CN109880771A - 一株加速堆肥腐熟的芽孢杆菌属高温细菌njau-n30及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种加速堆肥腐熟的高温芽孢杆菌属高温细菌NJAU‑N30及其加速发酵制备有机肥的工艺方法。所述菌种保藏编号为CGMCC No.16736，所述的菌株的应用为其加速堆肥发酵。步骤如下：将畜禽粪污与辅料按照一定C/N混匀后接种液体菌种，砌成条垛后，采用条垛式发酵工艺，翻抛发酵。相比于对照不添加菌种，菌种的添加有效促进了堆肥初期堆体温度的升高，促使堆体提前进入降温期，促进堆肥产品发芽指数等的提高。所制成的有机肥，能够有效促进植株的生长。

Description

一株加速堆肥腐熟的芽孢杆菌属高温细菌NJAU-N30及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，提供一株加速堆肥腐熟的芽孢杆菌属高温细菌NJAU-N30及其在制备有机肥中的应用。

背景技术

规模化养殖的发展对于提高人们的生活水平具有重要的作用，但是养殖业的不断规模化，带来了粪便和废水的大量集中排放，给当地环境造成巨大压力。目前，堆肥是解决大量畜禽粪便经济有效的处理方法之一，不仅能解决环境污染问题，还能够将废弃物堆制成肥料或土壤调节剂，施入田中，起到改良土壤和增加肥效的作用。但传统农业的堆肥方式和技术由于存在发酵时间长、费时费工、卫生条件差、无害化程度和肥力低等诸多弊端，己经不适合现代化农业的发展要求。

因此，如何缩短堆制时间，使新鲜畜禽粪便快速腐熟，是现代农业生产中急待解决的问题。由于传统堆肥腐熟过程主要是一个由自然微生物参与的生理生化过程，因而利用添加外源微生物来加速该过程具有重要意义。

CN105524858A公开了一种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H1-7。所述H1-7菌剂的发酵液和市售有机废腐熟剂按1:10～20的质量比混合，以0.2％～0.5％的接种量接入有机废弃物堆体发酵，可加快有机废弃物腐熟。但该菌剂必须要与市售有机废腐熟剂配合使用才能有效。市售有机废腐熟剂含有黑曲霉孢子10⁷个/g，解淀粉芽孢杆菌10⁸CFU/g。因此，本领域普通技术人员无法预料H1-7菌剂单独使用时是否能够加速堆肥腐熟。CN 106957807A一种地衣芽孢杆菌菌株TA65及其在促进堆肥腐熟中的应用。CN 106978367A公开了一种脲芽孢杆菌菌株TB42及其在促进堆肥腐熟中的应用。这两菌株耐高温，增长繁殖快，且能够产木质纤维素降解酶；其菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解和水溶有机质(DOM)降解，提高凯氏氮的含量，促进堆肥腐熟；还具有产生物表面活性剂的功能。CN 104560817B公开了一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)UTM102菌株及其应用。UTM102菌株可在下水污泥、生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸秆等有机固体废物中进行好氧堆肥发酵，能够适应高温的环境，并能在有机固体废弃物中大量增殖，堆体升温速度快、温度高，腐熟快，并能加速降解有机物，减量化、无害化更为彻底，可将有机固体废弃物转化成生物肥料，此肥料中含有的大量地衣芽孢杆菌可抑制植物病原菌，对植物生长能够起到促进作用，可以提高作物的产量。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株具有加速堆肥腐熟的新的芽孢杆菌属细菌。

本发明测定了该菌种在50℃条件下的产酶能力，并提供了所述的菌剂在促进堆肥腐熟中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种具有快速降解木质纤维能力的芽孢杆菌属高温细菌NJAU-N30(Bacillussp.)，其中所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年11月12日，保藏编号为CGMCC No.16736。

芽孢杆菌属细菌NJAU-N30，其生理学特征是：

(1)菌种有效活菌数高，采用液态接种体，浓度大于10⁹cfu/ml；

(2)耐高温，能够在55℃高温下生长；

(3)耐盐，能够在含盐15％的培养基中生产；

(4)菌株NJAU-N30被鉴定为芽孢杆菌属细菌，对作物无害，对人和动物无致病性；

(5)菌株于LB液体培养基50℃，170r/min水平震荡培养1天测定产酶值，外切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到1.6994U，内切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到1.0376U，β-葡聚糖苷酶的酶活力达到0.9106U，中性木聚糖酶活力达到95.3964U，滤纸酶活力达到0.1452U，中性蛋白酶活力达到3.4835U，β-淀粉酶活力达到0.09661U。

