CN109891239A - 用于提供子痫前期评估和预测早产的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
公开了一种为对象提供子痫前期评估和预测早产的方法。该方法通过以下方法来实施:开发和训练随机森林模型以得出得分度量来区分正常对象、子痫前期对象和早产对象;评估来自对象的标记物组以确定标记物组中每一个的水平;以及将标记物组中每一个的水平提供到随机森林模型中,以提供子痫前期评估和预测早产。该标志物组包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
Description
技术领域
本公开涉及用于提供子痫前期(preeclampsia)评估和预测早产的方法和试剂盒。
背景
子痫前期是一种严重的妊娠的多系统并发症,对母亲和婴儿有不良影响。在美国和全世界,该疾病的发病率约占所有妊娠的5-8%,并且在美国,该疾病占所有产妇死亡的18%。子痫前期的病因和发病机制仍不确定,并且其诊断依赖于疾病过程后期出现的非特异性实验室和临床体征和症状,有时使诊断和临床治疗决策变得困难。更早和更可靠的疾病诊断、预测和监测将获得更及时和个性化的子痫前期治疗,并显著提高我们对子痫前期发病机制的理解。
在美国,所有怀孕的约11%会导致早产(妊娠小于37周),对围产期的发病率和死亡率影响很大(Goldenberg,R.L.and Rouse,D.J.(1998).Prevention of prematurebirth.N Engl J Med 339,313-20)。早产的病因在很大程度上是未知的,并且预测性的生物标记物尚未被充分地开发。
概述
提供了子痫前期/早产标记物、子痫前期/早产标记物组和用于区别普通对象、子痫前期对象和早产对象的方法。这些方法可以用于许多应用,包括例如诊断子痫前期、预测子痫前期或早产、监测患有子痫前期或具有早产风险的对象、以及确定子痫前期或早产的治疗。另外,提供了用于实施本发明方法的系统、装置和试剂盒。
在本发明的一些方面中,提供了一种为特定的对象提供子痫前期评估和预测早产的方法,其包含(i)使用随机选择的对象的多个临床和实验室测试变量来开发和训练随机森林模型,从而得出得分度量(scoring metric)来区分正常对象、子痫前期对象和早产对象;(ii)评估来自特定的对象的标记物组,以确定标记物组中的每一个的水平;以及(iii)将标记物组中的每一个的水平提供到随机森林模型中,以提供子痫前期评估和预测早产,其中所述标记物组包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(body mass index,BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中,所述多个临床和实验室测试变量包含至少两个选自以下的变量:收缩压、舒张压、激活素A、孕龄、蛋白尿、子痫前期史、白细胞计数、早产次数、足月妊娠次数、教育、ADAM12、多胎妊娠、母体身高、母体体重、BMI、流产时间、以及采集血液时的年龄。在一些实施方案中,所述多个临床和实验室测试变量包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
在本发明的一些方面中,提供了子痫前期和早产标记物组,该组包含抑制素βA(激活素A)和一种或多种选自以下的标记物:Adam12(ADAM金属肽酶结构域12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)。
在一个实施方案中,该方法不包括测量FSTL3、APLN、LEP、INHA、PIK3CB、SLC2A1、CRH、HSD17B1、SIGLEC6、PVRL4、HEXB、IL1RAP、MFAP5、HTRA1、EBI3、HTRA4的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量FN1、PEG10、EPAS1、F5、FBN1、HGF、IGF2、AGO2、ATF2、KDM6A、KRAS、MECOM、PDPK1、S100A8、SPTBN1、TRA2B、VEGFA、WNK1、ACSS1、BMP7、CGB、CYP19A1、DLX4、ELOVL2、EZR、HBB、IL6ST、MFSD2A、PEG3和/或SVEP1的表达水平。
在一个实施方案中,本发明的方法不包括测量PAPPA2的表达水平。
在一个实施方案中,该方法不包括测量FSTL3的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量APLN的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量LEP的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量INHA的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量PIK3CB的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量SLC2A1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量CRH的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量HSD17B1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量SIGLEC6的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量PVRL4的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量HEXB的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量IL1RAP的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量MFAP5的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量HTRA1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量EBI3的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量HTRA4的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量F5的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量FBN1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量HGF的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量IGF2的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量AGO2的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量ATF2的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量KDM6A的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量KRAS的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量MECOM的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量PDPK1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量S100A8的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量SPTBN1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量TRA2B的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量VEGFA的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量WNK1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量ACSS1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量BMP7的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量CGB的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量CYP19A1的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量DLX4的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量ELOVL2的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量EZR的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量HBB的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量IL6ST的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量MFSD2A的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量PEG3的表达水平。在一个实施方案中,该方法不包括测量SVEP1的表达水平。
该方法可能特别适合某些怀孕女性,例如有子痫前期史、肥胖、有婴儿的间隔小于两年或大于10年、年龄大于40岁、有某些疾病(包括慢性高血压、偏头痛、1型或2型糖尿病、肾脏疾病、发生血栓的倾向、或狼疮)病史的怀孕女性。
本公开的方法适用于不同怀孕阶段的女性,这是出乎意料的,因为通常这种预测仅针对怀孕超过32周的女性。在一个实施方案中,该女性怀孕16-27周。在一个实施方案中,该女性怀孕28-31周。在一个实施方案中,该女性怀孕16-31周。在一个实施方案中,该女性怀孕少于32周。在一个实施方案中,该女性怀孕32-36周。
该方法可能特别适用于某些怀孕女性,例如吸烟或饮酒、年龄小于17岁或大于35岁、有早产史和/或有压力或不健康的怀孕女性。
一旦确定了子痫前期的诊断,则该女性可以接受有助于改善子痫前期的程序。此类程序的例子包括但不限于降低血压的药物、使用皮质类固醇、抗惊厥药物(例如硫酸镁)、卧床休息、以及如果该诊断在妊娠37周之时或之后做出则考虑分娩。
一旦确定了早产风险,则该女性就可以接受有助于改善早产风险的程序。此类程序的例子包括但不限于施用皮质类固醇、硫酸镁、抗生素或孕激素、以及宫颈环扎术及其组合。
在本发明的一些方面中,提供了对样品进行子痫前期和早产评估的试剂盒。在一些实施方案中,该子痫前期评估是子痫前期诊断。在一些实施方案中,该早产评估是早产诊断。在一些实施方案中,试剂盒包含一种或多种检测元件,其用于测量样品中子痫前期和早产标记物组的标记物的量,所述子痫前期和早产标记物组包含抑制素βA(激活素A)。在一些实施方案中,试剂盒包含一种或多种检测元件,其用于测量样品中子痫前期和早产标记物组的标记物的量,所述子痫前期和早产标记物组包含抑制素βA(激活素A)和Adam12(ADAM金属肽酶结构域12)。在一些实施方案中,试剂盒包含一种或多种检测元件,其用于测量样品中子痫前期和早产标记物组的标记物的量,所述子痫前期和早产标记物组包含抑制素βA(激活素A)和身体质量指数(BMI)。在一些实施方案中,试剂盒包含一种或多种检测元件,其用于测量样品中子痫前期和早产标记物组的标记物的量,所述子痫前期和早产标记物组包含抑制素βA(激活素A)和白细胞计数(WBC)。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含子痫前期表型确定元件。在一些实施方案中,试剂盒包含:一种或多种检测元件,其用于测量样品中子痫前期和早产标记物组的标记物的量,所述子痫前期和早产标记物组包含选自抑制素βA(激活素A)和Adam12(ADAM金属肽酶结构域12)中的一种或多种标记物;以及子痫前期和早产表型确定元件。在一些实施方案中,所述一种或多种检测元件检测样品中标记物多肽的水平。
