CN109893679A - 一种采用生物墨水的细胞组织的3d打印方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基纤维素（MC）基水凝胶生物墨水的3D打印方法。甲基纤维素水凝胶是获得再生医学应用细胞片的最佳基质。然而，目前甲基纤维素的水凝胶制备方法只允许获得具有标准化和简单几何形状(即，水凝胶产生容器的几何形状),本发明采用甲基纤维素水凝胶通过3D打印的方法实现了相应的细胞板工程及生物体组织器官的复杂形状的3D打印。其在37℃下的稳定性和流变学性能均适合于生物薄板工程应用。将细胞包埋在甲基纤维素基水凝胶中，检测细胞存活率大于90%;优化后的打印参数使甲基纤维素基水凝胶中嵌入的C2C12细胞的生物印迹存活率大于80%。

Description

一种采用生物墨水的细胞组织的3D打印方法

技术领域

本发明涉及生物医学，及细胞板工程的3D打印成型领域，更具体而言，涉及一种通过细胞包埋培养增殖，并采用生物3D打印的方法实现可移植复杂结构的活体组织器官的成型的方法。

背景技术

智能水凝胶会根据外界因素(如温度或pH值变化)改变其结构。可分为热响应型和ph响应型智能水凝胶。在热响应型水凝胶中、N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)和甲基纤维素(MC)可用于细胞片工程应用,作为一种替代细胞骨架组织工程方法，旨在克服的一些传统细胞骨架缺点的组织工程方法,包括难以获取细胞密度结构和可能的炎症支架降解的相关情况。特别是甲基纤维素是一种增粘聚合物，由纤维素亲水性羟基由疏水性甲氧基的部分取代而来，加热时发生溶胶-凝胶转变。与PNIPAAm相比,通过电子束辐照，聚合，并一次性接枝到组织培养聚苯乙烯(TCPS)培养皿中, 甲基纤维素基水凝胶可以通过一个简单和低成本的方法,通过浇注甲基纤维素基水凝胶在组织培养聚苯乙烯培养皿中，施加电子束辐照，形成一层均匀层,它随后用于获得细胞薄片。事实上，甲基纤维素基水凝胶的传统制备方法是将甲基纤维素加入不同盐的水溶液中混合，从而调节溶胶-凝胶的转变温度，从而在生理相关的温度形成胶体(例如，溶胶-凝胶过渡温度低于37 ℃)。

当前有报道基于甲基纤维素的水凝胶在细胞薄片工程应用中的成功应用，尤其是其物理和体外生物学特性的研究。然而，他们提出的基于甲基纤维素基水凝胶基质只允许获得细胞薄片，这些细胞薄片可以复制TCPS孔或生产它们的培养皿的形状，从而限制了它们用于生产复杂形状组织替代物的潜力。本发明提出的方法是，利用基于甲基纤维素基水凝胶的3D打印技术可以获得形状复杂的甲基纤维素基板，从而获得形状多样的细胞片。然而，据我们所知，到目前为止还没有关于打印甲基纤维素基水凝胶的研究，这种凝胶可使细胞片具有所需的几何形状。事实上，甲基纤维素基水凝胶目前只能用于3D打印过程中与其他聚合物混合，以便更容易打印与之混合的聚合物，如海藻酸或透明质酸。Garcia等人在与中孔生物活性玻璃混合时，利用甲基纤维素基作为载体获得三维多孔支架;通过烧结去除聚合物，得到三维支架。然而，到目前为止，还没有关于甲基纤维素基水凝胶3D打印用于细胞片制作的研究报道。

发明内容

本发明公开了一种甲基纤维素基水凝胶的生物医学，细胞组织的3D打印方法，并且探索了不同浓度不同盐类所得到的不同甲基纤维素基水凝胶配方，证明了它们的细胞相容性和高效的获得细胞片能力。我们特别证明了Na2SO4 0.05 M（mol/L）制备的甲基纤维素基水凝胶是获得细胞片的最佳底物。在本发明中，我们通过调节打印温度，论证了打印相同的甲基纤维素基水凝胶配方的可能性，并确定了打印参数(即，喷嘴的大小，沉积速度和挤压倍增器压力)对打印的水凝胶股和印刷精度的甲基纤维素基水凝胶。然后，我们探讨了打印工艺对甲基纤维素基凝胶流变学和物理性能的影响。最后，我们通过将C2C12细胞嵌入到甲基纤维素基水凝胶中，获得生物墨水，证明了甲基纤维素基水凝胶的细胞相容性，证实了以甲基纤维素基水凝胶为生物墨水，对活细胞进行生物打印的可行性。