本发明所述的芽孢杆菌NJAU-N30在高温堆肥生产有机肥中的应用。

利用所述的芽孢杆菌NJAU-N30生产有机肥的方法，包括：动物粪便和菌菇渣初步拌匀后，堆成条垛式堆体，接种所述的芽孢杆菌NJAU-N30，发酵过程每隔1天翻抛一次，发酵30天后结束，最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为成品有机肥。

所述的方法，优选在发酵过程中，堆体自然升温，堆心温度达40℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，堆温50℃以上维持10天以上。

所述的方法，进一步优选包括如下步骤：

(1)原料混合：将动物粪便和菌菇渣按照堆体C/N24：1-26：1配比混合，初始含水率调节至55-65％左右，采用液态接种体接种权利要求1所述的芽孢杆菌NJAU-N30，接种量为9.5-10.5ml/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌成条垛状，堆体基料宽1.1-1.2米，高1.4-1.5米，长度不限；所述的动物粪便选自猪粪、牛粪中的任意一种或两种；

(2)堆肥发酵：有机肥发酵基料按条垛式堆放于发酵棚内后，采用人工翻堆发酵，堆心温度达40℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，堆温50度以上维持10天以上，堆肥15天后堆体开始降温；发酵28-35天后结束；

(3)发酵后处理：最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30％以下得有机肥。

所述的方法，优选堆肥过程中控制堆肥发酵温度，发酵时间，翻堆次数，堆肥结束时使堆体含水量低于30％，色泽发黑。

其中，液态接种体优选由以下生产工艺实现：将-80℃甘油管保存的NJAU-N30菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培养小时，挑取NJAU-N30单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液作为种子液，以1％(v/v)的接种量将种子液转接至LB液体摇瓶中，37℃，170r/min培养至对数中期(OD₆₀₀＝1.0)，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用。

按照上述的方法生产的有机肥。所述的有机肥产品其发芽指数为91％，C/N降低至16.01，pH稳定在6.9-7.5，含水量≤30％。

本发明所述的有机肥在促进黄瓜生长上的应用。

所述的应用优选将所述的有机肥按1.5％(v/w)添加至普通育苗基质中，混合均匀。

有益效果：

本发明主要利用分离筛选出的能够加速堆肥腐熟的相比于对照不添加菌种，菌种的添加有效促进了堆肥初期堆体温度的升高，促使堆体提前进入降温期，促进堆肥产品发芽指数等的提高。利用芽孢杆菌属细菌NJAU-N30生产有机肥，有机肥生产效率高，产品能够促进黄瓜植株的生长。

附图说明

图1为基于菌株NJAU-N30的16S rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树

图2为温度随堆肥时间的变化曲线。室温，空白组(CK)，实验组(NJAU-N30)

图3为pH随堆肥时间的变化曲线。空白组(CK)，实验组(NJAU-N30)

图4为C/N随堆肥时间的变化曲线。空白组(CK)，实验组(NJAU-N30)

图5为发芽指数随堆肥时间的变化曲线。空白组(CK)，实验组(NJAU-N30)

生物材料保藏信息

NJAU-N30，分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年11月12日，保藏编号为CGMCC No.16736。

具体实施方式

实施例1、功能菌株的分离和鉴定

将堆肥高温期样品加入带玻璃珠并装有100ml无菌水的250ml锥形瓶中，25℃、170r/min振荡20min形成土壤悬液，分别吸取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数的土壤悬液0.1ml，涂布于木质纤维素培养平板上，每个浓度3个重复，28℃培养5天后，在平板上挑生长的菌落纯化5次以上，选取仍然可以生长的菌落转至斜面培养，4℃保藏备用。