附图说明
当结合附图阅读时,从以下详细描述可以最好地理解本发明。本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。需要强调的是,根据惯例,附图的各种特征不是按比例的。相反,为了清楚起见,各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下附图。
图1。基于PE生物标记物的发现和验证的多元“组学(omics)”的研究概要。
图2。基于PTB生物标记物的发现和验证的多元“组学”的研究概要。
图3。使用元分析(meta-analysis)、蛋白质图谱分析和人直系同源分析的组合来鉴定PE生物标记物。
图4。使用元分析、蛋白质图谱分析和人直系同源分析的组合来鉴定PTB生物标记物。
图5。PE生物标记物的表达比较分析(PE与对照)。森林图总结了胎盘mRNA表达元分析的结果,以及在不同的早期和晚期孕周的母体的血清分析物丰度定量。线图表示95%置信区间。
图6。早产候选基因的转录分析。左图:胎盘基因表达(单位:FPKM);中图:胎盘与其他器官组织之间的基因表达比率;右图:早产和正常对照之间胎盘组织的基因表达比率。
图7。A:在PE、PTB和对照组中,在血液样品采集的不同孕周的激活素A的生物标记物分布的箱线图显示和散点图。水平框边界线和中线表示样品四分位数。B:激活素A的生物标记物分布与血液样品采集(上图)、分娩(下图)和其间的间隙(中间)的孕周的函数的散点图。
图8。A:在PE、PTB和对照组中,在血液样品采集的不同孕周的Adam12的生物标记物分布的箱线图显示和散点图。水平框边界线和中线表示样品四分位数。B:Adam12的生物标记物分布与血液样品采集(上图)、分娩(下图)和其间的间隙(中间)的孕周的函数的散点图。
图9。A:每个样品的分数分布。B:算法中每个特征的重要性。分数和特征重要性是由用激活素A和Adam12的组开发的随机森林算法产生的。
图10。A:每个样品的分数分布。B:算法中每个特征的重要性。分数和特征重要性是由用激活素A和BMI的组开发的随机森林算法产生的。
图11。A:每个样品的分数分布。B:算法中每个特征的重要性。分数和特征重要性是由用激活素A和白细胞计数的组开发的随机森林算法产生的。
详细说明
提供了子痫前期和早产标记物、子痫前期和早产标记物组、以及用于获得样品的子痫前期和早产标记物水平表示的方法。这些组合物和方法可用于许多应用,包括例如诊断子痫前期、预测子痫前期或早产、监测患有子痫前期或有早产风险的对象、以及确定子痫前期和早产的治疗。另外,提供了用于实施本发明方法的系统、装置和试剂盒。在阅读下面更全面描述的组合物和方法的细节时,本发明的这些和其他目的、优点和特征对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
在描述本发明的方法和组合物之前,应理解本发明不限于所述的特定的方法或组合物,因为其当然可以改变。还应理解,本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的,而不旨在是限制性的,因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
在提供一系列值的情况下,应当理解,还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值,至下限单位的十分之一,除非上下文另有明确规定。在所述范围内的任何规定值或中间值和在所述范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围,都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内,并且在所述较小范围内包括任一个、零个或两个极限的每个范围也包括在本发明内,可以在所述范围内排除任何具体的极限。在所述范围包括极限中的一个或两个的情况下,排除那些被包括的极限之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可被用于本发明的实施或测试,但是现在描述一些可能的和优选的方法和材料。通过引用将本文提及的所有出版物并入本文,以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解,本公开取代所并入的出版物的任何公开内容,直至有矛盾的程度。
本领域技术人员在阅读本公开内容时显而易见的是,本文描述和列举的每个单独实施方案具有离散的成分和特征,其可以容易地与其他几个实施方案的任何特征分离或组合,而不背离开本发明的范围或精神。任何列举的方法都可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
必须注意的是,如本文和所附权利要求中所使用的,单数形式“一”、“一个/一种”和“该/所述”包括复数指示物,除非上下文另有明确说明。因此,例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞,并且提及“该肽”包括提及一种或多种肽及其等效物,例如,本领域技术人员已知的多肽等。
本文讨论的出版物仅仅是因为它们在本申请的提交日之前公开而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权通过在先发明而先于这些出版物。此外,提供的出版日期可能与实际出版日期不同,可能需要独立确认。
如上所概述,本发明的各方面包括用于提供子痫前期和早产评估(例如诊断、预测、监测和/或治疗对象的子痫前期和/或早产)的方法、组合物、系统和试剂盒。
“子痫前期”或“先兆子痫”是指妊娠的多系统并发症,可能伴有一个或多个以下症状:高血压、蛋白尿、手和面部/眼睛肿胀(水肿)、体重突然增加、肝酶比正常更高和血小板减少症。子痫前期通常发生在妊娠后期,但是在严重的情况下,该疾病发生在妊娠中期,例如在妊娠的第22周之后。如果没有解决,则子痫前期能够导致子痫,即与先前存在的脑状况无关的癫痫。“早产”或“自发性早产”是指早产,也称为早产(premathre birth),即孕龄小于37周时婴儿出生。这些婴儿被称为早产儿。早产的症状包括发生频率高于每十分钟的子宫收缩或从阴道泄漏液体。早产儿患脑瘫、发育迟缓、听力问题和视觉问题的风险更大。婴儿出生越早,这些风险越大。“诊断”子痫前期/早产或“提供子痫前期/早产诊断”,通常意味着提供子痫前期/早产的确定,例如,确定对象(例如,有子痫前期/早产临床症状的对象、对子痫前期/早产无症状但有与子痫前期相关的风险因素的对象、对子痫前期无症状并且没有与子痫前期/早产相关的风险因素的对象)目前是否受子痫前期的影响、将对象的子痫前期/早产分类为疾病或病症的亚型、确定子痫前期/早产的严重程度等等。“预测”子痫前期/早产或“提供子痫前期/早产预测”,通常意味着提供子痫前期/早产的预测,例如,预测对象发展成子痫前期/早产的易感性或风险、预测疾病进展的过程和/或疾病结果(例如,预期的子痫前期/早产的发作、预期的子痫前期的持续时间、预期子痫前期是否会发展成子痫等)、预测对象对子痫前期/早产治疗的反应性(例如阳性反应、阴性反应、完全没有反应)等。“监测”子痫前期/早产,通常意味着监测对象的状况,例如,告知子痫前期/早产的诊断、告知子痫前期/早产的预测、提供关于子痫前期/早产治疗的效果或功效的信息等。“治疗”子痫前期/早产,是指在哺乳动物中对子痫前期/早产进行开药或提供任何治疗,并且包括:(a)在可能有倾向患有患子痫前期/早产但尚未被诊断为患有子痫前期/早产的对象中防止子痫前期/早产发生;(b)抑制子痫前期/早产,即阻止其发展;或(c)缓解子痫前期/早产,即引起子痫前期/早产退化。
在本公开的各方面,提供了用于预测早产状况的方法、试剂盒和试剂。如本文所用的“预测”通常包括预测对象对疾病或病症(即早产)的易感性;确定或诊断对象目前是否受疾病或病症(即早产)影响;对受疾病或病症影响的对象的预测(例如确定早产的严重程度、早产状况将会发展为早期分娩的可能性);预测对象对疾病或病症的治疗的反应度;并监测对象的状况以提供关于治疗的效果或功效的信息。本文使用的术语“治疗”、“处理”等通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言,所述效果可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言,所述效果可以是治疗性的。本文所用的“治疗”包括对哺乳动物疾病的任何治疗,并且包括:(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的对象中发生;(b)抑制疾病,即阻止其发展;或(c)缓解疾病,即引起疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。稳定或减少患者的不良临床症状的持续疾病的治疗特别令人感兴趣。期望这种治疗在受影响的组织中完全丧失功能之前进行。本发明疗法将理想地在疾病的症状阶段期间施用,并且在一些情况中在疾病的症状阶段之后施用。术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用,并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象,特别是人。
身体质量指数(BMI),也称为Quetelet指数,是从个体的质量(体重)和身高得出的值。BMI定义为体重除以身高的平方,并且以kg/m2为单位普遍表示,由千克质量和米高度得出。BMI试图量化个体中组织质量(肌肉、脂肪和骨骼)的量,然后根据该值将该人分类为体重不足、正常体重、超重或肥胖。普遍接受的BMI范围是体重不足:低于18.5kg/m2,正常体重:18.5至25,超重:25至30,肥胖:超过30。
白细胞(WBC),也称为白血球,是免疫系统的重要组成部分。这些细胞通过攻击侵入身体的细菌、病毒和病菌来帮助对抗感染。白细胞起源于骨髓,但在整个血液中循环。有五种主要类型的白细胞:中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞。WBC计数是一种测量体内白细胞数量的试验。该试验通常包括全血细胞计数(CBC)。血液含有每种白细胞的百分比。然而,有时,由于发烧、发冷、感染等医疗情况,白细胞计数可能会下降或上升到健康范围之外。
在描述本发明时,首先描述可用于提供子痫前期评估的组合物,然后描述其使用的方法、系统和试剂盒。
子痫前期和早产标记物和组
在本发明的一些方面,提供了子痫前期和早产标记物和子痫前期和早产标记物组。“子痫前期和早产标记物”是指分子实体,其在样品中的表示与子痫前期表型或早产表型相关。例如,与健康个体相比,在来自将发展或已发展为子痫前期或将要早产的个体的样品中;以及与将要早产的健康个体相比,在来自将发展或已发展为子痫前期的个体的样品中,子痫前期和早产标记物可以差异地表示,即以不同水平表示;在一些情况中,标记物的水平升高与子痫前期表型和/或早产表型相关。例如,在与子痫前期表型或早产表型相关的样品中,样品中标记物的浓度可以是与子痫前期表型或早产表型无关的样品的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍或更多;或者,在与子痫前期表型相关的样品中,样品中标记物的浓度可以是与早产表型相关的样品的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍或更多。在其他情况中,标记物的水平降低与子痫前期表型或早产表型相关。例如,在与子痫前期或早产表型相关的样品中,样品中标记物的浓度可以比与子痫前期或早产表型无关的样品少10%、少20%、少30%、少40%、少50%或少更多;或者,在与子痫前期表型相关的样品中,样品中标记物的浓度可以比与早产表型相关的样品少10%、少20%、少30%、少40%、少50%或少更多。
子痫前期和早产标记物可以包括与子痫前期、早产相关的蛋白质及其相应的基因序列,即mRNA、DNA等。“基因”或“重组基因”是指包含编码蛋白质的开放阅读框的核酸。
