CN109870498A - 一种细胞内小分子代谢物的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞内小分子代谢物的鉴定方法。根据精确质量数及色谱图匹配对代谢物进行定性，根据谱图的丰度对代谢物进行相对定量。该分析方法流程如下：将培养的贴壁细胞用PBS快速清洗后使用液氮淬灭；然后加入萃取液提取细胞内的全部代谢物；检索KEGG与METLIN数据库获得代谢通路主要代谢物的离子对与碰撞能等参数，建立小分子代谢物的检测分析方法；采用串联四级杆线性离子阱高性能质谱(Q‑Trap)结合四级杆‑飞行时间质谱(Q‑TOF)对细胞内的代谢物进行定性定量分析。本发明可以用于细胞样品中代谢产物的定性定量分析该方法检测鉴定到的代谢物的范围更广，代谢物的线性范围更宽，有效解决了目前分析代谢物定性难且需要大量的标准品作对照的问题。
Description
技术领域
本发明是一种细胞内小分子代谢物的鉴定方法，具体地说是通过检索KEGG数据库(http://www.kegg.jp/kegg/)和METLIN数据库(https://metlin.scripps.edu/)，获得代谢物的结构信息、脂水分配系数与液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪(LC-Q-TOF)的MS/MS色谱图信息(精确质量数、丰度、碰撞能及质谱检测模式)，根据精确质量数及色谱图匹配对代谢物进行定性，采用串联四级杆线性离子阱高性能质谱(Q-trap)对细胞内的代谢物进行定量分析。该方法区别于通过标准品进行代谢物定性的方法，是对细胞内小分子代谢物的鉴定一种新方式。
背景技术
分子量低于1000道尔顿的小分子量代谢物是包括细胞信号传导与代谢网络在内的许多生物进程中的重要调节者。对这些代谢物进行分析可以提供细胞状态的功能读出。代谢组学可以被定义为在给定生物样品中全部代谢物的综合分析。代谢组学分析已被广泛用于生物学中基本机制的研究，临床生物标记物鉴定以及药物研究。该技术已被证明为一种用于复杂生物系统中调节机制评估的有力分析策略许多分析平台用于代谢组学研究，包括核磁共振(NMR)、质谱(MS)与气相色谱(GC)、毛细管电泳(CE)、液相色谱(LC)以及超临界流体色谱法(SFC)联用。[A.R.Fernie,R.N.Trethewey,A.J.Krotzky and L.Willmitzer,NATURE REVIEWS MOLECULAR CELL BIOLOGY.,Innovation-Metabolite profiling:fromdiagnostics to systems biology,5(2004)763–769.]
靶标代谢物定量，半靶标或拟靶向代谢物定量，大规模靶向定量以及非靶向代谢组学分析是代谢组学的主要策略。所有现有的代谢组学分析策略都存在优势与弱点，比如，经典的靶向代谢物定量因其高灵敏性、宽的线性范围，可靠地定量准确性与稳定性被认为是代谢物定量的黄金标准。[T.Cajka and O.Fiehn,ANALYTICAL CHEMISTRY,TowardMerging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-BasedMetabolomics and Lipidomics,88(2016)524–545.]然而该方法只能检测一部分有限数量的已知预选分析物，并且不能检测未知代谢物。高分辨的全扫MS的非靶向代谢组学策略在理论上可以覆盖样品中的所有代谢物。非靶向代谢组学分析具有最高的代谢物覆盖范围，但是由于其重复性差及定量性能低，非靶向代谢组学分析的可靠性并不理想。在方法构建与后续数据采集过程也存在同样问题。非靶向代谢组学分析的试验方法构建相对容易并且样品可以在一般的LC-MS条件下就可以分析，但是数据处理过程比如代谢物鉴定与数据挖掘过程很复杂并且需要明显高于靶向代谢组定量方法的努力。[S.Chen,H.Kong,X.Lu,Y.Li,P.Yin,Z.Zeng and G.Xu,ANALYTICAL CHEMISTRY,Pseudotargeted MetabolomicsMethod and Its Application in Serum Biomarker Discovery for HepatocellularCarcinoma Based on Ultra High-Performance Liquid Chromatography/TripleQuadrupole Mass Spectrometry,85(2013)8326–8333.]Chen等人的研究采用非靶向代谢组学策略在使用不同软件获得的原始MS数据可能导致不同的分析结论[Y.Chen,J.Xu,R.Zhang,G.Shen,Y.Song,J.Sun,J.He,Q.Zhan and Z.Abliz,Assessment of data pre-processing methods for LC-MS/MS-based metabolomics of uterine cervix cancer,Analyst,138(2013)2669–2677.]