通过定性和定量筛选最终获得一株细菌命名为NJAU-N30，菌株NJAU-N30在LB平板上的菌落较小，呈黄色有光泽，形状呈圆形，中间稍凸起，边缘呈散圆状，菌体较柔软，具有一定的黏稠性，易挑起。淀粉分解、色氨酸分解均呈阳性，在7％-15％NaCl和25-55℃环境下均可生长。用NJAU-N30菌株的16S rDNA序列登录号(MK450454)为所构建发育树表明，菌株NJAU-N30归类于芽孢杆菌属的分支,与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(AJ356751)同源性达到99％，显然与地衣芽孢杆菌、脲芽孢杆菌、嗜热地衣芽孢杆菌不属于同种微生物。结合菌株的形态特征、理化特征和16S rDNA序列分析，将菌株NJAU-N30初步鉴定为芽孢杆菌属细菌。将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16736。

表1芽孢杆菌属细菌NJAU-N30不同温度下培养情况(5％NaCl)

(++：生长情况良好；+：可以生长；—：不能生长；下表同)

表2芽孢杆菌属细菌NJAU-N30不同盐浓度下培养情况(37℃)

本专利同样比较了专利菌株NJAU-N30与目前已发表的其他菌株的差异，根据形态和生理生化特征，本专利菌株显而易见的不同于已发表菌株(表3)。

表3菌株NJAU-N30与其他已发表菌株的差异

实施例2、高温生长条件下NJAU-N30多种酶活的测定

使用LB培养基作为NJAU-N30产酶培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，1000ml去离子水，pH 7.0，121℃灭菌20min。用3ml无菌水将菌体制成菌悬液，取0.5ml分别接种于产酶培养基中，50℃下170r/min摇床震荡培养。24小时取菌液，加入提取液提取后，利用超声破碎仪(300W，超声3s，间隔7s，持续3min)进行细胞膜破碎形成原液。

纤维素酶活性的测定参照Albrecht et al.(2008)的方法。将原液与醋酸缓冲液(50mM，pH 5)以1:5混合(w/v)，于水平摇床振荡1h后，10000r/min4℃离心10min制得粗酶液。该酶活的测定使用二硝基水杨酸法(DNS)，基于50℃反应1h后体系中还原糖的产生量。反应体系为0.5ml粗酶液，0.5ml1％醋酸羧甲基纤维素(50mM，pH 6)溶液。反应液于520nm下测定吸光度。酶活单位定义：1U定义为每ml样品每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(μg/min/ml)。

中性蛋白酶酶活的测定参照Albrecht et al.(2008)的方法。将原液与磷酸缓冲液(50mM，pH 7.5)以1:15混合(W/V)，于水平摇床振荡1h后，10000r/min4℃离心10min制得粗酶液。酶促反应体系为0.5ml粗酶液，0.5ml磷酸Azoll(2.5mg/ml)缓冲溶液(50mM,pH7.5)于37℃温育1h后加入0.5ml5％三氯乙酸终止酶促反应。测定520nm下通过酶促反应产生的偶氮染料的含量。NP活性单位定义：1U定义为30℃每毫升样本每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位(nmol/min/ml)。

中性木聚糖酶的酶活测定参照Liu et al.(2011)的方法。原液与醋酸缓冲液(0.2M pH 5.5)以1:10(W/V)混合，于摇床振荡1h后，10000r/min4℃离心10min制得粗酶液。酶促反应为0.2ml粗酶液、1.8ml1.7％木聚糖溶液，于50℃水浴30min。冷却后用DNS法在550nm下测定还原糖生成量。酶活定义：1U定义为50℃，pH 6.0条件下，每毫开液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位(nmol/min/ml)。

β-葡聚糖苷酶的酶活测定参照Liu et al.(2011)的方法。原液与柠檬酸缓冲液(0.05M，pH 6.0)、对硝基β-D-葡萄糖苷(25mM)以1:4:1(W/V/V)混合，于37℃培育1h后，加入1ml CaCl₂溶液(0.5M)和4ml三羟甲基氨基甲烷溶液(0.2M)，用NaOH调节pH至12.0，10000r/min4℃离心10min搜集上清液，测定410nm处吸光度。单位的定义：1U定义为每毫升样本每分钟产生1mol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位(nmol/min/ml)。

滤纸酶活力的测定步骤：将50mg新华1号滤纸放入比色管，加入0.5mL稀释10倍的原液，加入2.0mL HAc-NaAc缓冲液，于50℃恒温水浴锅中60min，加入3.0mL DNS溶液，沸水浴10min，冷却后定容至25.0mL，在540nm处测OD值。测得OD值后查阅葡萄糖标准曲线，求出酶解所得葡萄糖含量，换算成相应酶活力值。单位定义：1U定义为在50℃，pH 4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(mg/min/ml)。