附图说明

图1为基于机器人点胶挤出的生物打印机(改性KIWI 3D打印机): (a) 3D打印机的主要部件和(b)打印机墨盒和印板的细节。

图2为基于甲基纤维素基水凝胶打印温度优化。代表图像(比例尺= 5毫米) 甲基纤维素基水凝胶印在T =(a)37℃(比例尺= 500μm),(b)4(比例尺= 250μm),和(c)21℃(比例尺= 250μm)，(d) 甲基纤维素基凝胶的打印形状保真度与挤出性能随打印温度的变化趋势。

图3为通过改变针径、沉积速度和挤压倍增器优化甲基纤维素基凝胶的3D打印。(a)平均线径和(b)使用18、21和24 G喷嘴并且增加沉积速度(分别为0.3、0.5、0.7、1mm/s)、挤压倍增器(分别为1、2、3、4).的情况，其中(b)中缺失列(打印精度= 0%)，识别的不获得连续细丝的打印参数。

图4为通过改变挤出倍增器、针径和沉积速度，研究了基于甲基纤维素基的水凝胶束直径的锯齿形打印的代表性图像。用于测试打印参数对打印线尺寸影响的几何形状如左图所示。例如，使用21 G喷嘴和挤压倍增器设置为2打印的水凝胶，并将沉积速度从0.3 mm/s(左)增加到1mm /s(右);比例尺= 5毫米。

图5。基于甲基纤维素基水凝胶打印在复杂的几何形状:(a)树，(b)星和(c)圆柱(5层)形状的设计，通过设置优化的打印参数(即、21 G、0.5 mm s-1、挤压倍增器3);图像中的圆圈表示嵌入显微镜图像中突出显示的打印区域。比例尺:5mm;插入图像比例条:500微米。

图6为浸没于(a)蒸馏水和(b) 37 ℃培养基中的大块凝胶和3D打印凝胶的重量变化与孵育时间的关系;* p < 0.05时同一孵育时间点大块凝胶与3D打印凝胶的比较。

图7。甲基纤维素基水凝胶的生物打印。(a)通过计算获得的活细胞(白色)和死细胞(灰色)占比， (b)大块水凝胶培养的情况(c)使用挤压倍增器设置为1、2、3和4时的打印情况(*p < 0.05对比挤压倍增器EM使用情况;EM 4与其他各组有统计学差异)。图中标尺=100微米。

具体实施方式

甲基纤维素水凝胶的制备

简单地说，含有8%w/v的甲基纤维素水凝胶通过将甲基纤维素粉（纤维素A4M，ŋ=4000mPa，2%的水溶液在20℃下，Dow Chemical公司提供）混入Na2SO4，0.05 M盐溶液中。得到的聚合物悬浮液在4摄氏度的冰箱中保存24小时，使甲基纤维素基聚合物链完全水化。在反复测试论证后，我们证实了该甲基纤维素基水凝胶配方在细胞板工程和细胞传递应用中具有最佳的转变温度范围为(LCST=34-37℃)。

甲基纤维素水凝胶的3D打印机

甲基纤维素水凝胶分为块状形式和3D打印形式，其分别制备方式如表1所示：

表1 甲基纤维素基水凝胶的制备方法

名称	甲基纤维素基水凝胶浓度（%w/v）	盐类型	盐浓度（mM）	制备用途
					块状甲基纤维素基水凝胶	7.5	Na2SO4	48	用于平板细胞培养
3D打印甲基纤维素基水凝胶	8	Na2SO4	50	用于细胞组织器官3D打印