编码序列的边界由处于5′(氨基)末端的起始密码子和处于3′(羧基)末端的翻译终止密码子决定。转录终止序列可以位于编码序列的3′端。另外,基因可以任选地包括其天然启动子(即,在非重组细胞(即天然存在的细胞)中,基因的外显子和内含子可操作地与其连接的启动子)和相关的调节序列,并且可以具有或者不具有在AUG起始位点上游的序列,并且可以包括或不包括未翻译的前导序列、信号序列、下游非翻译序列、转录起始和终止序列、多腺苷酸化信号、翻译起始和终止序列、核糖体结合位点等。
如本公开的实施例中所证明的,发明人已经鉴定了许多与子痫前期或早产相关的分子实体,并且其可以在提供子痫前期和早产评估中组合(即作为组)使用,例如,诊断子痫前期、预测子痫前期和早产、监测患有子痫前期和/或早产的对象、确定对患有子痫前期或早产的对象的治疗等。这些包括但不限于:抑制素βA(激活素A,Genbank登录号NM_002192)、ADAM金属肽酶结构域12(Adam12,Genbank登录号NP_001275903.1,NM_001288974.1[O43184-4];NP_001275904.1.NM_001288975.1.[O43184-3],NP_003465.3,NM_003474.5,[O43184-1],NP_067673.2.NM_021641.4.[O43184-2])。
如上所述,本文还提供了子痫前期和早产组。子痫前期和早产标记物的“组(panel)”,是指两种或更多种子痫前期和早产标记物,例如3种或更多种、4种或更多种、或者5种或更多种标记物,当以组合考虑时,其水平可以用于提供子痫前期和早产评估,例如,进行子痫前期和早产风险的诊断、预测、监测和/或治疗。特别感兴趣的是包含子痫前期和早产标记物激活素A和Adam12的组。例如,在一些实施方案中,子痫前期组可以包含激活素A和Adam12。
在本发明方法中用作子痫前期组的子痫前期和早产标记物的其他组合,可以被普通技术人员使用任何方便的统计学方法容易地鉴定,例如,如本领域已知的或本文可行的实施例中所述的。例如,可以通过组合遗传算法(GA)和所有配对(AP)支持向量机(SVM)方法来选择分析物的组用于子痫前期分类分析。预测性的特征是自动确定的,例如,通过迭代GA/SVM,其产生非常紧凑的非冗余的子痫前期相关分析物,具有最佳分类性能。虽然不同的分类器集通常仅具有适度的重叠基因特征,但它们在上述和本文可行的实施例中提供子痫前期评估时将具有相似的准确度。
方法
在本发明的一些方面中,提供了为特定的对象提供子痫前期评估和预测早产的方法。为了启动这些方法,需要使用随机选择的对象的多个临床和实验室测试变量来开发和训练随机森林模型,从而得出得分度量来区分正常对象、子痫前期对象和早产对象。
随机森林模型是通过随机森林算法生成的模型。随机森林或随机决策森林是用于分类、回归和其他任务的集成学习方法,其通过在训练时间构建多个决策树并输出作为类(分类)的模式或对各个树的平均预测(回归)的类来操作。随机决策森林的第一个算法是由Tin Kam Ho使用随机子空间方法创建的,在Ho的公式中,这是实现Eugene Kleinberg提出的“随机区别”分类方法的一种方法。该算法的扩展由Leo Breiman和Adele Cutler开发,并且“Random Forests”是他们的商标。该扩展结合了Breiman的“装袋(bagging)”理念和随机选择的特征,其首先由Ho介绍,后来由Amit和Geman独立引入,以构建具有受控方差的决定树集合。
“森林”包含多个二元的“树”,并且在每个节点处,通过选择产生最大节点间隔的分割变量值来分割“树”。构建“树”直到每个终端节点达到1的样品大小。通过对每个树的决策进行平均来达到最终决策(Breiman L.Random forests.Machine Learning 2001;45:5-32;BreimanL.Baggingpredictors.MachineLearning 1996;24:123-40.)。在文献中构建了示例性的随机森林模型(参见,例如Shiying Hao et.al.Classification Tool forDifferentiation of Kawasaki Disease from Other Febrile Illnesses,The Journalof Pediatrics,Volume 176,September 2016,Pages 114-120.e8)。
为了实践这些方法,使用随机选择的对象的多个临床和实验室测试变量。多个临床和实验室测试变量包含至少两个选自以下生理和/或生化因子的变量,包括但不限于:收缩压、舒张压、激活素A、孕龄、蛋白尿、子痫前期史、白细胞计数、早产次数、足月妊娠次数、教育、ADAM12、多胎妊娠、母体身高、母体体重、BMI、流产时间、以及采集血液时的年龄。在一些实施方案中,多个临床和实验室测试变量包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
术语“生物样品”包含从生物体获得的多种样品类型,并且能够被用于诊断、预测或监测分析。该术语包含生物来源的血液和其他液体样品或由其衍生的细胞及其后代。该术语包含在获得后以任何方式操作的样品,例如通过试剂处理、溶解、或富集某些组分。该术语包含临床样品,还包括细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体、以及组织样品。用于本发明方法中的临床样品可以从多种来源获得,特别是血液样品。
在一些实施方案中,样品是血清或血清衍生的样品。可以使用用于生产流体血清样品的任何方便的方法。在许多实施方案中,该方法采用通过皮肤穿刺(例如手指针刺、静脉穿刺)将静脉血抽入凝血或血清分离管中,使血液凝结,并进行离心以将血清从凝结的血液分离。然后采集血清并储存直至测定。一旦获得来自患者的样品,则测定样品以确定子痫前期标记物的水平。
通常在妊娠的中期或晚期从个体获得对象样品。“妊娠”是指哺乳动物中怀孕的持续时间,即从受精到出生的发育时间间隔加上两周,即到最后一次月经的第一天。中期妊娠或晚期妊娠,是指妊娠的第二或第三部分,每个部分长3个月。因此,例如,“早期妊娠”是指从最后一次月经的第一天到妊娠的第13周;“中期妊娠”是指从妊娠第14周至第27周;“妊娠晚期”是指从第28周到出生,即妊娠第38-42周。换句话说,可以在以下时期获得对象样品:在大约妊娠第14周至第42周、在大约妊娠18周至42周、在大约妊娠第20周至第42周、在大约妊娠第24周至第42周、在大约妊娠第30周至第42周、在大约妊娠第34周至第42周、在大约妊娠第38周至42周。因此,在一些实施方案中,可以在妊娠早期获得对象样品,例如,在妊娠14周或更长时间,例如在妊娠第14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周或23周或更长时间,更常见是在妊娠第24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周或33周或更长时间。在一些实施方案中,可以在妊娠晚期获得对象样品,例如,在妊娠34周之时或之后,例如,在妊娠第35周、第36周、第37周、第38周、第39周、第40周或第41周。
一旦获得样品,则可以将其直接使用、冷冻或在适当的培养基中维持短时间。通常,该样品来自人类患者,尽管可以使用动物模型,例如,马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物(例如老鼠、大鼠、仓鼠、灵长类动物等)。可以在本发明方法中,评估证明在患有子痫前期的患者中本文公开的一种或多种子痫前期标记物的差异表达的任何方便的组织样品。通常,合适的样品来源将来自其中已经被释放进感兴趣的分子实体(即RNA转录物或蛋白质)的流体。
可以以多种方式处理对象样品,以增强一种或多种子痫前期标记物的检测。例如,在样品是血液的情况下,可以在测定之前从样品中除去红细胞(例如通过离心)。这种处理可以用于降低使用亲和试剂检测子痫前期和早产标记物水平的非特异性背景水平。也可以通过使用本领域熟知的方法(例如酸沉淀、醇沉淀、盐沉淀、疏水沉淀、过滤(使用能够保留大于30kD的分子的过滤器,例如Centrim 30TM)、亲和纯化)浓缩样品,增强子痫前期和早产标记物的检测。在一些实施方案中,将测试和对照样品的pH调节至并保持在接近中性的pH(即pH 6.5-8.0)。这种pH调节将防止复合物形成,从而提供样品中标记物水平的更准确的定量。在样品是尿液的实施方案中,调节样品的pH并浓缩样品以增强标记物的检测。
在实施本发明方法时,评估在来自个体的生物学样品中子痫前期和早产标记物的水平。可以通过任何方便的方法评估在对象样品中一种或多种子痫前期和早产标记物的水平。例如,可以通过测量一种或多种子痫前期基因的一种或多种核酸转录物(例如mRNA)的水平/量,检测子痫前期/早产基因表达水平。可以通过测量一种或多种蛋白质/多肽的水平/量,检测蛋白质标记物。术语“评估”、“测定”、“测量”、“评价”和“确定”可互换使用,是指任何形式的测量,包括确定元素是否存在,并且包括定量和定性测定。评估可以是相对的或绝对的。
例如,可以通过在样品中检测一种或多种蛋白质/多肽或其片段的量或水平,以达到蛋白质水平表示,来评估至少一种子痫前期和早产标记物的水平。本申请中使用的术语“蛋白/蛋白质”和“多肽”是可互换的。“多肽”是指氨基酸的聚合物(氨基酸序列),并不是指分子的特定长度。因此肽和寡肽包括在多肽的定义内。该术语还指或包括翻译后修饰的多肽,例如,糖基化多肽、乙酰化多肽、磷酸化多肽等。定义中包括的是,例如,含有一种或多种氨基酸的类似物的多肽、具有取代键的多肽、以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其他修饰。
当要检测蛋白质水平时,可以使用用于评估蛋白质水平的任何方便的方案,其中确定被测定的样品中的一种或多种蛋白质的水平。例如,用于测定蛋白质水平的一种代表性和方便类型的方案是ELISA。在ELISA和基于ELISA的测定中,可以将一种或多种对感兴趣的蛋白质特异的抗体固定至所选择的固体表面上,该表面优选是表现出蛋白质亲和力的表面,例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。在洗涤以除去未完全吸附的物质之后,对测定板孔涂覆非特异性“阻断”蛋白质,已知该蛋白质对于测试样品具有抗原中性,例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或粉末牛奶的溶液。这允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点,从而减少由抗原非特异性结合到表面上而引起的背景。在洗涤以去除未结合的阻断蛋白之后,在有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下,将固定表面与待测样品接触。这些条件包括:用稀释剂稀释样品,所述稀释剂例如是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween或PBSATriton-X100中的BSA或牛γ球蛋白(BGG),这也有助于减少非特异性背景;以及允许样品在约25℃-27℃的温度下温育约2-4小时(尽管可以使用其他温度)。温育后,洗涤抗血清接触的表面,以除去非免疫复合物质。示例性的洗涤程序包括用例如PBS/Tween、PBS/Triton-X 100或硼酸盐缓冲液的溶液进行洗涤。然后通过以下方法来确定免疫复合物形成的出现和量:使结合的免疫复合物经受对靶标具有特异性的第二抗体(其不同于第一抗体),并检测第二抗体的结合。在某些实施方案中,第二抗体将具有相关的酶,例如脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶,其在与合适的生色底物一起温育后会产生颜色沉淀。例如,可以使用脲酶或过氧化物酶缀合的抗人IgG,持续一段时间并且在有利于免疫复合物形成的条件下(例如,室温下在含PBS的溶液(例如PBS/Tween)中温育2小时)。在与第二抗体温育并洗涤以除去未结合的物质后,量化标记的量,例如通过与生色底物一起温育,所述生色底物例如在脲酶标记的情况下是尿素和溴甲酚红紫,或在过氧化物酶标记的情况下是2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和H2O2。然后通过测量颜色产生的程度来实现定量,例如使用可见光谱分光光度计。
可以通过首先将样品结合到测定板来改变前述形式。然后,第一抗体与测定板一起温育,然后使用对第一抗体具有特异性的经标记的第二抗体检测被结合的第一抗体。
