测。制备型梯度LC法的优化涉及改变柱子、挥发性洗脱剂及调节剂和梯度。这些方法在优化制备型LC-MS法领域中是众所周知的，采用它们来纯化化合物。这类方法在下述文献中有描述：RosentreterU，HuberU.；Optimal fraction collecting inpreparative LC/MS；J CombChem.；2004；6(2)，159-64和LeisterW，Strauss K，Wisnoski D，Zhao Z，Lindsley C.，Development ofa custom high-throughputpreparative liquidchromatography/massspectrometerplatform forthe preparativepurification and analytical analysisofcompound libraries；J Comb Chem.；2003；5(3)；322-9。

本发明所述的各反应步骤所使用的反应溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的溶剂，溶剂组合，及溶剂组合的不同比例，均视为本发明的包含范围。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括所述式I化合物、其药学上可接受的盐、或前药，和药用辅料。

虽然本发明所述式I化合物可能单独施用活性化合物，但是优选作为药物组合物(例如制剂)的形式给出，所述组合物包含至少一种本发明的活性化合物和一种或多种可药用载体、助剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或者本领域技术人员熟知的其它材料以及任选的其它治疗或预防剂。因而，本发明还提供了如上所定义的药物组合物和制备药物组合物的方法，该方法包括将至少一种如上所定义的活性化合物与一种或多种可药用载体、赋形剂、缓冲剂、助剂、稳定剂或如本文所述的其它材料混和。

在所述的药物组合物中，所述式I化合物、其药学上可接受的盐、或前药的用量，可为治疗有效量。

所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的那些辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。

本发明的药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。

本发明所述的药物组合物可以任何形式给药，包括注射(静脉内)、粘膜、口服(固体和液体制剂)、吸入、眼部、直肠、局部或胃肠外(输注、注射、植入、皮下、静脉内、动脉内、肌内)给药。本发明的药物组合物还可以是控释或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。固体口服制剂的实例包括但不限于粉末、胶囊、囊片、软胶囊剂和片剂。口服或粘膜给药的液体制剂实例包括但不限于悬浮液、乳液、酏剂和溶液。局部用制剂的实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药的制剂实例包括但不限于注射用溶液、可以溶解或悬浮在药学上可接受载体中的干制剂、注射用悬浮液和注射用乳剂。所述的药物组合物的其它合适制剂的实例包括但不限于滴眼液和其他眼科制剂；气雾剂：如鼻腔喷雾剂或吸入剂；适于胃肠外给药的液体剂型；栓剂以及锭剂。

优选口服施用本发明化合物。还优选静脉内施用本发明化合物。取决于情况，可以应用或甚至优选其它施用途经。例如，对于健忘或对口服药物易发怒的患者，经皮下施用可能非常需要。在特别的情况下，本发明化合物还可以通过透皮、肌内、鼻内或直肠内途径施用。施用途经可以以任何方式变化，其受药物的物理性质、患者和看护者的便利以及其它相关情况的限制(Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)，第18版，MackPublishing Co.(1990))。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种本发明式I所述化合物的医药用途。

本发明式I所述化合物是EGFR抑制剂，其可阻断EGFR酪氨酸激酶活化，从而抑制EGFR激活，可使肿瘤生长受到抑制。优选的化合物是抑制T790M和/或L858R EGFR突变。

因此，可以预见，这些化合物将证实可用于治疗或预防增殖紊乱，例如癌症。

可被抑制的癌症实例包括但不限于癌，例如肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、或者结/直肠癌。

本发明的化合物作为EGFR抑制剂的活性可以利用下文实施例中所述的测定法来测量，给定化合物所表现的活性水平可通过IC₅₀值来限定。

本发明还提供了所述式I化合物、其药学上可接受的盐、或前药，在制备EGFR抑制剂中的应用。

所述的EGFR抑制剂可用于生物体内；也可用于生物体外，主要作为实验用途，例如：作为标准样或对照样提供比对，或按照本领域常规方法制成试剂盒，为EGFR的抑制效果提供快速检测。