一台经过人为改装后的3D打印机（KIWI 3D 打印机），（图1)，内部增设了机器人配胶挤压装置，并通过机器人点胶挤出打印水凝胶，用于打印基于甲基纤维素基的水凝胶(表1)。，在加热夹套系统中加载处于待打印溶胶状态的甲基纤维素基水凝胶，用于控制打印温度。然后将注射器插入固定在由步进电机驱动的活塞上，该步进电机允许注射器内容物挤压。在打印过程中，注射器沿x - y平面(140 x 100 x 100 mm)移动，而打印基质沿Z平面移动，允许逐层沉积。在3D打印过程中，通过3D建模软件(Rhinoceros)以.stl文件的形式获得需要打印的几何形状;然后使用Slic3r软件设置打印参数，得到最终用于3D打印的.gcode文件。

按照块状甲基纤维素基水凝胶样品制备的甲基纤维素基水凝胶(表1)，在水化后加载到注射器中进行3D打印。第一次测试是为了确定打印温度，使基于甲基纤维素基的水凝胶挤出性和打印后获得的形状保真度之间达到适当的平衡。将甲基纤维素基基水凝胶打印成一条连续的直线，由9个锯齿形段(每段长度= 1cm)组成，朝向为90°方向，通过优化，探讨了打印参数对打印海藻酸盐/明胶共混水凝胶的影响。在4、21和37 C的温度下打印甲基纤维素基水凝胶 (LCST = 34 -37 C)，研究打印温度对打印标准影响;测试4和21 C (T <LCST)是因为在4摄氏度温度下，甲基纤维素基水凝胶状态变为溶胶状，而测试37 C (T >LCST)是因为在这个温度下，水凝胶具有凝胶样行为。试验采用18G喷头，沉积速度为1mm s-1，挤压倍增器为3，层高为内针直径的85%。这些打印参数是通过反复论证过的最佳参数，通过该参数打印出的样本可以获得连续不间断的打印路径。然后对得到的打印丝路径进行宏观观察，识别打印结构中是否存在缺陷，利用光学显微镜拍摄的图像测量平均线径，利用ImageJ软件进行分析。

首先，为了确定甲基纤维素基水凝胶的最佳打印温度，需要对打印温度进行优化。实际上，打印温度是打印热响应水凝胶时的一个关键参数，在打印过程中必须进行调整以优化形状保真度。特别是对于mc基的水凝胶，必须考虑溶胶转变温度，从而控制打印机加热套的挤出温度。在优化步骤中，采用18G喷嘴打印甲基纤维素基生物墨水，沉积速度固定在1mm/s，挤压倍增器设置为3，保证打印的水凝胶连续挤压。打印甲基纤维素基生物墨水在37,4和21摄氏度时得到的打印宏观图像分别如图2a，图2b和图2c所示。

加热套的温度固定时37 C, 甲基纤维素基水凝胶的粘度增加,由于T > LCST,造成部分阻塞喷嘴，造成打印线不均匀,显示出一些空洞和违规行为影响印刷结构(图2),通过观察失败的打印线发现，通过降低打印温度降到4 C(T << LCST),由于过低的粘度甲基纤维素基水凝胶(图2 b),导致印刷水凝胶的积累和传播。然后将最佳温度设置为21 ℃(图2c)，该温度表示挤压性和形状保真度之间的良好平衡(图2d)。这种打印温度(T < LCST)，是比较连续的。此外，与4℃打印的水凝胶相比，打印线的平均直径(即1012±101μm)更准确地再现设计打印直径。因此,优化打印过程的特点是两个步骤:(1)打印的水凝胶在21 ℃(T < LCST),温度的水凝胶具有溶胶状响应,允许其在打印过程中挤出，(2)维持水凝胶在37℃(T > LCST)打印过程后,稳定打印水凝胶,在这个温度,其特点是凝胶状的反应。

打印线直径

通过改变孔径(即喷嘴直径)，探讨了打印参数对甲基纤维素基水凝胶打印线直径的影响。（如18、21、24 G)、沉积速度(如、0.3、0.5、0.7、1mm s-1)、挤压倍增器(如， 1、2、3、4)，共48种组合。将打印温度设为21℃(即，之前确定的最佳打印温度)。每个样品打印一层，设计成与温度测试相同的锯齿形几何形状，并将层高设置为所选针内径的85%（如图3所示）。最后，打印后立即用光学显微镜对打印后的凝胶进行分析，避免水分蒸发和形状失真;具体来说，取图像(每个样本n = 9，打印几何图形的每一段各取一幅)，利用ImageJ软件测量股直径(每幅图像n = 3)。