上述固定有一种或多种抗体的固体底物可以由多种材料制成和具有多种形状,例如微量滴定板、微珠、试纸、树脂颗粒等。可以选择底物来最大化信噪比、最小化背景结合、以及易于分离和降低成本。可以以最适合所用底物的方式进行洗涤,例如,通过从储层中移除珠子或量油尺,清空或稀释例如微量滴定板孔的储层,或冲洗珠子、颗粒、色谱柱或用洗涤溶液或溶剂过滤。
替代地,可以使用用于测量样品中一种或多种蛋白质的水平的非基于ELISA的方法。代表性的例子包括但不限于质谱、蛋白质组阵列、xMAPTM微球技术、流式细胞术、蛋白质印迹和免疫组织化学。
作为另一个实施例,可以通过在患者样品中检测由感兴趣的基因编码的一种或多种RNA转录物或其片段的量或水平,以达到核酸标记物表示,来评估至少一种子痫前期和早产标记物的水平。可以使用任何方便的方案检测样品中核酸的水平。虽然已知多种不同的检测核酸的方式,例如在差异基因表达分析领域中使用的方法,但是用于产生标记物表示的一种代表性和方便类型的方案是基于阵列的基因表达谱分析方案。这样的应用是杂交测定,其中使用的核酸显示在要产生的标记物表示中待测定/分析的每个基因的“探针”核酸。在这些测定中,首先从被测定的初始核酸样品中制备靶核酸的样品,其中制备可以包括用标记物(例如信号产生系统的成员)标记靶核酸。在靶核酸样品制备之后,样品在杂交条件下与阵列接触,由此在与附着至阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后定性或定量检测杂交复合物的存在。
可以实施特定的杂交技术以产生本发明方法中采用的标记物表示,该技术包括在美国专利号5,143,854、5,288,644、5,324,633、5,432,049、5,470,710、5,492,806、5,503,980、5,510,270、5,525,464、5,547,839、5,580,732、5,661,028、5,800,992;以及WO 95/21265、WO 96/3 1622、WO 97/10365、WO 97/27317、EP 373 203、和EP 785 280中描述的技术,其公开内容通过引用并入本文。在这些方法中,如上所述,将包括其表达正被测定的每种表型决定基因的探针的“探针”核酸阵列,与靶核酸接触。接触在杂交条件下进行,例如严格杂交条件,然后除去未结合的核酸。如本文所用的术语“严格测定条件”是指与产生核酸结合配对相容的条件,例如表面结合和溶液相核酸,具有足够的互补性,以在测定中提供所需的特异性水平,同时互补性不足的结合成员之间结合配对的形成不太相容,以提供所需的特异性。严格的测定条件是杂交和洗涤条件的总和或组合(总体)。
所得到的杂交核酸的模式提供了关于已经探测的每个基因的表达的信息,其中表达信息是就基因是否表达、并且通常以什么水平表达而言的,其中表达数据,即表达表示(例如以转录物的形式),可以是定性的和定量的。
替代地,可以使用用于定量样品中一种或多种核酸水平的非基于阵列的方法,包括基于扩增方案的方法,例如基于聚合酶链反应(PCR)的测定,包括定量PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR等。
分子和细胞生物化学中的一般方法能够在以下标准教科书中找到,例如分子的克隆:实验室手册,第三版(Sambrook et a1.,HaRBor Laboratory Press 2001)、精编分子生物学实验指南,第四版(Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons 1999)、蛋白质方法(Bollag etal.,John Wiley&Sons 1996)、用于基因疗法的非病毒载体(Wagner eta1.eds.,Academic Press 1999)、病毒载体(Kaplift&Loewy eds.,Academic Press1995)、免疫学方法手册(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)、以及细胞和组织培养:生物技术中实验室操作规程(Doyle&Griffiths,JohnWiley&Sons 1998),其公开内容通过引用并入本文。本公开中提及的用于基因的操作的试剂、克隆载体和试剂盒可以从商业供应商获得,例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。
得到的数据提供关于样品中已经探测的每种标记物的水平的信息,其中信息是就标记物是否存在、以及通常以什么水平存在而言,并且其中数据可以是定性的和定量的。因此,在检测是定性的情况下,该方法提供读数或评估(例如估算)目标标记物(例如核酸或蛋白质)是否存在于待测样品中。在其他实施方案中,该方法提供定量检测目标标记物是否存在于待测样品中,即估算或评估目标分析物(例如核酸或蛋白质)在待测样品中的实际量或相对丰度。在此类实施方案中,定量检测可以是绝对的,或者如果该方法是检测样品中的两种或更多种不同分析物(例如靶核酸或蛋白质)的方法,则定量检测可以是相对的。因此,当用在定量样品中目标分析物(例如核酸或蛋白质)的上下文中时,术语“定量”可以指绝对定量或相对定量。可以通过包含一种或多种对照分析物的已知浓度并参考用已知对照分析物检测的目标分析物水平(例如通过产生标准曲线),完成绝对定量。替代地,可以通过比较两种或更多种不同目标分析物之间的检测水平或量,以提供两种或更多种不同分析物中的每一种的相对定量(例如相对于彼此),完成相对定量。
一旦确定了一种或多种子痫前期和早产标记物的水平,则将标记物组中的每一个的水平输入(通过例如输入计算机)随机森林模型中以提供子痫前期评估和预测早产。
效用
子痫前期评估和早产预测可以用于诊断子痫前期和预测早产,也就是说,确定对象是否受子痫前期影响或是否会受早产影响、子痫前期和/或早产的类型、子痫前期和/或早产的严重程度等。在某些情况中,对象可能出现子痫前期的临床症状,例如,血压升高(例如140/90mm/Hg或更高)、蛋白尿、体重突然增加(超过1-2天或每周超过2磅)、水份保持(水肿)、肝酶升高、和/或血小板减少症(压低的血小板计数小于100,000)。在其他情况中,对象对于子痫前期可能是无症状的,但具有与子痫前期相关的风险因素,例如,如妊娠期糖尿病、I型糖尿病、肥胖症、慢性高血压、肾脏疾病、血栓形成倾向等医疗状况;非洲裔美国人或菲律宾人血统;年龄大于35岁或小于20岁;有子痫前期的家族史;未产妇;先前怀孕的子痫前期;和/或压力。在其他情况下,对象可能存在早产的危险因素,例如,糖尿病、高血压、多于一个婴儿的怀孕、肥胖或体重不足、多种阴道感染、吸烟和心理压力等。在其他情况中,对象对于子痫前期/早产可能是无症状的,并且没有与子痫前期/早产相关的风险因素。
作为另一个实施例,子痫前期评估和早产预测可以用于预测子痫前期和/或早产,也就是说,提供子痫前期和/或早产预测。例如,子痫前期和早产标记物水平表示可以被用于预测对象发展成子痫前期和早产的易感性或风险。“预测个体是否会发展成子痫前期和早产”,是指确定个体在接下来的一周、接下来的两周、接下来的三周、接下来的五周、接下来的两个月、接下来的三个月、例如妊娠剩余的时间内发展成子痫前期的可能性。子痫前期和早产标记物水平表示可以被用于预测疾病进展的过程和/或疾病结果,例如预期的子痫前期和/或早产的发作、预期的子痫前期的持续时间、预期子痫前期是否会发展成子痫等。子痫前期和早产标记物水平表示可以被用于预测对象对子痫前期和早产治疗的反应性,例如,阳性反应、阴性反应、完全没有反应。
作为另一个实施例,可以使用子痫前期评估和早产预测来监测子痫前期或早产。“监测”子痫前期或早产,通常意味着监测对象的状况,例如,告知子痫前期/早产的诊断、告知子痫前期/早产的预测、提供关于子痫前期/早产治疗的效果或功效的信息等。
作为另一个实施例,可以使用子痫前期评估和早产预测来确定对象的治疗。本文使用的术语“治疗”、“处理”等通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言,所述效果可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言,所述效果可以是治疗性的。本文所用的“治疗”包括对哺乳动物疾病的任何治疗,并且包括:(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的对象中发生;(b)抑制疾病,即阻止其发展;或(c)缓解疾病,即引起疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。稳定或减少患者的不良临床症状的持续疾病的治疗特别令人感兴趣。本发明疗法可以在疾病的症状阶段之前施用,并且在一些情况中在疾病的症状阶段之后施用。术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用,并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象,特别是人。子痫前期治疗在本领域中是公知的,并且可以包括卧床休息、多喝水、低盐饮食、控制血压的药物、皮质类固醇、诱导怀孕等。
在一些实施方案中,提供子痫前期/早产评估(例如诊断子痫前期/早产、预测子痫前期/早产、监测子痫前期/早产等)的本发明方法,可以包含与上述方法结合使用的额外评估。例如,本发明方法可以进一步包含测量与子痫前期相关的一个或多个临床参数/因子,例如,血压、尿蛋白、体重变化、水份保持(水肿)、肝酶水平和血小板计数。例如,可以在以下时间评估对象的一种或多种临床症状(例如,高血压、蛋白尿等):在妊娠的第14周或更长时间,例如,妊娠的第15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周或更长时间,其中临床评估(即,与子痫前期/早产相关的一种或多种症状的检测)的阳性结果与标记物水平表示结合使用以提供子痫前期/早产诊断、子痫前期/早产预测、监测子痫前期/早产等。在一些情况中,可以在获得子痫前期和早产标记物水平表示之前测量临床参数,例如,以告知技术人员是否应当获得子痫前期和早产标记物水平表示,例如,以做出或确认子痫前期/早产诊断。在一些情况中,可以在获得子痫前期标和早产记物水平表示之后测量临床参数,例如,以监测子痫前期。
作为另一个实施例,提供子痫前期评估和预测早产的本发明方法可以进一步包含评估与发生子痫前期/早产的风险相关的一个或多个因素。子痫前期/早产风险因素的非限制性例子包括,例如:医疗状况,例如妊娠期糖尿病、肥胖症、慢性高血压、肾脏疾病、血栓形成倾向等;年龄大于35岁或小于20岁;有子痫前期的家族史;未产妇;先前怀孕的子痫前期;压力;多于一个婴儿的怀孕;肥胖或体重不足;多种阴道感染;吸烟。例如,当首次确认怀孕或之后可以评估对象的一种或多种风险因素,例如医疗状况、家族史等,其中风险评估(即确定与子痫前期/早产相关的一种或多种风险因素)的阳性结果与标记物水平表示结合使用来提供子痫前期/早产诊断、子痫前期/早产预测、监测子痫前期/早产等。
本发明的方法可以用于各种不同类型的对象。在许多实施方案中,对象属于哺乳动物类,包括食肉动物(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)、兔形目(例如兔)和灵长目(例如人类、黑猩猩和猴子)。在某些实施方案中,动物或宿主(即对象(在本文中也称为患者))是人。
在一些实施方案中,提供子痫前期评估和预测早产的本发明的方法包括提供诊断、预测、或结果的监测。在一些实施方案中,可以通过提供(即生成)包括技术人员的评估的书面报告来提供本公开的子痫前期/早产评估,例如,技术人员确定患者目前是否受子痫前期/早产影响、对象子痫前期/早产的类型、阶段或严重程度等(“子痫前期/早产诊断”);技术人员预测患者发生子痫前期/早产的易感性、疾病进展过程、患者对治疗的反应度等(即,技术人员的“子痫前期/早产预测”);或者技术人员监测子痫前期/早产的结果。因此,本发明方法还可以包括生成或输出提供技术人员的评估结果的报告的步骤,该报告可以以电子媒介(例如,计算机监视器上的电子显示)的形式,或者以有形媒介的形式(例如,印在纸或其他有形媒介上的报告)提供。可以提供任何形式的报告,例如,如本领域中已知的或如下文更详细描述的。
报告
如本文所述的“报告”是电子的或有形的文档,其包括提供与对象的评估及其结果相关的感兴趣的信息的报告元素。在一些实施方案中,对象报告至少包括子痫前期和早产标记物表示,例如子痫前期/早产表达谱或子痫前期/早产分数,如上详细讨论的。在一些实施方案中,对象报告至少包括技术人员的子痫前期/早产评估,例如,子痫前期/早产诊断、子痫前期/早产预测、子痫前期/早产监测的分析、治疗建议等。可以完全或部分以电子方式生成对象报告。对象报告还能够包括以下中的一个或多个:1)关于测试设施的信息;2)服务提供商信息;3)患者数据;4)样品数据;5)评估报告,其可以包括各种信息,包括:a)采用的参考值,和b)测试数据,其中测试数据可以包括例如蛋白质水平测定;6)其他功能。
