CN109868311A

CN109868311A - Mif及其预测二代抗精神病药物诱导的代谢不良反应的应用

Info

Publication number: CN109868311A
Application number: CN201711251600.5A
Authority: CN
Inventors: 崔东红; 祁大可; 彭延敏; 李泽挚; 粟幼嵩
Original assignee: SHANGHAI MENTAL HEALTH CENTER
Current assignee: SHANGHAI MENTAL HEALTH CENTER
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN109868311B

Abstract

本发明提供了一种MIF及其检测试剂的用途。具体地，本发明提供了巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)或其检测试剂用于制备诊断试剂或诊断试剂盒的用途，所述诊断试剂或试剂盒用于判断精神分裂症患者使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险。本发明还提供了相应的检测试剂盒和检测方法。

Description

MIF及其预测二代抗精神病药物诱导的代谢不良反应的应用

技术领域

本发明涉及药物学和分子检测领域，更具体地涉及MIF及其在预测二代抗精神病药物诱导的代谢不良反应中的应用。

背景技术

精神分裂症(schizophrenia,SZ)是一种严重的高患病、高复发的慢性致残性精神疾病，多起病于青壮年，其终生发病率约为世界人口的1％。罹患精神分裂症，不仅给患者生活质量和家庭关系造成影响，还给社会经济造成严重的负担。该病死亡率较普通人群高2-3倍，且寿命相较普通人群缩短10-20年。在精神分裂症中观察到的高于普通人群的死亡率中，大约60％归咎于生理上的共病，尤其是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)。

第二代抗精神病药物，又称为非典型抗精神病药物(atypical antipsychotics，AAP)，因其对精神分裂症的幻觉、妄想等阳性症状效果显著，并且对阴性及认知症状也有效，得以在临床上广泛使用。此外，虽然非典型抗精神病药物产生锥体外系症状(extrapyramidal syndrome，EPS)的风险远低于典型抗精神病药物，但会引起不同程度的代谢不良反应，如：体重增加、糖代谢异常、血脂异常，继而导致更严重的心血管疾病。这些副反应严重限制了该药物在临床上的使用。除了引起长期心血管健康的风险，这些副作用还会降低服药的依从性，从而最终导致患者临床症状的恶化。

近年来，细胞因子与第二代抗精神病药物诱导的代谢不良反应受到越来越多的关注，但目前研究多为一个或少数几个因子，且药物多为混杂、很少为单药。因此，本领域需要进一步探索细胞因子是否与二代抗精神病药物(如奥氮平) 诱导代谢不良反应的机制有关，以及细胞因子可否预测二代抗精神病药物治疗引起代谢不良反应。

发明内容

本发明的目的在于提供MIF及其在预测二代抗精神病药物诱导的代谢不良反应中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)基因序列、蛋白、或检测试剂的用途，用于制备诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于判断精神分裂症患者使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险(易感性)。

在另一优选例中，所述的代谢异常包括糖类代谢异常、和/或脂类代谢异常。

在另一优选例中，所述的脂类选自下组：总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(ApoB)。

在另一优选例中，所述的脂类代谢异常包括(血浆中)总胆固醇水平升高、甘油三酯水平升高、和/或高密度脂蛋白水平降低。

在另一优选例中，所述的糖类代谢异常为葡萄糖代谢异常。

在另一优选例中，所述的代谢异常包括胰岛素水平增加、HOMA IR(胰岛素抵抗)评分增加、和/或BMI(体重指数)增加。

在另一优选例中，所述的升高或增加是指使用二代抗精神病药物治疗后的水平P1与使用二代抗精神病药物治疗前的水平P0相比较，P1显著高于P0，优选地，所述“显著高于”指P1/P0≥1.5，

在另一优选例中，所述的下降是指使用二代抗精神病药物治疗后的水平P1 与使用二代抗精神病药物治疗前的水平P0相比较，P1显著低于P0，优选地，所述“显著低于”指P0/P1≥1.1，较佳地P0/P1≥1.35，更佳地P0/P1≥1.5。