对于寻找复杂生物样品中大量代谢物可靠的定量策略的需求是十分巨大的。基于三重四级杆LC-MS系统的经典的MRM实验是多个代谢物同时定量最受欢迎的策略，并且能够监测每种代谢物的特定前体离子与特征子离子。在基于质谱的代谢组学研究中，代谢物鉴定主要通过MS1质谱与MS/MS光谱，并且光谱数据库与化学标准品可用作定性的参考。然而，经典的MRM实验由于较低的分析物覆盖范围限制了其在生物复杂体系的应用。因此，它不能同时监测大量的代谢物。
研究者们努力扩大靶向代谢物定量的范围与生产量，并且产生了几种易于操作、高通量、精确性高、稳定性好并可以大范围定量代谢物的大规模靶向代谢组学策略。基于MRM模式的靶向策略可以通过化学标准品及数据库进行构建，Asara和他的同事使用HILIC-MS，通过正负离子转换，在15分钟的LC-MS获取时间中分析了258种代谢物(289种Q1/Q3离子对)。[M.Yuan,S.B.Breitkopf,X.Yang and J.M.Asara,A positive/negative ion-switching,targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodilyfluids,cells,and fresh and fixed tissue,Nature Protocols,7(2012)872–881.]Wei及其同事也报道了一种在10分钟的LC-MS运行时间中高通量、灵敏性高、重复性好的方法，他们对205种内生代谢物进行了靶向定量分析。[R.Wei,G.Li and A.B.Seymour,High-Throughput and Multiplexed LC/MS/MRM Method for Targeted Metabolomics，Analytical Chemistry,82(2010)5527–5533.]
基于此，本专利用串联四级杆线性离子阱高性能质谱(Q-Trap)的MRM模式结合KEGG数据库(http://www.kegg.jp/kegg/)和METLIN数据库(https://metlin.scripps.edu/)建立一种高通量、易于操作的用于细胞内的大规模靶向定量方法。
发明内容
本发明的目的在于发展一种用于代谢物定性更简单、代谢物检测更广泛、以及代谢物线性范围更宽的细胞内小分子代谢物的鉴定方法。目前细胞内代谢物存在定性难的问题且需要大量标准样品作为对照，而本发明提供了一种在不需要标准品的条件下对细胞内小分子代谢物进行定性定量的方法。因此，本发明所采用的技术方案是：
收集一定细胞密度的贴壁细胞，液氮淬灭处理后并在低温条件下提取细胞内代谢物，检索KEGG数据库中具有生物角色的化合物，并获取其在METLIN数据库中Q-TOF的MS/MS色谱图信息(碰撞能、子离子及母离子质量数、质谱检测模式)，使用串联四级杆线性离子阱高性能质谱MRM模式结合Q-TOF target MS/MS模式确定保留时间，串联四级杆线性离子阱高性能质谱Schedule MRM定量分析。
a)贴壁细胞经PBS快速清洗后，加入液氮淬灭，细胞刮刀对细胞进行
收集；
b)低温状态下加入冷的甲醇/水提取液，冰水中超声提取、涡旋，离
心细胞提取液并使用有机相过滤器过滤；
c)综合代谢物的结构信息、脂水分配系数、碰撞能、子离子及母离子质量数、质谱检测模式等信息，建立了串联四级杆线性离子阱高性能质谱分析方法。
d)采用串联四级杆线性离子阱高性能质谱MRM检测模式获得TIC谱图，结合代谢物的脂水分配系数以及Q-TOF target MSMS模式用于辅助确定各离子对色谱峰的准确保留时间，；
e)串联四级杆线性离子阱高性能质谱Schedule MRM定量分析。
已知细胞中代谢物的种类及其结构与其在METLIN数据库中Q-TOF的MS/MS色谱图信息(碰撞能、子离子及母离子质量数、质谱检测模式)等，通过METLIN数据库中Q-TOF的MS/MS色谱图信息匹对即可定性；
步骤a中收集细胞的生长密度为80％左右；
步骤b中萃取液在13 000rpm/min，8℃的离心条件下离心5min；
步骤c中串联四级杆线性离子阱高性能质谱分析方法包括质谱检测模式、碰撞能、母离子和子离子精确质量数以及解簇压力的信息；
步骤d提取MRM检测模式获得TIC谱图中各离子对色谱峰得到准确的保留时间，结合Q-TOF target MS/MS模式扫描，选择该离子对色谱峰的保留时间；
本发明具有如下优点：
该方法使用数据库信息监测，结合Q-TOF的MS/MS质谱图验证对代谢物进行定性，解决了非靶向代谢组学策略定性难的难题并且无需使用大量标准品定性；与经典的靶向定量相比，该方法检测鉴定到的代谢物的范围更广；此外，该方法采用SRM模式检测代谢物，其线性范围宽，易于操作、高通量、具有较好的精确性与稳定性，并且可以大范围定量代谢物。
附图说明
图1正离子模式靶标分析的提取离子色谱图(Extracted Ion Chromatogram，XIC)
图2负离子模式靶标分析的提取离子色谱图(Extracted Ion Chromatogram，XIC)。
具体实施方式
本发明通过以下具体实例进一步描述，但不限制本发明。
1)代谢物提取：
取对数期的人肝癌细胞HepG2的10cm培养皿，PBS快速清洗一遍后，加入液氮淬灭，细胞刮刀收集细胞；加入1ml 4℃冰箱放置的80％甲醇/水提取液，冰水中超声8min、涡旋3min，并重复三个超声涡旋循环；在8℃、13000rmp/min条件下离心5min，上清液用有机相过滤器过滤，转移至vial用于分析。