该报告可以包括有关测试设施的信息,该信息与进行样品采集和/或数据生成的医院、诊所或实验室相关。样品采集能够包括从对象获得流体样品,例如血液、唾液、尿液等;组织样品,例如组织活检等。数据生成能够包括测量子痫前期/早产患者与健康个体(即没有和/或不发展成子痫前期/早产的个体)中的标记物浓度。该信息能够包括一个或多个细节,该细节涉及例如测试设施的名称和位置、进行测定和/或登记输入数据的实验室技术人员的身份、进行和/或分析测定的日期和时间、存储样品和/或结果数据的位置、测定中使用的试剂(例如试剂盒等)的批号等。该信息的报告字段通常能够使用用户提供的信息填充。
该报告可以包括关于服务提供商的信息,该服务提供商可以位于用户所在的医疗保健机构之外,或者位于医疗保健机构之内。此类信息的实施例能够包括服务提供商的名称和位置、评论者的姓名、以及在必要或期望的情况下进行样品采集和/或数据生成的个人的姓名。该信息的报告字段通常能够使用用户输入的数据来填充,该数据能够从预先编写的选择(例如,使用下拉菜单)中选择。报告中的其他服务提供商信息可以包括关于结果和/或关于解释报告的技术信息的联系信息。
该报告可以包括患者数据部分,包括:患者病史(其可以包括例如年龄、种族、血清型、先前的子痫前期/早产发作和怀孕的任何其他特征);以及管理性患者数据,例如识别患者的信息(例如,姓名、患者出生日期(DOB)、性别、邮寄和/或住所地址、医疗记录号(MRN)、医疗机构中的房间和/或床号、保险信息等);下令进行监测评估的患者的医师或其他健康专业人员的姓名,并且如果与下令的医师不同,则还包括负责患者护理的职员医师的姓名(例如,初级保健医生)。
该报告可以包括样品数据部分,其可以提供关于在监测评估中分析的生物样品的信息,例如从患者获得的生物样品的来源(例如血液、唾液或组织类型等)、如何处理样品(例如储存温度、准备方案)和采集的日期和时间。该信息的报告字段通常能够使用用户输入的数据来填充,其中一些可以作为预先编写的选择(例如,使用下拉菜单)而被提供。该报告可以包括结果部分。例如,该报告可以包括报告蛋白质水平测定分析结果的部分(例如,“血清中6.0ng/ml激活素A”)或计算的子痫前期/早产分数。
该报告可以包括评估报告部分,其可以包括在如本文所述的数据处理之后生成的信息。解释性报告能够包括预测对象发展为子痫前期/早产的可能性。解释性报告能够包括子痫前期/早产的诊断。解释性报告能够包括子痫前期/早产的表征。报告的评估部分还能够任选地包括建议。例如,在结果表明可能是子痫前期/早产的情况下,所述建议能够包括如本领域所推荐地改变饮食、施用血压药物等的建议。
容易理解的是,报告能够包括额外的元素或修改后的元素。例如,在电子版本中,报告能够包含指向内部或外部数据库的超链接,这些数据库提供有关报告所选元素的更详细的信息。例如,报告的患者数据元素能够包括对电子患者记录的超链接,或者用于访问这样的患者记录的站点,该患者记录被保存在机密数据库中。后一实施方案可能在医院内系统或临床环境中是有兴趣的。当处于电子格式时,报告被记录在合适的物理介质上,例如计算机可读介质,例如计算机存储器、zip驱动器、CD、DVD等。
容易理解的是,报告能够包括上述要素中的所有或一些,前提条件是报告通常至少包括足以提供用户要求的分析的元素(例如计算的子痫前期和早产标记物水平表示;子痫前期/早产的预测、诊断或表征)。
试剂、系统和试剂盒
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂、系统及其试剂盒。本发明的试剂、系统及其试剂盒可以有很大不同。感兴趣的试剂包括特别地设计用于确定来自样品的子痫前期和早产标记物的水平的试剂,例如,一种或多种确定元件,例如,用于检测蛋白质的抗体或肽、用于检测核酸的寡核苷酸等。在一些情况下,检测元件包含用于检测单个子痫前期和早产标记物的表达的试剂,例如,检测元件可以是包含一个或多个检测元件的试纸、板、阵列或混合物,例如,一种或多种抗体、一种或多种寡核苷酸、一组或多组PCR引物等,其可用于同时检测一种或多种子痫前期和早产标记物的表达。
专门用于确定水平的试剂的一种类型,是特异性结合至蛋白质标记物的抗体的集合,例如,以ELISA形式、以xMAPTM微球形式、在蛋白质组阵列上、在悬浮液中,用于通过流式细胞术、通过蛋白质印迹、通过斑点印记或通过和免疫组织化学进行分析。使用这些抗体的方法在本领域中是被充分理解的。这些抗体能够以溶液形式提供。替代地,它们可以被提供为预先结合至固体基质(例如,多孔培养皿的孔或xMAP微球的表面)。
这样的试剂的另一种类型是探针核酸阵列,其中代表了感兴趣的基因。本领域已知多种不同的阵列形式,具有多种不同的探针结构、底物组合物和附着技术(例如斑点印迹阵列、微阵列等)。代表性的感兴趣的阵列结构包括美国专利号:5,143,854、5,288,644、5,324,633、5,432,049、5,470,710、5,492,806、5,503,980、5,510,270、5,525,464、5,547,839、5,580,732、5,661,028、5,800,992,以及WO 95/21265、WO 96/31622、WO 97/10365、WO97/27317、EP 373 203、以及EP 785 280中描述的那些,其公开内容通过引用并入本文。
专门用于确定基因(例如子痫前期/早产基因)的水平的试剂的另一种类型,是基因特异性引物的集合,该引物被设计用于选择性地扩增这些基因(例如,使用基于PCR的技术,例如实时RT-PCR)。基因特异性引物及用于使用其的方法描述于美国专利号5,994,076中,其公开内容通过引用并入本文。
特别感兴趣的是探针阵列、引物集合或抗体集合,其包括对选自激活素A和Adam12中的至少一个基因/蛋白、在一些情况下对这些基因/多肽中的多个(例如至少2、3、4、5、6、7、8或更多个基因/多肽)特异的探针、引物或抗体(也称为试剂)、或对辅因子/辅助组血红素特异的生化底物。在某些实施方案中,探针、引物或抗体的集合包括对激活素A和Adam12特异的试剂以及对血红素特异的生化底物。本发明的探针、引物或抗体集合或试剂可以包括仅对上文列出的基因/蛋白质/辅因子特异的试剂,或者它们可以包括对上文未列出的额外的基因/蛋白质/辅因子特异的试剂,例如对本领域中已知的其表达模式与子痫前期/早产有关的基因/蛋白质/辅因子特异的探针、引物或抗体。
在某些情况下,可以提供系统。如本文所用,术语“系统”是指试剂的集合,但是是编译的,例如通过购买来自相同或不同来源的试剂集合。在某些情况下,可以提供试剂盒。如本文所用,术语“试剂盒”是指一起提供(例如一起出售)的试剂的集合。例如,样品核酸或蛋白质的基于核酸或抗体的检测可以分别与电化学生物传感器平台结合,所述电化学生物传感器平台将允许这些生物标记物用于个性化的子痫前期/早产护理的多重确定。
本发明的系统和试剂盒可以包括上述阵列、基因特异性引物集合、或蛋白质特异性抗体集合。所述系统和试剂盒可以进一步包括在各种方法中使用的一种或多种额外的试剂,例如:用于产生靶核酸的引物,dNTP和/或rNTP,其可以是预混合的或单独的;一种或多种独特标记的dNTP和/或rNTP,例如生物素化或Cy3或Cy5标记的dNTP;具有不同散射光谱的金的或银的颗粒,或其他后合成标记试剂,例如荧光染料的化学活性衍生物;酶,例如逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等;各种缓冲介质,例如杂交和洗涤缓冲液;预制的探针阵列,经标记的探针纯化试剂和组分,例如旋转柱等;信号产生和检测试剂,例如,经标记的二抗、链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物、化学荧光或化学发光底物等。
除了上述组分之外,本发明的试剂盒还包括用于实施本发明的方法的说明。这些说明可以以各种形式存在于本发明的试剂盒中,可以以一种或多种形式存在于试剂盒中。这些说明的一种形式是作为在合适的媒介或底物上印刷的信息出现,例如,在试剂盒的包装中,在包装插页中,其上印刷有信息的一张或多张纸等。另一种形式是计算机可读媒介,例如磁盘、CD等,在其上面已经记录了信息。可能存在的另一种形式是网站地址,其可以通过因特网被使用以获得远程网站的信息。试剂盒中可以存在任何方便的形式。
提供以下实施例是为了进行说明而不是为了进行限制。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的公开内容和描述,并且不旨在限制发明人认为其发明的范围,也不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性,但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明,否则份数是重量份数、分子量是均重分子量、温度是摄氏度、压力是大气压或接近大气压。
实施例1
作为产妇发病率和死亡率的主要原因,子痫前期(PE)是一种与妊娠有关的血管疾病,影响所有妊娠的5%-8%(Berg et a1.Overview of maternal morbidity duringhospitalization for labor and delivery in the United States:1993-1997 and2001-2005.Obstetrics and gynecology 2009;113∶1075-81;Mackay et a1.Pregnancy-related mortality from preeclampsia and eclampsia.Obstetrics and gynecology2001;97∶533-8)。PE经常导致胎儿生长受限和早产以及胎儿死亡率和发病率,能够通过胎盘和胎儿的分娩来补救PE(Powe et a1.Preeclampsia,a disease of the maternalendothelium:the role of antiangiogenic factors and implications for latercardiovascular disease.Circulation 2011;123∶2856-69)。PE的病因尚不完全清楚。目前PE的诊断基于高血压和蛋白尿的体征(Gynecologists ACOOA ACOG practicebulletin.Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia.Number 33,January 2002.Obstetrics and gynecology2002;99:159-67),但缺乏灵敏性和特异性,并且对于不良的母体的和胎儿的结果预测不好(Zhang et al.Prediction ofadverseoutcomes by common definifions ofhypertension in pregnancy.Obstetrics andgynecology 2001;97:261-7)。因此,需要鉴定能够提供明确诊断的PE生物标记物,其具有更好地监测病症进展的机会,并因此改善结果和经济效益。