β-淀粉酶酶活力测定采用DNS法：反应体系2.05mL，1mL0.05mol/L pH值5.6柠檬酸缓冲液，0.5mL 1％可溶性淀粉，50μL原液，37C保温3min，0.5mL终止液DNS，沸水浴5min，冷却至室温，加15mL去离子水，混合均匀，测OD₅₄₀nm吸光值。对照组先加DNS后加酶液。酶活力单位：1U定义为在实验条件下(37C，pH值5.6)，以每分钟催化底物(淀粉)产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位(mg/min/ml)。

LB液体培养基50℃，170r/min水平震荡培养1d测定产酶值，纤维素酶活力达到2.737U，β-葡聚糖苷酶的酶活力达到0.9106U，中性木聚糖酶活力达到95.3964U，滤纸酶活力达到0.1452U，中性蛋白酶活力达到3.4835U，β-淀粉酶活力达到0.09661U。菌株在较高培养温度下具有高纤维素酶产酶能力，相比常温菌，其应用于生物质固废堆肥、食用菌培养基材料生产中更具优势。

实施例3、液态接种体的产生

将-80℃甘油管保存的NJAU-N30菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培养小时。挑取NJAU-N30单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液作为种子液。以1％(v/v)的接种量将种子液转接至LB液体摇瓶中，37℃，170r/min培养至对数中期(OD600＝1.0)，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用得液态接种体。

所用LB培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：蛋白栋10g，酵母粉5g，NaCl10g琼脂20g，定容至1000ml，pH自然，121℃灭菌20min。

实施例4、固体发酵促生有机肥

将牛粪(10吨，湿重)、猪粪(10吨，湿重)和蘑菇渣(25吨，湿重)按照堆体C/N-25：1配比混合堆成条垛型，初始含水率调节至60％左右。设置2个处理，实验组接种液态接种体，接种量为10ml/kg；对照组不做添加；每隔1天进行人工翻堆，使固体发酵温度不超过60度，并在第0、1、2、3、4、5、6、9、30天采样。每天上午9点和下午3点使用水银温度计对堆体中部同一高度(50cm)随机测量3个点，取平均温度作为堆体的实际温度。堆肥温度变化主要有3个阶段，分别为升温阶段、高温阶段和后熟降温阶段。由图2可见：NJAU-N30处理在6天内堆体温度达到了50℃，最高温度是53℃，堆体温度大于50℃的保持时间为26天，而对照组在第10天内堆体温度达到了50℃，最高温度是53℃，堆体温度大于50℃的保持时间为20天。当堆体的温度高于50℃并维持在7天以上，堆体中的病菌可被杀死，可以保证堆肥的无害化卫生质量。堆体10天后开始降温，而对照需要15天，表明菌株的接种加速了堆肥的进程。将风干、磨碎的样品经过100目筛后，采用重铬酸钾氧化-水浴加热法，利用重铬酸钾在酸性溶液中将有机质氧化，并用硫酸亚铁将多余的重铬酸钾还原，由消耗的重铬酸钾求得碳的数量，再乘以常数即得有机质含量。采用半微量开氏法测得样品中全氮的含量。样品中的含氮化合物在硫酸铜、硫酸钾和硒粉这些加速剂的参与下，用浓硫酸在消煮炉中消化分解，使其中所含的氮转化成氨，并与硫酸结合生成硫酸铵，然后在微量定氮蒸馏器中用氢氧化钠碱化蒸馏出氨，经硼酸吸收，用标准酸滴定，经计算得其含量。C/N＝总碳含量/总氮含量。C/N是用来判断堆肥反应是否达到腐熟的重要指标，同时也对微生物的生长代谢起着重要的作用。对起始C/N为25的堆肥原料，当该值降到16左右时，则可认为堆肥基本腐熟(邱瑞宗，1991)。由图4可知，发酵过程中，加菌堆体的C/N低于同期对照堆体，表明菌株的添加显著加速了堆肥腐熟的进程。