本发明还提供了所述式I化合物、其药学上可接受的盐、或前药，在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。

除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的标准含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。当参考URL或其他标识或地址，应该理解这样的标识符可以改变，互联网上的特定信息可以发生变化，但通过搜索互联网可以找到同等的信息。所述参考证明了此类信息可获得并且公开传播。

应该理解，上述的一般性说明和下面的详细说明仅是举例说明，对本发明并不受此限制。在本发明中使用的单数形式，如“一种”或“一个”，包括复数指代，除非另有规定。此外，术语“包括”是开放性限定并非封闭式。

除非另有说明，本发明采用质谱、NMR、HPLC、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术或药理检测的传统方法，各步骤和条件可参照本领域常规的操作步骤和条件。除非另有指明，本发明采用分析化学、有机合成化学和医药化学的标准命名及标准实验室步骤和技术。在某些情况下，标准技术被用于化学合成、化学分析、药物制备、配方和药物递送以及患者的治疗。

在本发明中所使用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢根、磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见Berge et al.,“PharmaceuticalSalts”,Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。

本发明所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸。

本发明的“药学上可接受的盐”可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。

除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。可在体内转化以提供生物活性物质(即式I所示化合物)的任何化合物是在本发明的范围和主旨内的前药。例如，含有羧基的化合物可形成生理上可水解的酯，其通过在体内水解以得到式I所示化合物本身而充当前药。所述前药优选口服给药，这是因为水解在许多情况下主要在消化酶的影响下发生。当酯本身具有活性或水解发生在血液中时，可使用肠胃外给药。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。

针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。

术语“活性成分”、“治疗剂”、“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

本发明所述的EGFR抑制剂可以用作单剂，或与其他治疗剂联用，以增强这些治疗剂的效果。

本发明所述的式I所示化合物，其具有良好的溶解性，该化合物在肝微粒体和血浆中是稳定的，具有良好的药代动力学特性和良好的稳定性。相对于目前已上市的第三代EGFR抑制剂AZD9291(奥希替尼)，本发明所述的化合物显示了更好的药效，以及对T790M和/或L858R EGFR具有更高的选择性，针对第一代、第二代、第三代EGFR抑制剂耐药的癌症患者，本发明所述的化合物具有更好的肿瘤治疗效果。

本发明所述的式I所示化合物为新型EGFR抑制剂提供了新的商业选择，可用于治疗和/或预防肿瘤和其他不受控制的细胞增殖疾病。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明所述的作为选择性EGFR抑制剂的新型化合物，其结构新颖，其对野生型EGFR(WT-EGFR)显示了相对较低的抑制作用，但保持了对EGFR L858R激活突变体、和T790MEGFR抗性突变体具有很高的活性抑制作用。本发明化合物相比阳性药AZD9291来说，具有更好的EGFR L858R激活突变体、和/或T790M EGFR激酶抑制活性及细胞增殖抑制活性。本发明的化合物在有EGFR激活突变体和/或EGFR的抗药性突变的癌症治疗中会有很好的治疗效果。本发明的化合物可以用于治疗有EGFR L858R激活突变体的癌症病人的治疗，以及对现有EGFR抑制剂如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼或奥希替尼已经产生抗药性EGFR-T790M抗性突变体的癌症病人的治疗，也不用担心第二代EGFR突变体抑制剂如阿法替尼所带来的副作用。

(2)本发明制备方便、生产成本较低。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的实施例提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、或前药，制备式Ι所示化合物或其药学上可接受的盐、或前药的方法和中间体，药物组合物，以及本发明的化合物在制备药物中的用途。

实施例1化合物I-a的制备

将式I-a-1所示化合物(1.69g,5.77mmol)溶于80mL异丙醇中，向其中加入式2所示化合物(840mg,5.77mmol)和对甲苯磺酸(993mg,5.77mmol),将混合物在70℃温度下，搅拌反应6小时。TLC检测反应完毕后，减压蒸去溶剂，将残留固体物分散于200mL乙酸乙酯中，依此用饱和碳酸氢钠水溶液，水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗产品，经柱层析分离得式I-a所示化合物(得量811mg，产率35％，HPLC纯度99.8％)。

m/z:403(M+H)⁺.