2)检索数据库：
检索KEGG数据库中具有生物角色的化合物，并获取其在METLIN数据库中Q-TOF的MS/MS色谱图信息(碰撞能、子离子及母离子质量数、质谱检测模式)，列出质谱检测模式、碰撞能、母离子和子离子精确质量数以及解簇压力的信息表格，用于串联四级杆线性离子阱高性能质谱分析。
3)AB SCIEX UPLC/Q-TRAP定量分析：
首先采用MRM(不带保留时间)模式，分别得到正负离子模式下的TIC谱图，提取各离子对色谱峰得到准确的保留时间，并并使用Q-TOF的target MS/MS模式扫描，选择该离子对色谱峰的保留时间。然后用Q-TRAP的Scheduled MRM(有保留时间)模式对细胞样品进行定量分析。正离子模式质谱参数如下：电喷雾离子源(ESI)温度为550℃，喷雾电压为5500V，气帘气压力为0.241MPa，Gas1压力为0.276MPa，Gas2压力为0.276MPa；负离子模式质谱参数如下：电喷雾离子源(ESI)温度为550℃，喷雾电压为4500V，气帘气压力为0.241MPa，Gas1压力为0.276MPa，Gas2压力为0.276MPa。
色谱条件：
正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1mm×100mm，1.7μm，Waters，USA)，柱温为50℃，进样量为10μL；流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈。流动相梯度洗脱程序如表1所示：
表1正离子模式下流动相的洗脱程序。
Table 1The mobile phase gradient of acetonitrile/water in ESI(+)MSmode.
负离子模式：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm，Waters，USA)，柱温为50℃，进样量为10μL；流动相A为5mM NH4HCO3的水，B为含5mM NH4HCO3的的甲醇。流动相梯度洗脱程序如表2所示：
表2负离子模式下流动相的洗脱程序。
Table 2The mobile phase gradient of methanol/water in ESI(–)MS mode.
使用该方法鉴定出负离子模式46种代谢物，正离子模式162种代谢物，其中重复5种，一共检测到203种代谢物，其SRM模式下的色谱图信息见说明书附图中的图1和2正离子模式和负离子模式靶标分析的提取离子色谱图(Extracted Ion Chromatogram，XIC)。
Claims (6)
1.一种细胞内小分子代谢物的串联四级杆线性离子阱高性能质谱分析方法，其特征在于：
使用METLIN数据库中Q-TOF的MS/MS色谱图信息匹对用于定性；使用串联四级杆线性离子阱高性能质谱用于定量；
包括以下步骤：
a)细胞的淬灭：将贴壁细胞用PBS缓冲液清洗后液氮淬灭，抑制细胞内的酶活性，减少代谢物的酶代谢；
b)细胞代谢物的提取：低温状态下加入冷的甲醇/水提取液，于冰水浴中超声提取、涡旋，萃取液离心冷冻，待分析；
c)串联四级杆线性离子阱高性能质谱分析方法：根据结构信息，选择正离子或负离子检测模式，利用METLIN的MS/MS质谱图信息(包括子离子及母离子质量数、丰度、碰撞能)建立串联四级杆线性离子阱高性能质谱分析方法；
串联四级杆线性离子阱高性能质谱MRM检测模式获得XIC谱图，结合代谢物的脂水分配系数以及Q-TOF的target MS/MS模式确定各离子对色谱峰的准确保留时间；
d)使用串联四级杆线性离子阱高性能质谱对代谢物进行定量分析。
2.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的鉴定方法，其特征在于：步骤a中的贴壁细胞为人肝癌细胞HepG2；
步骤b中甲醇/水提取液中甲醇的体积百分比为比例系数为百分之八十，温度为4℃；
步骤c中检索KEGG数据库中的化合物，获取代谢物的结构信息、脂水分配系数，并在METLIN数据库中匹配质谱图信息，选择合适的碰撞能及相应碰撞能条件下的子离子及母离子的精确质量数；
步骤d中串联四级杆线性离子阱高性能质谱定量分析使用Scheduled MRM模式。
3.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的鉴定方法，其特征在于：步骤a中，PBS清洗次数为一次。
4.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的鉴定方法，其特征在于：步骤b中超声、涡旋次数为3次，每次超声8min、涡旋3min。
5.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的鉴定方法，其特征在于：步骤c中选取METLIN数据库的MS/MS质谱图中一定碰撞能中丰度最高的离子信息。
6.按照权利要求1所述的细胞内小分子代谢物的鉴定方法，其特征在于：步骤c中离子对色谱峰保留时间由Q-TOF的target MS/MS模式进行确定。
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