CN109880755A - 一种促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂及其应用，所述的微生物菌剂为Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium的组合，Rhizobium sp.W33的接种浓度为1.14×10⁸ cfu/g土壤，Funneliformis caledonium的菌剂为菌丝、孢子和侵染的根段以及土壤混合物，其孢子密度约为380个/g土壤，接种量都为5%。该组合菌剂对杜梨幼苗生长促进效果显著，能提高植物对矿质营养的吸收和利用，并能够提高土壤多种酶活性，为杜梨土壤养分的高效利用和杜梨专用肥料的研制提供了新的途径，为植物对土壤肥力的高效利用和农业“减肥”具有重要的指导和借鉴意义。

Description

一种促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及功能性微生物菌种及其组合在梨苗生长和矿质营养吸收方面的应用。

背景技术

杜梨属于蔷薇科梨属落叶乔木，别名海棠梨、棠梨、野梨子、土梨、灰梨。杜梨适应性强，喜光，稍耐阴，耐寒，耐干旱瘠薄，耐涝，耐盐碱，在中性土及盐碱土中均能正常生长。抗病虫害及有害气体(HF)的能力强。因其良好的抗性，杜梨成为了梨种植过程中最重要的砧木材料之一。梨园土壤的肥力水平直接决定了梨的产量和品质(Sánchez et al.,2007)。施肥是农业中常用的增加土壤肥力的手段，但近50年内N、P肥的使用量分别提高了7和3.5倍(Bouwman et al.,2013)，这也在一定程度上引起了土壤酸化和盐渍化(Guo et al.,2010；Zhao et al.,2014)，进而危害土壤健康和农业生产。因此，为了解决施肥和作物产量之间的矛盾，科学家需要找出一种既能满足农业可持续发展又不破坏环境的策略。

土壤微生物是土壤的关键成分，其生态功能包括土壤有机质的降解、土壤结构的维持和矿质元素循环(Lienhard et al.,2013)。有益微生物能刺激植物生长，促进矿质营养的吸收和抵抗多种胁迫压力(Ruzzi and Aroca,2015；Rouphael et al.,2015)。其中，丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是经常被报道的一类土壤有益微生物，其能与约80％的陆生植物形成共生关系。它们从宿主植物那获得多达20％的碳水化合物，进而在土壤中形成发达的根外菌丝(Smith and Read,2008)。利用数量庞大的根外菌丝，AMF能极大地提高P、N等矿质营养，其分泌的磷酸酶可水解有机P化合物，并可促进土壤水稳定性团聚体的形成(Koide and Kabir,2000；Purin and Riuing,2007；Wilson et al.,2009)。除此之外，植物生长促生细菌(Plant growth-promoting bacteria，PGPB)也是一类有益微生物，它们能通过固氮、溶磷、产生IAA和铁载体、分泌ACC等手段来促进植物生长(Bona et al.,2018；Pirlak et al.,2007；Glick,2014)。因此，这些有益微生物的使用为我们提供了一种减少化肥使用的可能。

土壤环境极其复杂，土壤微生物之间存在多种种间关系。目前，微生物间的协同作用已被证明可用于提高肥料利用率，提高作物产量和防治病原物(Bona et al.,2018)。梨是菌根植物，现有的研究证明了AMF对杜梨生长的促进作用(Lopez et al.,1997；Gardinerand Christensen,1991)。然而，经Web of Science检索，相关的文献不足10篇。多种微生物共同接种促进杜梨生长的报道尚未见报道。因此，本研究选择两株促生微生物，试验其对杜梨幼苗生长的影响，研究结果将对土壤肥力的高效利用和农业“减肥”具有重要意义。

发明内容

基于目前，微生物间的协同作用已被证明可用于提高肥料利用率，提高作物产量和防治病原物，以及多种微生物共同接种促进杜梨生长的报道尚未见报道。针对杜梨对土壤养分利用率低的特点，本发明提供一种促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂及其应用，通过对杜梨幼苗生长的促进效果显著，在没有外界施肥的情况下能提高植物对矿质营养的吸收和利用，并提高土壤多种酶活性。本发明所涉及的组合菌剂提供了一种促进梨树生长的新方法，不仅为杜梨土壤养分的高效利用和杜梨专用肥料的研制提供了新的途径，也为植物对土壤肥力的高效利用和农业“减肥”具有重要的指导和借鉴意义。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