实施例2化合物I-b的制备

化合物I-b的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，只不过起始原料换为化合物I-b-1。通过硅胶色谱法纯化，得到式I-b所示化合物(产率59％，HPLC纯度99.4％)。

m/z:430(M+H)⁺.

实施例3化合物I-c的制备

化合物I-c的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，只不过起始原料换为化合物I-c-1。通过硅胶色谱法纯化，得到式I-c所示化合物(产率55％，HPLC纯度99.0％)。

m/z:442(M+H)⁺.

实施例4化合物I-d的制备

化合物I-d的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，只不过起始原料换为化合物I-d-1。通过硅胶色谱法纯化，得到式I-d所示化合物(产率43％，HPLC纯度99.5％)。

m/z:456(M+H)⁺.

实验效果实施例1——本发明化合物的EGFR激酶抑制活性测试

采用Z’-Lyte^TM激酶测试盒(invitrogen^TM，Z’-Lyte^TM Kinase assay kit-Tyr 6peptide)进行测试。先把酶和化合物分别按照一定的配比加于384孔板，混匀，放置30min；然后加入ATP，混匀，放置2h；加5μL Development Regent，混匀，于室温下放置15min，30min，1h后，用酶标仪进行检测；1h后加入5μL的Stop regent，混匀后用酶标仪进行检测。计算相应的磷酸化比例，根据化合物的浓度与对应的激酶抑制率作图，得到剂量反应曲线，据此求得本发明化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果如表1所示。

抑制率(％)＝[1-(A_样品组-A_{样品空白组})/(A_对照组-A_空白组)]×100％

表1、本发明化合物的EGFR激酶抑制活性IC₅₀(nM)

化合物编号	野生型EGFR(WT-EGFR)	L858R/T790MEGFR
			I-a	225	64
I-b	760	22
			I-c	1645	4.0
I-d	340	6.2
			AZD9291	432	13.8
Dacomitinib	12.5	＞1000

EGFR激酶抑制活性测试结果显示，本发明化合物对WT EGFR显示了相对较低的抑制作用，对L858R/T790M EGFR具有较高的活性抑制作用，其中，相比阳性药Dacomitinib和AZD9291，本发明化合物I-c和I-d具有对EGFR L858R激活突变体、和T790M抗性突变体更好的激酶抑制活性。

实验效果实施例2——本发明化合物对细胞的生长抑制实验

用测定细胞的生长的方法来鉴定优先靶向针对某些变异形态的EGFR，而对野生型EGFR的活性相对较弱的化合物。NCI-H1975细胞株是含有T790M和L858R EGFR突变的人类非小细胞肺癌细胞，该细胞生长在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(GIBCO)中。LoVo细胞株是一个野生型EGFR的人结肠腺癌细胞，该细胞生长在含有10％FBS的F-12K培养基(GIBCO)中。NCI-H2073细胞株是一个野生型EGFR的人非小细胞肺癌细胞，该细胞生长在含有10％FBS的ACL-4培养基中。NCI-H1975、LoVo和NCI-H2073细胞的生长快慢由Cell Titer-Glo发光活力测定法(Promega公司#G7572)来检测。

简要地说，用胰蛋白酶来消化在对数生长期的细胞，并以每孔5000个Lovo或NCI-H2073，2500-3000个NCI-H1975细胞接种到96孔板中，并孵育在37℃，有5％CO₂的湿润的培养箱内，同时设不接种细胞仅加入营养液的空白对照孔。24小时后，将不同化合物的DMSO溶液用细胞培养基液体从高到低稀释到不同浓度，每次用3.16倍稀释，共有8个不同浓度。NCI-H1975细胞中测试药物的浓度从0.03nM-100nM,LoVo和NCI-H2073细胞中测试药物的浓度从3nM-10μM。然后将不同化合物的细胞培养基液体加入到有细胞的96孔细胞板中，同时设一个仅含有DMSO的细胞培养基液体的细胞对照孔。在药物处理72小时后，将细胞板从培养箱中取出并放置在室温下30分钟。然后加Cell Titer-Glo试剂到孔中，并将96孔细胞板在室温下摇晃10分钟，以诱导细胞裂解。再将96孔细胞板放在实验台上2分钟，让发光信号稳定。最后将96孔细胞板放入EnVision多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)中，用0.5秒的积分时间来读取信号。