发芽指数是用来评价有机肥的毒性和腐熟度的重要指标。许多植物种子在堆肥原料和未腐熟堆肥萃取液中生长受到抑制，而在腐熟的堆肥中生长得到促进，以种子发芽和根长度计算发芽指数GI。当GI>50％时，堆肥对植物已基本没有毒性，堆肥基本腐熟；当GI>80％时，堆肥完全腐熟。由图5可见，第9天时CK和实验处理的发芽指数分别为45％和58％，而实验处理在第30天GI就已经达到了91％，所以NJAU-N30处理腐熟所需时间更短。

实施例5

(1)原料混合：将猪粪和蘑菇渣按照堆体C/N值25：1配比混合，初始含水率调节至60％左右，采用实施例3液态接种体接种，接种量为10ml/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌成条垛状，堆体基料长宽1.2米，高1.5米，长度不限；

(2)堆肥发酵：有机肥发酵基料按条垛式堆放于发酵棚内后，采用人工翻堆发酵，堆心温度达40℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，堆温50度以上维持10天以上；发酵30天后结束，最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为成品有机肥。有机肥产品发芽指数为91％，C/N降低至16.01，pH稳定在6.9-7.5，含水量≤30％。

实施例6、有机肥料的促生盆栽试验

盆栽试验于2017年12月10日-2018年1月20日在江苏省固体有机废弃物资源化重点实验室温室(南京农业大学进行)。盆栽试验设：(1)A组添加1.5％实施例5中不含起爆菌NJAU-N30的堆体腐熟物质(干重，下同)；(2)B组添加1.5％含起爆菌NJAU-N30的有机肥(实施例5制备)；(3)空白组不添加，处理间氮、磷、钾养分以化肥补齐。每盆装南京草地土250g，于移栽20天时测定植株的株高、茎粗、鲜重、干重。干重测定为在70℃烘箱中烘干至恒重，称重。每个处理重复6次。

移苗后45天，添加NJAU-N30(B组)与添加CK处理(A组)的黄瓜与不添加处理的各项指标之间具有差异。与不加肥料的处理(空白组)相比，添加有机肥(NJAU-N30)的处理(B组)在株高、茎粗、鲜重和干重方面，分别增加了7.05％、12.40％和100.00％；添加CK的处理(A组)在株高、鲜重和干重方面，分别增加了3.64％、4.94％和12.00％。说明添加功能菌NJAU-N30生产的有机肥对黄瓜具有很好的促生效果。

表4促生盆栽实验生物量情况

Claims (9)

1.一种具有快速降解木质纤维能力的芽孢杆菌(Bacillus sp.)NJAU-N30，其特征在于该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年11月12日，保藏编号为CGMCC No.16736。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌NJAU-N30在高温堆肥生产有机肥中的应用。

3.利用权利要求1所述的芽孢杆菌NJAU-N30生产有机肥的方法，其特征在于包括：动物粪便和菌菇渣初步拌匀后，堆成条垛式堆体，接种权利要求1所述的芽孢杆菌NJAU-N30，发酵过程每隔1天翻抛一次，发酵30天后结束，最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为成品有机肥。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在发酵过程中，堆体自然升温，堆心温度达40℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，堆温50℃以上维持10天以上。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)原料混合：将动物粪便和菌菇渣按照堆体C/N 25：1-26：1配比混合，初始含水率调节至55-65％，采用液态接种体接种权利要求1所述的芽孢杆菌NJAU-N30，接种量为9.5-10.5ml/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌成条垛状，堆体基料宽1.1-1.2米，高1.4-1.5米，长度不限；

(2)堆肥发酵：有机肥发酵基料按条垛式堆放于发酵棚内后，采用人工翻堆发酵，堆心温度达40℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，堆肥10天后堆体温度开始下降，整个堆肥过程中堆温50℃以上维持10天以上；发酵28-35天后结束；

(3)发酵后处理：最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30％以下得成品有机肥。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于液态接种体按照以下方法制备：将-80℃甘油管保存的NJAU-N30菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培养小时，挑取NJAU-N30单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液作为种子液，以1％(v/v)的接种量将种子液转接至LB液体摇瓶中，37℃，170r/min培养至对数中期(OD₆₀₀＝1.0)，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用。

7.按照权利要求3-6中任一项所述的方法生产的有机肥。

8.权利要求7所述的有机肥在促进黄瓜生长上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将权利要求8所述的有机肥按1.5％(v/w)添加至普通育苗基质中，混合均匀。