通过提供一种能促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂，该组合菌剂包含两种促生微生物，所述微生物为Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium(FC)。该组合菌剂对杜梨幼苗生长的促进效果显著，在没有外界施肥的情况下能提高植物对矿质营养的吸收和利用，并能够提高土壤多种酶活性，为杜梨土壤养分的高效利用和杜梨专用肥料的研制提供了新的途径。

本发明还提供了上述组合菌剂的在杜梨中的应用，包括如下步骤：

(1)将菌株Rhizobium sp.W33接种于TSB培养基中，150rpm、30℃震荡培养20h，收集菌液，6000rpm离心10min，去掉上清液，并用无菌水重悬，重复5次制得浓度为1.14×10⁸cfu/ml的菌液备用；

(2)Funneliformis caledonium接种于沙土混合物(1:1，v/v)中，种植苏丹草进行菌剂扩繁，共培养3个月，接种剂为菌丝、孢子和侵染的根段以及土壤的混合物，其孢子密度约为380个/g土壤；

(3)将杜梨种子种植在沙土中，待杜梨种子萌发，高度达到5cm左右时，将其移植到盆中，选择直径18cm，高15cm的盆，含有3300g土壤；移植时，同时接种步骤(2)中所制得的Funneliformis caledonium菌剂接种于杜梨根际，接种量为5％；

(4)步骤(3)中的梨苗生长一周后接种步骤(1)中所制得的Rhizobium sp.W33菌液接种于杜梨根际，接种量为5％。

优选的，上述组合菌剂的应用，其在于杜梨种子萌发接种于杜梨根际，所述的菌剂组合包含Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium。

优选的，所述的Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium的接种浓度均为5％。

本发明中，本发明选用的菌种Rhizobium sp.W33已于2012年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2012357；选用的Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium属于常见的菌种，本领域通过公众渠道获得。现有技术未见披露在杜梨中应用，也未见用于促进杜梨生长和矿质元素吸收中应用。

通过实施本发明所提供的技术方案，可获得以下有益效果：

(1)本发明提供的能显著促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂，组合菌剂由Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium组成，通过应用分析选用单独使用Rhizobium sp.W33或Funneliformis caledonium及其其他菌种组合对杜梨幼苗生长的促进作用，筛选出显著提高杜梨生长的微生物菌剂组合由Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium组成，所提供的方法对杜梨幼苗生长的促进效果显著，在没有外界施肥的情况下能提高植物对矿质营养的吸收和利用，并提高土壤多种酶活性，可为农业的可持续发展提供现实指导和理论依据。

(2)采用本发明提供的组合菌剂，Rhizobium sp.W33可显著提高Funneliformiscaledonium在杜梨根系中的侵染率和侵染强度，将其接种到杜梨幼苗根际，可通过多种促生方式促进幼苗的生长，并提高对磷和钾元素的吸收，同时可显著提高土壤中转化酶、脲酶和中性磷酸酶的活性。

附图说明

图1所示为不同接种处理对杜梨幼苗生长的影响。

图2所示为不同接种处理对杜梨幼苗株高的影响。

图3所示为不同接种处理对杜梨根系生长的影响。

图4所示为不同接种处理对杜梨幼苗地上部和地下部干重的影响。

图1-4中所示的CK为不接菌的对照组，W33为只接种细菌Rhizobium sp.W33组，FC为只接种丛枝菌根真菌Funneliformis caledonium组，W33+FC为混合接种Rhizobiumsp.W33和Funneliformis caledonium组。

具体实施方式

下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中材料有：TSB培养基、无菌水、硫酸、双氧水、FAA固定液、KOH、HCl、曲利苯蓝乳酸酚溶液、载玻片、Solarbio蔗糖酶试剂盒、Solarbio脲酶试剂盒均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例一：组合微生物菌剂