虽然病理生理学仍然很难实现,但PE是一种胎盘起着关键作用的妊娠的多系统障碍。研究人员使用遗传的、基因组的和蛋白质组学的方法来比较PE和对照胎盘组织。病例-对照样品的转录分析已经确定了疾病特异性表达模式、典型通路和基因-基因网络(Lapaire et a1.Microarray screening for novel preeclampsia biomarkercandidates.Fetal diagnosis and therapy 2012;31:147-53;Nishizawa etal.Microarray analysis of differentially expressed fetal genes in placentatissue derived from early and late onset severe preeclampsia.Placenta 2007;28:487-97;Loset et a1.transcriptional profile ofthe decidua inpreeclampsia.American journal of obstetrics and gynecology 2011;204∶84e1-27;Johansson et al.Partial correlation network analyses to detect altered geneinteractioHs in human disease:using preeclampsia as a model.Humangenetics2011;129:25-34;Sitras et a1.Differential placental gene expression insevere preeclampsia.Placenta2009;30:424-33;Tsai et al.Transcriptionalprofiling of human placentas from pregnaBcies complicated by preeclampsiareveals distegulation of sialic acid acetylesterase and immune signalingpathways.Placenta 2011;32:175-82;Winn et al. Severe preeclampsia-relatedchanges in gene expression at the maternal-fetal interface include sialicacid-binding immunoglobulin-like lectin-6andpappalysin-2.Endocrinology2009;150:452-62)。基于蛋白质组学的生物标记物研究((Kolia et a1.Quantitativeproteomic(iTRAQ)analysis of 1st trimester maternal plasma samples inpregnancies at risk for preeclampsia.Journal ofbiomedicine&biotechnology2012;2012:305964;Mary et a1.Dynamic proteome in enigmatic preeclampsia:anaccount of molecular mechanisms and biomarker discovery.Proteomics Clinicalapplicatiohs 2012;6:79-90;Carty et a1.Urinary proteomics for predictionofpreeclampsia.Hypertension 2011;57:561-9)也揭示了未来测试的候选生物标记物。在PE的发病机制中提出了胎盘血管生成和抗血管生成因子失衡、可溶性fms样酪氨酸激酶(sFlt-1)升高和胎盘生长因子(PIGF)水平降低(Shibata et a1.Solublefms-liketyrosine kinase 1 is increased in preeclampsia but not in normotensivepregnancies with small-fbr-gestational-age neonates:relationship tocirculating placental growth factor.The Journal of clinical endocrinology andmetabolism 2005;90∶4895-903;Maynard et a1.Excess placental soluble fms-liketyrosine kinase 1(sFIt-1)may contribute to endothelial dysfunction,hypertension,and proteinuria in preeclampsia.The Joumal of clinicalinvestigation 2003;111∶649-58;Wolfet al.Circulating levels of theantiangiogenic marker sFLT-1 are increased in first versus secondpregnancies.American journal of obstetrics and gynecology 2005;193∶16-22;Rajakumar et al.Extra-placental expression ofvascular endothelial growthfactor receptor-1,(Fn-1)and soluble Flt-1(sFlt-1),by peripheral bloodmononuclear cells(PBMCs)in normorensive and preeclamptic pregnantwomen.Placenta 2005;26∶563-73;Taylor et a1.Altered tumor vessel maturationand proliferation in placenta growth factor-producing tumors:potentialrelationship to post-therapy tumor angiogeniesis and recurrence.Internationaljournal of cancer Journal international du cancer2003;105∶158-64;Tidewell etal.Low maternal serum levels of placenta growth factor as an antecedent ofclinical preeclampsia.American journal of obstetrics and gynecology2001;184∶1267-72;Torry et a1.Preeclampsia is associated with reduced serum levels ofplacenta growth factor.American journal of obstetrics and gynecology 1998;179∶1539-44),并提出了sFlt-1/PIGF比值作为PE诊断和治疗的有用指标(Stepan et a1.[useof angiogenic factors(sflt-1/plgf ratio)to confirm the diagnosis ofpreeclampsia in clinical routine:First experience].Zeitschrift furGeburtshilfe und Neonatologie.2010;214∶234-238;Verlohren et al.An automatedmethod for the determination ofthe sflt-1/pigfratio in the assessmentofpreeclampsia.Am.J.Obst.And Gyn.2010;202∶161e161-161e111)。然而,目前在常规临床实践中,没有广泛适用的、灵敏的和特异性的分子PE测试。
早产(PTB)的原因往往不得而知。风险因素包括糖尿病、高血压、多于一个婴儿的怀孕、肥胖或体重不足、多种阴道感染、吸烟和心理压力等。除非出于其他医学原因需要,否则建议在39周之前不要进行医学诱导分娩。同样的建议适用于剖腹产。早产和分娩继续困扰着现代产科。早产率仍然约占分娩率的11%,随之而来的是新生儿的发病率和死亡率。尽管对例如宫缩抑制剂、风险评估和区域化等策略进行了研究,但这一点没有改变。通过新生儿重症监护病房的进步和使用产前类固醇治疗来降低结果(如呼吸窘迫综合征和脑室内出血)的发生率,新生儿存活率有所提高。最近,已经强烈要求在分娩症状出现之前,鉴定有早产风险的患者。使用不同的标记物,特别是细菌性阴道病的存在、子宫颈阴道的胚胎纤连蛋白的评估、以及通过超声扫描确定的宫颈长度已经被研究,有望靶向具有早产风险的女性,从而帮助临床医生决策使用不同方式(例如宫缩抑制剂、类固醇、抗生素、环扎术)治疗特定的患者。血清分子标记物将是有利的,因为宫颈长度、胚胎纤连蛋白和细菌性阴道病状态涉及宫颈/阴道评估。
鉴于这些考虑因素,有强有力的理由和需要去发现用于PE和PTB的诊断和预测的生物标记物。我们使用了全面的无偏多元“组学”方法,整合了微阵列多重元分析的结果,以及通过二维(2D)凝胶分析进行蛋白质组学鉴定。我们在元分析中应用的参数方法(Morganet al.Comparison of multiplex meta analysis techniques for understanding theacute rejection of solid organ transplants.BMC bioinformatics 2010;11Suppl 9:S6;Chen et a1.Differentially expressed RNA from public microarray dataidentifies serum protein biomarkers for cross-organ transplant rejection andother conditions.PLoS computational biology 2010;6)使我们能够在实验中识别一致且显著的差异基因表达,以开发用于下游实验验证的生物标记物。血清蛋白通常用于诊断疾病,但灵敏的和特异性的生物标记物很难找到,可能是由于它们的血清学丰度很低,很容易被高丰度的蛋白质掩盖。我们的血清蛋白标记物发现方法(Ling et al.Plasmaprofiles in active systemic juvenile idiopathic arthritis:Biomarkers andbiological implications.Proteomics2010)结合了基于抗体的血清丰富蛋白质消耗和2D凝胶比较分析,以发现PE和对照血清之间的差异蛋白质凝胶斑点,用于随后的蛋白质质谱鉴定。我们假设有允许PE/PTB诊断的差异血清学特征。为了验证我们的发现结果,我们使用可用的ELISA测定法(一种更高通量的方法)测试了所有候选物。为了构建和优化用最少数量的蛋白质分析物的灵敏的和特异性的生物标记物组,使用了遗传算法。对比较转录组学和蛋白质组学及其相关通路的生物标记物的仔细检查,导致关于它们在PE/PTB病理生理学中作用的新假设。
所呈现的结果验证了我们的假设,即能够构建灵敏的和特异性的血清学生物标记物组以区分PE、PTB和正常对象。据我们所知,这代表使用基于多元“组学”的生物标记物方法来发现包括激活素A和Adam12的新的PE/PTB生物标记物的首次研究。我们相信,这些PE/PTB生物标记物的功能意义及其相关通路将为疾病发病机制提供新的见解并导致有效的新疗法。
材料和方法
研究设计。整个样品分配、PE/PTB生物标记物发现、验证和预测组构建步骤如图1和2所示。我们的研究分两个阶段进行:(1)发现阶段,包括微阵列数据集的元分析(6个PE数据集,PE样品n=98和对照胎盘样品n=111;3个PTB数据集,早产样品n=20和对照胎盘样品n=38),从蛋白质图谱数据库中提取胎盘特异性蛋白质并从MGI数据库获得小鼠模型中胎盘功能障碍的人直系同源基因。(2)验证阶段,包括对PE分析(PE,n=100;对照,n=100)和对PTB分析(PTB,n=109;对照,n=89)的独立队列的分析。通过元分析中的倍数变化>1.2和p值<0.05以及通过可用的ELISA测定试剂盒,选择进一步验证的候选物。然后选择PE和PTB共同的候选物(激活素A和Adam12)。
临床队列设计和样品采集。所有血清样品购买自R&D systems(MN 55413,https://www.rndsystems.com/)、Diagnostica Stago Inc.(NJ 07054,http://www.stago-us.com/)。所有血清样品是在获得知情同意后采集,并包括详细的病例报告表。被诊断为患有抗磷脂综合征(APS)、或系统性红斑狼疮(SLE)、或任何其他并发的自身免疫疾病或正在进行长期皮质类固醇治疗的患者被排除在PE队列之外;被诊断为疑似胎盘前置、宫颈环扎术和创伤导致患者早产症状(定期子宫收缩、下腹部痉挛、下背部痛、骨盆压力、阴道出血和阴道分泌物增加)的患者被排除在PTB队列之外;被诊断为患有早产、或宫内发育迟缓(IUGR)、HELLP综合征、以及PE的患者被排除在对照队列之外。PE、PTB和对照(正常怀孕)队列匹配胎龄、种族和胎次。