在另一优选例中，所述的判断包括辅助判断和/或治疗前判断。

在另一优选例中，所述的判断是将来自测试对象的样本的MIF含量A1与正常人群的相应MIF含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险高，优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.35，较佳地A1/A0≥1.5，更佳地A1/A0≥2.0。

在另一优选例中，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。

在另一优选例中，所述的判断是对测试对象的MIF基因的四核苷酸微卫星重复(-794CATT_5-8，rs5844572)进行检测，若所述的四核苷酸微卫星重复为 CATT₅重复，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险低，若所述的四核苷酸微卫星重复为CATT_6-8重复，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险高。

在另一优选例中，所述的测试对象为精神分裂症患者。

在另一优选例中，所述的诊断试剂或诊断试剂盒用于检测血液样本、血浆样本、或血清样本，较佳地为外周血样本。

在另一优选例中，所述的检测试剂用于检测测试对象的MIF基因型，较佳地为MIF基因四核苷酸微卫星重复的类型。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括蛋白芯片、核酸芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括MIF特异性抗体。

在另一优选例中，所述的MIF特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述MIF特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的MIF基因序列、蛋白用作标准品。

在本发明的第二方面，提供了一种诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测MIF的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于判断精神分裂症患者使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括点样于测试板上的所述检测试剂以及使用说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括检测配套的样品前处理试剂以及使用说明书。

在另一优选例中，所述的说明书记载了检测方法或判断方法。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括MIF基因序列、蛋白的标准品。

在本发明的第三方面，提供了一种判断精神分裂症患者使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险的方法，包括步骤：

(a)提供一测试对象；

(b)对测试对象的MIF基因的四核苷酸微卫星重复进行检测；

(c)判断测试对象使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险，若所述的四核苷酸微卫星重复为CATT₅重复，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险低，若所述的四核苷酸微卫星重复为CATT_6-8重复，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险高。

在另一优选例中，所述的测试对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示MIF与首发精神分裂症中代谢功能障碍的发展有关。实验包括56例首发精神分裂症患者(男28例，女28例)，其中，图1A显示了体重指数(BMI) 的检测结果；图1B显示了胰岛素的检测结果，图1C显示了甘油三酯(TG)的检测结果，图1D显示了葡萄糖的检测结果，图1E显示了HOMA-IR评分的检测结果；图1F显示了血浆MIF在奥氮平处理前后的变化。图1G、图1H、图1I分别显示了给予奥氮平后，MIF的变化与胰岛素的变化(G)，TG(H)和HOMA-IR评分(I) 相关。以上各组代谢指标均为在奥氮平(Olz)治疗前及治疗2个月后测量。* P<0.05相对于未服药组。

图2显示了MIF启动子多态性与奥氮平治疗后的血浆MIF水平改变和代谢参数改变相关。其中，图2A显示了高表达CATTnon5/5(CATT非5/5)基因型与奥氮平给药后的体重指数(BMI)、血浆胰岛素、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)变化相关；图2B显示了低表达CATT5/5基因型(CATT 5/5)不发生代谢功能障碍。以上各组MIF水平、HOMA-IR、和代谢指标均为在奥氮平(Olz) 治疗前及治疗2个月后测量。*P<0.05相对于未服药组。

图3显示了显示MIF与利培酮诱导的糖脂代谢紊乱症状相关。每个实验组包含至少6只小鼠。图3A显示对食物摄取量的影响。图3B显示对体重的影响。图 3C显示对葡萄糖耐量的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现MIF基因型与二代抗精神病药物(奥氮平)诱导的代谢不良反应显著相关。实验表明，治疗前的MIF基因型和患者接受奥氮平治疗后血浆中的总胆固醇、HDL、甘油三酯、葡萄糖水平，以及HOMA-IR评分和BMI呈显著相关，结果提示MIF基因的四核苷酸微卫星重复可以预测奥氮平诱导的代谢异常。MIF及其检测试剂可以用于判断精神分裂症患者使用奥氮平治疗后发生代谢异常的风险。再次基础上完成本发明。