计算公式为：细胞生长抑制百分比％＝(最大信号–化合物信号)/(最大信号最小信号)×100％；

其中，最大信号由没有化合物的DMSO对照处理的细胞对照孔中获得；化合物信号由加入化合物的药物处理的细胞孔中获得；最小信号由没有细胞的，只有营养液的空白对照孔中获得。

通过GraphPad PrismV5.0软件计算出细胞生长抑制曲线，并基于此数据计算出获得50％抑制效果所需的化合物浓度，即化合物IC₅₀。所得结果列在下表2中。

表2：化合物活性实验结果IC₅₀(nM)

化合物编号	NCI-H1975	LoVo	NCI-H2073
				I-a	26.1	1225	883
I-b	82.0	1290	1160
				I-c	12.6	2055	188
I-d	9.9	1646	354
				AZD9291	35.8	1990	222

细胞活性测试显示本发明化合物对T790M和L858R EGFR突变的NCI-H1975细胞株具有良好的增殖抑制活性，且本发明I-c和I-d化合物对NCI-H1975的增殖抑制活性优于阳性药AZD9291，本发明I-a化合物的增殖抑制活性与AZD9291相当。

故而，本发明所述化合物可作为EGFR抑制剂，用于治疗由EGFR引起的增殖性疾病。例如通过抑制EGFR激酶，本发明化合物可用于治疗和/或预防癌症疾病。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种如式I所示的化合物、其药学上可接受的盐，

其中，

所述R₁为选自下列之一：

所述R₂选自C₁-C₆直链或支链烷基、任选地被一个或多个卤素取代的C₁-C₆直链或支链烷基；

所述X为选自NH、O、或S。

2.如权利要求1所述的I所示化合物、其药学上可接受的盐，其特征在于，所述X为选自O、或S。

3.如权利要求1所述的I所示化合物、其药学上可接受的盐，其特征在于，R₂为选自-CH₃、-C₂H₅、-CH(CH₃)₂、-CH₂Cl、或-C₂H₄Cl。

4.如权利要求1所述的式I所示化合物、其药学上可接受的盐，其特征在于，

本发明所述的式I所示化合物，为如下任一化合物：

5.如权利要求1所述的式I所示化合物、其药学上可接受的盐，其特征在于，制备式Ι所示化合物的方法包括：

使所述式1所示化合物与式2所示化合物进行接触，以便获得式I所示化合物，

所述式1所示化合物中，

所述R₁为选自下列之一：

所述R₂选自C₁-C₆直链或支链烷基、任选地被一个或多个卤素取代的C₁-C₆直链或支链烷基；所述X为选自NH、O、或S。

6.如权利要求5所述的制备式Ι所示化合物的方法，其特征在于，

所述式1所示化合物中，

所述R₂选自-CH₃、-C₂H₅、-CH(CH₃)₂、-CH₂Cl、或-C₂H₄Cl；

所述X为选自O、或S。

7.一种药物组合物，其包括如权利要求1～4中任一项所述的化合物I、其药学上可接受的盐，和药用辅料；所述的化合物I、其药学上可接受的盐的用量可为治疗有效量。

8.如权利要求1～4中任一项所述的化合物I、其药学上可接受的盐，或如权利要求7所述药物组合物在制备EGFR抑制剂中的应用。

9.如权利要求1～4中任一项所述的化合物I、其药学上可接受的盐，在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症是由EGFR L858R激活突变体、和/或T790M EGFR抗性突变体引起的，

任选地，所述的癌症为肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、或者结/直肠癌。