表2中的n-表示对于每一组测试参数，在每一条件下测试的3个样本中，有明显缺陷的样本的数量为n。大多数测试条件允许打印所有试样(n = 3)，没有任何明显的缺陷。在某些情况下，特别是当最小的喷头24G)与最低挤压倍增器(即， 1)和最高沉积速度(即， 1mm/s)，所有试件在结构上均有一定缺陷，难以获得均匀的打印线。例如，由21 G、挤压倍增器设置为2，以及通过改变沉积速度打印的水凝胶沉积路径的代表性图像如图4所示。可见，打印线尺寸在0.3 ~ 1mm不等，同时，非连续的打印线沉积增加了打印速度。

通过增加沉积速度，可以观察到线径的明显减小。，即打印盒在xy平面上的移动速度)。当速度在0.3 ~ 0.7 mm/s之间变化时，得到了连续线段。然而，当沉积速度最高时(即，使用1mm/s)，由于沉积速度相对较高，无法正确沉积挤出的水凝胶，得到非连续的打印线;对于每一组考虑的参数，受这种不均匀性影响的样本数量由表2中的数字n-证明。

打印精度

表2 不同打印参数数据结果（用不同的沉积速度0.3、0.5、0.7、1mm s-1、挤压倍增器1、2、3、4及孔径 18, 21和24 G。）

采用过程优化的方法，探讨了在研究打印束直径过程中测试的打印参数组合对甲基纤维素基水凝胶打印精度的影响;特别是，只有参数的组合才可以获得连续的打印路径(如，考虑3/3的特征样本，获得连续打印路径，表2)进行打印精度测试。通过改变喷嘴的尺寸(即喷嘴的大小)，打印出8个相邻方格(每个方格0.5 x 0.5厘米)组成的网格(1×2厘米)。、18、21、24 G)、沉积速度(即、0.3、0.5、0.7、1mm s-1)和挤出倍增器压力(如， 1、2、3、4).对于每个考虑的打印参数组合，打印n = 3个网格，获得显微图像;对于每个打印的网格，利用ImageJ软件计算构成网格的每个正方形的内部面积(A_i)，并与理论面积(A)(CAD模型设计的面积)。打印精度百分比计算如式1所示：

（1） 。

研究了打印精度，以确定用于打印水凝胶的参数集，以便正确打印cad设计的形状。特别地，在这15个测试中，只考虑了用于连续细丝打印的参数集(表2)。平均打印精度由所有考虑的打印参数(即，针径、沉积速度、挤压倍增率)，如图3b所示。当考虑到18G的喷嘴(打印精度< 70%)由于打印出来的线束尺寸较大(表2)，当使用18G喷嘴时，只有当挤压倍增器设置为1时，才能获得可接受的打印精度值。减少所使用的喷嘴的尺寸(即(21G及24G喷嘴)，以按不同喷嘴直径打印明胶/藻酸盐共混油墨的精度值。事实上，这些喷嘴可以打印尺寸相对较小的线(表2)；打印的线的尺寸越小，可以更好地复制CAD设计的线的几何形状，从而达到最佳的打印精度值(打印精度为70-95%)。

然后我们选择了一组优化的打印参数(即， 21G、0.5mm/s,及EM 3(挤压倍增率为3))以打印各种形状的几何图形(例如，一棵树和一颗星星)。优化参数允许获得一个精确的复制的CAD设计文件(图5)。路径组合印刷的直径几何图形按照那些获得印刷参数优化过程中(表2)确定,从而证明印刷路径的特点是独立于所选几何印刷形状。此外，打印的几何图形展示了同时打印锐角(图5a)和钝角(图5b)两种角度的可能性，从而展示了基于甲基纤维素基的凝胶打印的通用性，这是获得多功能应用所需的复杂形状几何图形的基础。此外，基于甲基纤维素基水凝胶可以打印得到三维结构;特别是,圆柱几何(Ø= 2厘米,高度= 0.25厘米),通过打印的连续性,从而证明使用甲基纤维素基水凝胶可以获得相应的3 d结构(图5)。