选用菌株Rhizobium sp.W33接种于TSB培养基中，150rpm、30℃震荡培养20h。收集菌液，6000rpm离心10min，去掉上清液，并用无菌水重悬，上述步骤重复5次。最终的菌液浓度为1.14×10⁸cfu/ml，备用。Funneliformis caledonium由中国科学院南京土壤研究所土壤生物学团队惠赠，将其扩繁于种植苏丹草的沙土混合物中，接种剂为菌丝、孢子和侵染的根段以及土壤的混合物，其孢子密度约为380个/g土壤。采集南京农业大学湖熟试验基地(Hushu)土壤样品装盆，每盆含有沙土混合物3300g。选取大小一致的杜梨幼苗，种植在上述沙土混合物中，同时接种Funneliformis caledonium，并于1周后接种Rhizobium sp.W33，并将盆栽盆钵随机打乱放置。盆栽试验进行105d。测定杜梨苗株高。

实施例二：组合微生物菌剂

基于实施例一，杜梨幼苗中Funneliformis caledonium和Rhizobium sp.W33的接种量均为2.5％。盆栽试验进行105d测定杜梨苗株高。

实施例三：组合微生物菌剂

基于实施例一，杜梨幼苗中Funneliformis caledonium和Rhizobium sp.W33的接种量均为5％。盆栽试验进行105d测定杜梨苗株高。

实施例四：组合微生物菌剂

基于实施例一，杜梨幼苗中Funneliformis caledonium和Rhizobium sp.W33的接种量均为7.5％。盆栽试验进行105d测定杜梨苗株高。

实施例五：组合微生物菌剂

基于实施例一，杜梨幼苗中Funneliformis caledonium和Rhizobium sp.W33的接种量均为10％。盆栽试验进行105d测定杜梨苗株高。

实施例六：组合微生物菌剂

基于实施例一，杜梨幼苗中Funneliformis caledonium和Rhizobium sp.W33的接种量均为12.5％。盆栽试验进行105d测定杜梨苗株高。

实施例七：不同微生物菌剂组合对杜梨生长的促进效果

基于实施例二至实施例七中所提供的微生物菌剂组合，设置不添加微生物菌剂组合对照组，每种处理设置5组重复，盆栽实验进行105d进行杜梨苗株高测定。由表1可以看出，实施例三所提供的微生物菌剂组合方案：当杜梨幼苗中Funneliformis caledonium和Rhizobium sp.W33的接种量均为5％时，该菌剂组合对于杜梨株高的促进作用显著高于其它组合。

表1：不同微生物菌剂组合对梨苗生长的促进效果

实施例八：微生物菌剂及其组合对杜梨幼苗生长的影响

基于实施例七中所提供的最优微生物菌剂组合方案，采集南京农业大学湖熟试验基地(Hushu)和白马科研教学基地(Baima)内2种不同类型的土壤样品，风干过筛后与洗干净的河沙1:1混合，装盆，每盆含有沙土混合物3300g。设计4个处理，(1)不接菌对照(CK)，(2)只接种细菌Rhizobium sp.W33(W33)，(3)只接种丛枝菌根真菌Funneliformiscaledonium(FC)，(4)混合接种Rhizobium sp.W33和Funneliformis caledonium(W33+FC)。每个处理5个重复，并设灭活菌对照。选取大小一致的杜梨幼苗，种植在上述沙土混合物中，同时接种Funneliformis caledonium，并于1周后接种W33，并将盆栽盆钵随机打乱放置。盆栽试验进行105d。测定杜梨苗株高，分别取地上和地下部分根部，烘干后进行称重。

如附图1所示，在盆栽试验进行的过程中，所有杜梨幼苗生长正常，未发现明显的缺素症。与相对于的CK比较，接种W33、FC和双接种均显著促进的杜梨的生长。在白马土壤中，接种W33和FC分别增加了杜梨幼苗株高40.1％和49.6％，而双接种组合则提高了98.8％，如附图2所示。在湖熟土壤中也出现了类似的现象，接种W33、FC和双接种处理分别提高了株高23.0％、37.6％和113.1％。如附图3和附图4所示，所有的接种处理均显著影响了杜梨根部的构型，并提高了杜梨幼苗地上部和地下部的干重(p<0.05)。在白马土壤中，接种W33、FC和双接种处理分别增加了地上部干重76.6％、101.6％和126.3％，地下部干重26.2％、124.2％和195.3％；在湖熟土壤中W33、FC和双接种处理分别增加了地上部干重107.8％、176.7％和331.0％，地下部干重208.5％、213.4％和496.3％，同时双接种处理表现出最大的地上部和地下部生物量(p<0.05)。