MIF基因

巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF) 是第一个被发现的具有多效炎性介质功能的细胞因子(NCBI登录号：4282)。其蛋白结构是由115个氨基酸残基组成的同源三聚体，每个单体由2个α螺旋和6个β折叠组成。它广泛表达于免疫细胞(单核/巨噬细胞)、平滑肌、心脏等多种组织器官中，具有调节免疫和炎症反应，调节糖脂代谢等功能。

人类MIF基因(MIF)含有特异性的基因启动子内的四核苷酸微卫星重复 (-794CATT5-8，rs5844572)。突变MIF等位基因通常在群体中发生(最小等位基因频率>5％)，微卫星拷贝数与增加的mRNA表达相关，CATT₅重复是低表达等位基因，CATT_6-8重复是较高表达等位基因。在本发明中，基于a-794CATT5 /5基因型(CATT 5/5，即最低MIF表达水平)，或非794CATT5/5基因型(CATT 非5/5，即更高MIF表达)将患者分为低表达或高表达MIF基因型。

二代抗精神病药物

第二代抗精神病药物，又称为非典型抗精神病药物(atypical antipsychotics，AAP)，包括氯氮平、奥氮平、利培酮、喹硫平、阿立哌唑、齐拉西酮等药物，因其对精神分裂症的幻觉、妄想等阳性症状效果显著，并且对阴性及认知症状也有效，得以在临床上广泛使用。此外，虽然非典型抗精神病药物产生锥体外系症状(extrapyramidal syndrome，EPS)的风险远低于传统抗精神病药物，但会引起不同程度的代谢不良反应，如：体重增加、糖代谢异常、血脂异常，继而导致更严重的心血管疾病。这些副反应严重限制了该药物在临床上的使用。除了引起长期心血管健康的风险，这些副作用还会降低服药的依从性，从而最终导致患者临床症状的恶化。

奥氮平作为非典型抗精神病药物的代表之一，因其稳定的疗效常作为临床上的首选治疗药物。作为治疗精神分裂症的首选药物，奥氮平在急性期的起效时间更快。此外，一项系统综述也表明，在随机临床试验中，奥氮平相比其他抗精神病药物，如：阿立哌唑，喹硫平，利培酮，齐拉西酮和奋乃静，有更低的全因停药率(al l-cause treatmentdiscontinuation)。在观察性研究中，奥氮平的全因停药率低于其他抗精神病药物，如：氨磺必利、利培酮，氟哌啶醇和奋乃静。但它产生代谢副反应的风险与二线用药氯氮平相类似，其代谢副作用要远高于其他一线抗精神病药物。

利培酮也是精神科常用非典型抗精神病药之一，该药对精神分裂症的阳性、阴性症状均有效，不良反应尤其是锥体外系副反应少见。代谢副反应虽然低于氯氮平和奥氮平，但糖脂代谢紊乱尤其是体重增加，仍然高于其它抗精神病药物。

检测试剂

本发明的检测试剂包括蛋白芯片、核酸芯片、或其组合。

检测方法：全血提取DNA后，使用引物(正向引物： tacaggaaccaatacccatagg，反向引物：aatggtaaactcggggac，于F5‘端进行FAM 标记),进行PCR反应，使用ABI3730xl设备检测STR样本。

在另一优选例中，本发明的检测试剂还包括MIF特异性抗体。

蛋白芯片是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。捕获分子一般都预固定在芯片表面，由于抗体的高度特异性和与抗原强结合特性所以被广泛的用做捕获分子。对于研究蛋白芯片的研究在芯片表面有效固定抗体是非常关键的，特别是在固定抗体一致性方面非常关键对于增强蛋白芯片的灵敏度。G蛋白是一种抗体结合蛋白，他特意结合抗体FC片段，因此已被广泛的用于固定不同类型的抗体。本发明的检测MIF 的蛋白芯片可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