比较PE和对照胎盘的表达的多重元分析。如下表1和2所示,将六个PE胎盘表达研究(Nishizawa et al.Microarray analysis of differentially expressed fetalgenes in placenta tissue derived from early and late onset severepreeclampsia.Placenta 2007;28∶487-97;Sitras et al.Differential placental geneexpression in severe preeclampsia.Placenta2009;30∶424-33;Tsai eta1.Transcriptional profiling ofhuman placentas from pregnancies complicatedby preeclampsia reveals disregulation of sialic acid acetylesterase andimmune signalling pathways.Placenta2011;32∶175-82;Nishizawa et al.Comparativegene expression profiling ofplacentas from patients with severe preeclampsiaand unexplained fetal growth restriction.Reproductive biology andendocrinology 2011;9:107;Blair JD et al.Widespread DNA hypomethylation atgene enhancer regions in placentas associated with early-onset pre-eclampsia.Molecular Human Reproduction2013;19:697-708;Jebbink JM etal.Increased glucocerebrosidase expression and activity in preeclampticplacenta.Placenta 2013;36:160-169)和三个胎盘表达研究(PMID:22496790;23290504;18818296/17170095)进行组合并用我们先前开发的方法(Morganetal.Comparison ofmultiplex meta-analysis techniques for understanding the acute rejection ofsolid organ transplants.BMC bioinformatics 2010;11Supp1 9:S6;Chen eta1.Differentially expressed RNA from public microarray data identifies serumprotein biomarkers for cross-organ transplant rejection and otherconditions.PLoS computational biology 2010;6)进行多重元分析。对于所测试的22,394个基因中的每一个,我们计算了所有研究中的元倍数变化。如果在5项或更多项研究中进行了测量并且元效应p值小于0.05并且元倍数变化高于1.2,则将它们选择为显著基因
蛋白质图谱分析。根据Uhlén M等人(Proteomics.Tissue-based map ofthehuman proteome.Science.2015Jan23;347(6220):1260419.),从五个组织类别中提取胎盘基因:富含组织的、富含组的、增强组织的、在所有中表达的(FPKM>100)、混合的。(FPKM>100)。
来自MGI数据库的小鼠模型中具有胎盘功能障碍的人直系同源基因。为了理解胎盘基因在怀孕疾病中的功能意义,从MGI数据库获得人直系同源基因,其小鼠同源基因在被破坏时与异常胎盘表型相关。包括三种MGI表型:异常的胚胎外的边界形态MP:0003836、异常的胚胎外的组织生理学MP:0004264和异常的胚胎外的组织形态学MP:0002086。
ELISA试验验证PE和PTB标记物候选物。所有测定均为ELISA测定,并按照供应商的说明使用商业试剂盒进行。进行所有测定以测量所选分析物的血清水平,如表9和10中对分析物抑制素βA(激活素A)、Adam12(ADAM金属肽酶结构域12)的总结。
统计分析。使用“流行病学计算器”(R epicalc package)分析患者人口统计学和临床数据。进行t检验(Student′st-test)和Mann-WhitneyU检验以计算连续变量的p值,并使用Fisher精确检验和卡方检验进行分类变量的比较分析。通过文献综述确定一组子痫前期/早产的临床风险因素,并通过单因素和多因素分析探讨其对区别的影响。使用R rmeta程序包进行森林绘图,以用于代表胎盘表达元分析并且用图表总结血清蛋白ELISA结果。PE、PTB和对照样品未配对;因此,应谨慎解释最初的血清蛋白质森林图分析。使用自举方法从病例组和对照组创建“配对”样品,用于随后的ELISA结果的森林图分析。因此,血清蛋白质森林图分析提供了每种分析物区分PE、PTB和正常妊娠对照对象的能力的总体效果估计。使用T检验(双尾)和Mann-WhitneyU检验(双尾)、以及局部FDR(Efronet al.Empiricalbayes analysis of microarray experiment.J Am Stat Assoc 2001;96∶1151-60)进行假设检验,以纠正多重假设检验问题。使用遗传算法(R genalg软件包)进行生物标记特征选择和组优化。通过ROC曲线分析(Zweig et a1.Receiver-operating characteristic(ROC)plots:a fundamental evaluation tool in clinical medicine.Clinicalchemistry 1993;39∶561-77;Sing et al.ROCR:visualizing classifier performancein R.Bioinformatics 2005;21∶3940-1)评估每个生物标记物组分析的预测性能。使用随机森林算法开发组合所有显著生物标记物的复合组。生物标记物组分数被定义为随机森林算法中所有树的多数投票。
结果
基于多元“组学”的发现揭示PE和PTB标记物候选物。如图1-4所示,组合先前的胎盘表达研究用于多重元分析、以及蛋白质图谱分析和人直系同源基因分析,以发现从正常对照中诊断出PE和PTB的生物标记物候选物。该努力鉴定了激活素A和Adam12作为与正常对照不同的PE和PTB的差异性胎盘生物标记物。
样品特征。100个PE、102个PTB和129个对照对象用于血清学蛋白质生物标志物验证。如下表3中所总结的,登记时的年龄(P值=0.374)、种族(P值=0.281)没有观察到显著差异(p值<0.05)。对于PE,血液样品采集和分娩之间的间隔为1.8±3.1周,对照对象的为0.9±1.4和6.8±5.1周。
患者人口统计资料,包括如表4中所示的身体质量指数(BMI,怀孕前)、血压(BP)、妊娠史、蛋白尿、母体身高和体重以及分娩结果。
子痫前期和早产风险因素分析。通过文献综述选择了一组风险因素(PE:怀孕期间的BMI、年龄和并发糖尿病;PTB:怀孕期间的BMI、全血细胞计数、教育水平和中性粒细胞百分比)。通过单变量和多变量分析,分别在血液样品采集时调整或不调整孕龄,研究了这些风险因素的影响(表5-8)。比值比和风险比的结果显示,BMI对子痫前期有显著的、积极的影响(p<0.05);教育水平、全血细胞计数和中性粒细胞差异异常(p<0.05)是早产的潜在风险因素。
使用PE、PTB和对照母体的血清样品进行生物标记物验证。为了鉴定PE血清学蛋白质组是否能够基于可用的ELISA检测开发直接的实用性的临床工具,使用PE(n=100)、PTB(n=102)和对照样品(n=129),用可用的血清检测,验证了来自表达元分析和2D凝胶分析的生物标记物候选物。图7-8中的盒型图和散点图详细说明,通过ELISA测定(Mann-WhitneyU-检验)验证了两种蛋白质。图7-8还证明了每个经验证的蛋白质的母体血清丰度在血液样品采集、分娩和其间的间隙的孕龄(周)上的分布。在PE、PTB和对照样品中,每个经验证的生物标记物的母体血清丰度的中位数、平均值和标准偏差总结在表9和10中。
森林图(图5和6)总结了胎盘表达元分析的21个PE标记物的PE与对照的比率和32个PTB标记物的PTB与对照的比率。来源于蛋白质组学和表达元分析的生物标记物在PE、PTB和对照样品之间一致地共享相同的上调或下调趋势。
经验证的生物标记物的单变量和多变量分析。对两种经验证的PE生物标记物中的每一种进行单变量和多变量分析(表11-14)。单变量分析中比值比和风险比的结果显示,激活素A对子痫前期有显著影响(p<0.05),并且所有两种标记物对早产有显著影响(p<0.05)。风险比的多变量分析显示,激活素A对子痫前期有显著影响(p<0.05),并且对早产有显著影响(p<0.05)。结果表明由这些生物标记物组成的组可以实现PE和对照对象的最佳分类性能。
生物标记物组构建。使用来自ELISA测定的数据,我们构建了两种蛋白质分析物组(激活素A和Adam12)的随机森林算法,以及临床参数(图9-11)。我们寻求鉴别具有最佳的特征数量、平衡对小组尺寸的需求、分类准确性、类别分离良好性(病例与对照)、以及足够的敏感度和特异性的生物标志物组。图9-11显示所有具有100%的灵敏度和100%的特异性的组。
生物标记物的通路分析。我们使用PathVisio软件(版本3.2.1,开源通路分析和绘图软件),分析了在早产中作为复合物显著差异表达的经验证的生物标记物(Martijn etal.Presenting and exploring biological pathways with PathVisio.BMCBioinformatics 2008;9(1):399)。除了血管生成和粘着斑途径涉及充分研究的血管生成生物标记物FLT1之外,我们的通路分析导致可能在早产病理生理学中发挥重要作用的以下统计学上显著的经典途径的鉴定:激活素A是一种由2个βA亚基组成的同型二聚体蛋白质。激活素A是转化生长因子-β家族的成员,并且与抑制素A有关。它具有多向作用,包括刺激垂体前叶中卵泡刺激激素的释放、对神经元健康的作用、以及对身体轴线发展的影响;它产于各种组织,例如脑、脑下垂体、性腺、骨髓和胎盘;支持激活素A在妊娠中的作用的证据,获得自体外和临床研究。所有这些都支持了我们的假设,即早产与胎盘碎片的脱落增加有关,其导致生物标记物蛋白的血浆水平升高,这可能导致炎症反应、激素失衡和内皮功能障碍。
我们已经运用多元“组学”方法来开发经验证的PE和PTB生物标记物,整合来自胎盘mRNA表达元分析和耗尽血清学蛋白质组2D凝胶比较分析的发现。通过市售的ELISA检测比较PE、PTB和对照血清,我们验证了2种蛋白标记物,包括激活素A和Adam12。将胎盘组织中的转录组学方法与血清中的蛋白质组学方法相结合的概念是新颖的。它结合了更接近病理生理学重点的组织研究的优点和更适合临床使用的血清研究的优点。将从发现阶段发现/预测的蛋白质带到基于ELISA的验证阶段,使得该研究的结果能够转化为临床实践。
实施例2
统计评估子痫前期标记物组(激活素A和Adam12)的蛋白质水平,以确定如何衡量每种多肽对基于该组的样品的子痫前期和早产分数的贡献。
使用两种标记物的随机森林算法,确定Adam12水平最不显著;并且确定激活素A水平最显著,即比Adam12显著高约11.6倍。
前面仅说明了本发明的原理。应当理解,本领域技术人员将能够设计各种布置,所述布置虽然未在本文中明确描述或示出,但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外,本文所述的所有实施例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域而提供的概念,并且应被解释为不限于这些具体叙述的实施例和条件。此外,这里叙述本发明的原理、各方面和实施方案以及其具体实施例的所有陈述旨在包含其结构和功能的等效物。此外,这些等效物旨在包括当前已知的等效物和将来开发的等效物,即,开发的执行相同功能的任何元件,而不管结构如何。因此,本发明的范围不旨在限于本文示出和描述的示例性实施例。相反,本发明的范围和精神通过所附权利要求体现。
表格
表1.本工作中研究的子痫前期的微阵列数据集。
表2.本工作中研究的早产的微阵列数据集。