实施例九：Rhizobium sp.W33对Funneliformis caledonium侵染的影响

基于实施例八中对杜梨的处理设置，进行侵染率和强度检测。检测方法采用Trouvelot等(1986)披露的统计方法。由表2可知，所有的试验处理中均检测到菌根的侵染情况。CK和W33处理中发现有少量的AMF侵染，其侵染强度也较低，这两个处理之间无明显差异。这可能是由于白马和湖熟土壤中存在土著的AMF菌种。FC处理显著提高了AMF的侵染率和侵染强度，其在白马和湖熟土壤中侵染率分别为88.0％和84.8％，侵染强度为61.3％和57.6％。相比之下，双接种处理(W33+FC)显著提高AMF的侵染率和侵染强度(p<0.05)，在白马土壤中AMF侵染率和侵染强度由88.0％和61.3％提高到92.6％和64.4％，在湖熟土壤中由84.8％和57.6％提高到92.8％和62.9％。这也说明了Rhizobium sp.W33对Funneliformis caledonium侵染植物起到了促进的作用。

表2：不同接种处理中AMF侵染率和侵染强度

实施例十：微生物接种对杜梨P、K吸收的影响

基于实施例八中杜梨的处理设置，进行杜梨P、K吸收情况检测。检测方法采用使用硫酸+双氧水消煮植物，后用ICP/OES对消煮液测定。由表3可知，从总体上来说，微生物接种显著提高了杜梨幼苗对P、K的吸收。与不接菌对照处理相比，除了白马土壤中叶部P含量外，接种FC明显的增加了根部和叶部P、K含量(p<0.05)。在白马土壤中，W33处理增加了杜梨根部P、K含量，但是没有提高其叶部的含量。在湖熟土壤中，W33提高了杜梨幼苗根部和叶部K含量，但是对P的吸收没有显著影响。在白马土壤中W33+FC处理对P、K的吸收效果要显著优于其他处理，而在湖熟土壤中FC的效果更优。

表3：不同接种处理对杜梨吸收P、K的影响

实施例十一：微生物菌剂及其组合对土壤酶活性的影响

基于实施例八中杜梨的处理设置，进行土壤酶活性检测，蔗糖酶活性和脲酶活性的检测使用Solarbio试剂盒测定，中性磷酸酶活性检测采用磷酸苯二钠法，参考关松荫等的文献。由表4可知，与CK处理相比，所以接菌处理均提高了土壤转化酶活性，W33+FC处理中的数值最大，其在白马和湖熟土壤中分别比对照提高了189.1％和245.6％。与转化酶相似，接菌处理也显著提高了土壤脲酶的活性，而所以接入FC的处理(FC、W33+FC)的脲酶活性要高于W33处理。与上述两种土壤酶活性不同的是，W33处理没有提高土壤中性磷酸酶活性，FC和W33+FC处理在供试土壤中均表现出提高土壤中性磷酸酶活性的能力，W33+FC处理的效果更优(p<0.05)。

表4：不同接种处理对杜梨根际土壤酶活性的影响

上述实施例充分表明菌株Rhizobium sp.W33对Funneliformis caledonium对杜梨幼苗生长和P、K吸收的促进作用，以及对土壤酶活性的增强作用，而这两种菌剂的组合效果更优。Rhizobium sp.W33的接种浓度为1.14×10⁸cfu/g土壤，接种量为5％；Funneliformis caledonium的菌剂为菌丝、孢子和侵染的根段以及土壤的混合物，其孢子密度约为380个/g土壤，接种量为5％。

上述实施例仅仅为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或改动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所延伸出的显而易见的变化或改动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种能促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂，其特征在于，所述的菌剂组合中包含的微生物为Rhizobium sp. W33和Funneliformis caledonium。

2.根据权利要求1所述的能促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂，其特征在于，Rhizobium sp. W33的接种浓度应为1.14×10⁸ cfu/ml，接种剂Funneliformis caledonium中含有AMF菌丝、孢子、植物根断和土壤，其孢子浓度约为380个/g土壤。

3.根据权利要求1所述的能促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂，其特征在于，Rhizobium sp. W33的接种量为5%，接种剂Funneliformis caledonium的接种量为5%。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的能促进杜梨生长和矿质元素吸收的组合菌剂在杜梨生长中的应用。