重量变化和稳定性测试

以甲基纤维素为基础的水凝胶在21摄氏度(即，T < LCST);之后，将打印好的8个水凝胶储存在37℃，促进物理甲基纤维素基水凝胶的形成，稳定打印结构。为了探讨制备的甲基纤维素基水凝胶的稳定性，在蒸馏水和细胞培养基(即，用于生物打印部分的组合物);在培养基中进行试验前，按照生物打印切片的描述对水凝胶和3D打印机进行灭菌，并在生物膜下进行试验。大部分样本由权重1克甲基纤维素基块状水凝胶直接在培养皿(Ø= 35毫米)。样品是直接在Petri培养皿中打印水凝胶得到的，与甲基纤维素基块状样品一样，每个样品1 g，使用相同的打印参数进行流变表征。水凝胶试样(n = 3 每种类型)在试验开始时称重，然后浸入4 ml蒸馏水或培养基中。然后，不同时间点的权重(即， t = 1、2、3、4、7天)记录。在每个时间点，将浸渍样品的溶液完全去除，测量水凝胶样品的重量，加入4 ml新鲜蒸馏水或培养基，直至后续时间点。权重变化(W%)计算如式(2)所示：

△W%=（W_t-W₀）×100/W₀ (2)

其中W_t和W₀分别表示t时刻和0时刻的样本权重(如：在准备或印刷后立即取样)。

在重量变化测试中，大块凝胶和3D打印凝胶表现出相似的趋势(图6);在前24小时重量变化较大后，样本达到重量变化平稳期，维持4天。

在此之后，样品的重量下降，这与水凝胶的降解有关。此外，在所有考虑的时间点上，打印凝胶的W%值均高于散装凝胶(p < 0.05)。这种行为与之前通过流变学表征观察到的印刷过程中产生的剪切应力有关。事实上，MC大分子排列并相互靠近的程度与高浓度水凝胶中观察到的相似。同时，打印后的水凝胶在培养培养基中表现出更稳定的状态(图6，第7天)，通过对浸渍培养基的大体积样品和打印样品的对比，也可以观察到这种膨胀行为的差异;事实上，在培养基浸泡的前两天，打印凝胶的试样的重量变化值要高于块状凝胶试样(p < 0.05)。打印凝胶和块状凝胶样品分别在培养基中浸泡1、2天后，其重量变化值均高于在水中的重量变化值;然而，在培养基中浸泡3天后，两个样本的体重都开始下降。我们描述了类似的肿胀行为，他们在培养基中进行了3天的肿胀试验后，发现一种甲基纤维素基透明质酸混合物的质量减轻。相比其他天然聚合物用作油墨和生物墨水,如海藻酸凝胶,这里的甲基纤维素基块状水凝胶具有更短的稳定时间窗口。因此，本发明提出的基于甲基纤维素的水凝胶特别适合于细胞片或细胞传递的应用。