表3.登记的怀孕对象的人口统计资料。a.费希尔精准检验(Fisher’sexacttest);b.秩和检验(Kruskal-Wallis test)。
表4.登记的病例和对照对象的临床信息。临床信息无法从一个对照对象获得。a.秩和检验;b.卡方检验(Chi-squared test)。
表5.患者特征的单变量比值比分析。
5A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
5B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
5C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
5D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表6.患者特征的多变量比值比分析。
6A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
6B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
6C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
6D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表7.患者特征的单变量风险比分析。
7A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
7B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
7C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
7D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表8.患者特征的多变量风险比分析。
8A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
8B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
8C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
8D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表9.在有子痫前期结果的怀孕个体中生物标记物分析物的水平(ng/ml)。提供中位数IRQ值和平均值SD值。
表10.在有早产结果的怀孕个体中生物标记物分析物的水平(ng/ml)。提供中位数IRQ值和平均值SD值。
表11.经验证的标记物的单变量比值比分析。
11A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
11B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
11C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
11D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表12.经验证的标记物的多变量比值比分析。
12A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
12B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
12C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
12D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表13.经验证的标记物的单变量风险比分析。
13A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
13B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
13C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
13D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
表14.经验证的标记物的多变量风险比分析。
14A.PE和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
14B.PE和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
14C.PTB和对照患者;在血液样品收集时不调整孕龄。
14D.PTB和对照患者;在血液样品收集时调整孕龄。
Claims (34)
1.一种为特定的对象提供子痫前期评估和预测早产的方法,所述方法包含:
使用随机选择的对象的临床和实验室测试变量来开发和训练随机森林模型,从而得出得分度量来区分正常对象、子痫前期对象和早产对象;
评估来自所述特定的对象的标记物组,以确定所述标记物组中的每一个的水平;以及
将所述标记物组中的每一个的水平提供到所述随机森林模型中,以提供所述子痫前期评估和预测早产,
其中所述标记物组包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法,其中多个临床和实验室测量变量包含至少两个选自以下的变量:收缩压、舒张压、激活素A、孕龄、蛋白尿、子痫前期史、白细胞计数、早产次数、足月妊娠次数、教育、ADAM12、多胎妊娠、母体身高、母体体重、BMI、流产时间、以及采集血液时的年龄。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述多个临床和实验室测量变量包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物组包含所述对象的不超过5种标记物。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物组包含所述对象的不超过3种标记物。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物组由抑制素βA(激活素A)和Adam12(ADAM金属肽酶结构域12)组成。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物组由抑制素βA(激活素A)和身体质量指数(BMI)组成。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物组由抑制素βA(激活素A)和白细胞计数(WBC)组成。
9.根据权利要求1所述的方法,进一步包含提供所述子痫前期评估和早产预测的报告。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述子痫前期评估是子痫前期诊断,并且所述预测早产是早产预报。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述特定的对象具有与子痫前期或早产相关的风险因素。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物组在妊娠16-33周时采集。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述标记物组在妊娠34或更多周时采集。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法,其中所述特定的对象:
(a)具有子痫前期病史;
(b)年龄超过40岁;
(c)有婴儿的间隔小于两年或大于10年;
(d)肥胖;或者
(e)有某些病症的病史,该病症包括慢性高血压、偏头痛、1型或2型糖尿病、肾脏疾病、发生血栓的倾向、或狼疮。
15.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法,其中所述特定的对象:
(a)吸烟或饮酒;
(b)年龄小于17岁或大于35岁;
(c)有早产史;或者
(d)有压力或不健康。
16.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法,进一步包含向被确定为子痫前期的对象施用改善所述子痫前期的程序。
17.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法,进一步包含向被确定为有早产风险的对象施用改善所述早产的程序。
18.根据权利要求16所述的方法,其中所述程序选自降低血压的药物、使用皮质类固醇、抗惊厥药物例如硫酸镁、卧床休息、以及如果诊断在妊娠37周之时或之后做出则考虑分娩。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述程序选自施用皮质类固醇、硫酸镁、抗生素、或孕激素、以及宫颈环扎及其组合。
20.一种治疗子痫前期或早产的怀孕女性的方法,包含:
(a)确定所述女性是否有子痫前期或早产的风险;
(b)当所述女性被确定为子痫前期或有早产风险时,向所述女性施用改善子痫前期或早产的程序;
其中,确定过程包含:
(i)使用随机选择的对象的临床和实验室测试变量来开发和训练随机森林模型,从而得出得分度量来区分正常对象、子痫前期对象和早产对象;
(ii)评估来自所述女性的标记物组,以确定所述标记物组中的每一个的水平;以及
(iii)将所述标记物组中的每一个的水平提供到所述随机森林模型中,以确定所述女性是否有子痫前期或早产的风险,
其中所述标记物组包含抑制素βA(激活素A)和选自ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)、身体质量指数(BMI)和白细胞计数(WBC)中的至少一种。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组包含所述对象的不超过5种标记物。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组包含所述对象的不超过3种标记物。
23.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组由抑制素βA(激活素A)和Adam12(ADAM金属肽酶结构域12)组成。
24.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组由抑制素βA(激活素A)和身体质量指数(BMI)组成。
25.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组由抑制素βA(激活素A)和白细胞计数(WBC)组成。
26.根据权利要求20所述的方法,其中所述程序选自降低血压的药物、使用皮质类固醇、抗惊厥药物例如硫酸镁、卧床休息、以及如果诊断在妊娠37周之时或之后做出则考虑分娩。
27.根据权利要求20所述的方法,其中所述程序选自施用皮质类固醇、硫酸镁、抗生素、或孕激素、以及宫颈环扎及其组合。
28.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组在妊娠16-33周时采集。
29.根据权利要求20所述的方法,其中所述标记物组在妊娠34或更多周时采集。
30.一种用于进行子痫前期诊断和早产预测的试剂盒,包含:
(a)一个或多个检测元件,其用于测量样品中标记物组的标记物的量,所述标记物组包含抑制素βA(激活素A)。
31.根据权利要求30所述的试剂盒,进一步包含(b)一个或多个检测元件,其用于测量样品中ADAM金属肽酶结构域12(Adam12)的量。
32.根据权利要求30所述的试剂盒,进一步包含(c)一个或多个检测元件,其用于测量样品中的白细胞计数(WBC)。
33.根据权利要求30至32中的任一项所述的试剂盒,其中所述一个或多个检测元件是指向所述标记物中的任何一种或多种的抗体、指向编码所述标记物中的任何一种或多种的基因的探针核酸、或指向编码所述标记物中的任何一种或多种的基因的片段的基因特异性引物。
34.根据权利要求30至32中的任一项所述的试剂盒,其中所述一个或多个检测元件除对照抗体之外包含指向不超过七种标记物的抗体。
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