细胞生物打印过程

通过生物印迹实验证实了甲基纤维素基水凝胶的细胞相容性及其作为生物墨水的潜在用途。3D打印机经70% w/v乙醇溶液准确消毒后，紫外线照射灭菌1 h，进行生物打印;所有的手术都是在生物学的框架下进行的。甲基纤维素粉是由2周期的紫外线消毒辐照(每次20分钟)处理以及盐溶液的经过无菌处理(菌株滤过直径Ø= 0.22微米)。C2C12小鼠成肌细胞系(ECACC 91031101)作为细胞培养模型;培养基为改良培养基，其组成成分为：10%v/v胎牛血清，谷氨酸盐2mM、羟乙基哌嗪乙硫磺酸10mM,丙酮酸盐1 mM和1%青霉素/链霉素溶液组成。3D打印生物墨水的制备方法，通过将Na2SO4 0.1 M溶液与1:1体积比的培养基混合，得到Na2SO4 0.05 M，再加入C2C12细胞悬液(最终细胞密度为1.3E6个细胞/ml)在生物打印之前，将部分生物墨水手工转移到皮氏培养皿中作为对照。（如与大块水凝胶对照)。生物打印过程使用21 G喷嘴和沉积速度设置为0.5毫米每秒,通过印刷一层环状几何图样(Ø= 1.5厘米);挤出倍增器设置在1和4之间变化(即1、2、3、4)分别探讨其对印迹细胞活力的影响。打印完成后立即在37摄氏度下孵育15分钟以稳定打印环，然后，采用活/死着色来研究细胞的活力。活/死染色液由calcein-AM(Sigma Aldrich提供) 浓度为1 M，和碘化丙啶10 M(Sigma Aldrich提供)溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中构成。用染色液培育30 min, PBS洗涤2次，荧光显微镜观察(型号：Olympus BX51WI)。对每个测试打印参数组合，打印样本(n =3)，获取图像(n = 3);利用ImageJ软件对绿色(活)细胞和红色(死)细胞(分别为非活细胞和非死细胞)进行计数，计算细胞存活率公式为(3)：

存活率%=N_可用细胞×100/N_可用细胞+N_死亡细胞（3）。

将C2C12细胞悬液包埋在甲基纤维素基水凝胶中，以甲基纤维素基水凝胶作为生物墨水。将细胞包埋在甲基纤维素基水凝胶中后的存活率为90%(图7a)，大部分活(绿)细胞通过活/死染色证实(图7b);细胞分布在不同的焦平面上，证明了细胞在水凝胶中的成功分布。然后将得到的生物3D打印墨水装入打印盒中，通过改变挤出倍增器(EM 1、EM 2、EM 3和EM 4，图7c)进行打印。在所有测试条件下都能观察到大多数活的(绿色)细胞;此外，细胞似乎均匀地分布在打印股，其特点是，股的尺寸，相应的变化，以设置挤压倍增器和打印股直径在优化测试中得到。当挤压倍增器设为1时(即，最低生物墨水流量)，细胞存活率的百分比，相当于一个细胞嵌入体积控制水凝胶(即。，生物冲洗前检测水凝胶)。通过增加挤压倍率，我们发现细胞活力下降(图7a)，这是由于随着生物墨水流量的增加，导致细胞在挤压过程中受到的剪切应力增加，死亡(红色)细胞数量增加(图7c)。无论使用何种挤出倍增器，细胞存活率都达到了80%以上，从而证明了本发明提出的甲基纤维素的水凝胶作为生物打印工艺的最佳候选性。

Claims (5)

1.一种采用生物墨水的细胞组织的3D打印方法,其特征在于采用一种甲基纤维素（MC）基水凝胶制备的生物墨水，与改良细胞培养基混合后，用于生物体组织细胞的复杂形状的3D打印成型技术，通过本发明提出的打印条件下，可以实现细胞包埋在该打印墨水中的细胞成活率为90%，通过3D打印后组织器官细胞存活率大于80%。

2.根据权利要求1所述的甲基纤维素（MC）基水凝胶，其物理和形状特征可以分为两种，第一种为块状甲基纤维素基水凝胶，第二种为3D打印甲基纤维素基水凝胶。

3.根据权利要求1所述的生物体组织细胞的复杂形状的3D打印成型技术，打印参数为为保证细胞成活率较高，其打印工艺参数为：温度范围为4℃-37℃之间，21℃最佳，高于或低于此最佳温度，细胞成活率均呈现不同程度衰退，打印沉积速度为0.3-0.7mm/s，打印线径200-2700μm之间，最佳为1012±101μm。

4.根据权利要求1所述的改良细胞培养基，其特征在于其组成成分为：10%v/v胎牛血清，谷氨酸盐2mM、羟乙基哌嗪乙硫磺酸10mM,丙酮酸盐1 mM和1%青霉素/链霉素溶液组成。

5.根据权利要求1所述的甲基纤维素（MC）基水凝胶，其采用的原料甲基纤维素粉需要经过2周期的紫外线消毒辐照(每次20分钟)处理以及盐溶液的经过无菌过滤处理(菌株滤过直径Ø小于等于 0.22微米)。