核酸芯片，又名DNA芯片、基因芯片(gene chip)或基因微阵列 (microarray)，指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA 探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。换言之，基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针) 有规律地排列固定于2cm²的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维的DNA探针阵列，与电子计算机上的电子芯片十分相似所以被称为基因芯片。

本发明涉及对人MIF具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MIF基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MIF基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MIF蛋白的分子，也包括那些并不影响人MIF蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人MIF基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链 Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人MIF基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MIF蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976； Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier, N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人MIF蛋白功能的抗体以及不影响人MIF 蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人MIF基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MIF基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如 E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

检测方法和检测试剂盒

本发明提供了利用MIF及其检测试剂的检测方法和检测试剂盒。

具体地，本发明提供了一试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测MIF的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于判断精神分裂症患者是否适合用二代抗精神病药物进行治疗。

本发明还提供了一种判断精神分裂症患者是否适合用二代抗精神病药物进行治疗的方法，包括步骤：

(a)提供一测试对象；

(b)对测试对象的MIF基因的四核苷酸微卫星重复进行检测；

本发明的主要优点包括：

(a)本发明可以提前预测奥氮平等二代抗精神病药物的发生肥胖和代谢不良反应，目前临床上无类似技术应用。

(b)本发明检测方便，创伤小。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

本研究纳入2010-2015年间，首发未用药的中国汉族患者，年龄在18～50 岁之间，符合DSM-IV精神分裂症标准，总PANSS≥60级。吸烟，饮酒，物质依赖，严重躯体疾病(如癌症，糖尿病)，其他中枢神经系统疾病和/或怀孕患者被排除在参与之外，共有56例平均年龄28.0±6.6岁的患者(28例男性和28 名女性)进行研究。合格患者接受奥氮平单药治疗60天，每天5毫克的初始剂量开始，逐渐增加至每日15-20毫克。如果患者出现锥体外系症状，则允许使用盐酸苯海考醇片。BMI和PANSS评分分别在基线和用药60天后评估一次。

MIF和代谢指标分析：病人分别在基线和用药一、二个月抽血一次。上午 7:00至9:00之间，从禁食状态的患者收集外周静脉血。血浆葡萄糖，胰岛素和脂质水平在上海市精神卫生中心实验室确定，经中国国家认可委员会认证合格评定(CNAS)。用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定血浆MIF水平。从全血样品中提取DNA，并测序MIF基因以测定-794CATT5-8多态性(rs5844572)。获得数据并以盲法分析。

数据分析：统计分析使用SPSS(版本17.0)完成。使用单样本Kolmogorov-Smirnov检验来检查数据正态分布。卡方检验、t检验和单因素方差分析测试分析人口统计学数据。如果数据不正态分布，则通过使用自然对数或非参数统计分析(Whitney-Mann U检验)将其转化为正态分布。进行配对t 检验以分析治疗前和治疗后组中的血浆MIF。所有显着水平均为双尾测试，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

实施例1

临床样本评估

56例奥氮平单药治疗的首发未用药病人的基本情况见表1。

尽管空腹血浆葡萄糖水平没有变化，但在这些受试者(图1A-1C)中，体重指数(BMI)、胰岛素血症和甘油三酯血症都明显增高(图1D)。胰岛素抵抗(HOMA-IR)评分(代谢功能障碍指数)也从基线水平1.5增加到2.5(图1E)。值得注意的是，在这些患者中，奥氮平治疗后血浆MIF浓度增加(图1F)，并且这些测量与高胰岛素血症增加(图1G)，高甘油三酯血症(图1H)和胰岛素抵抗评分(图1I)相关。

实施例2

MIF基因变异对奥氮平诱导的代谢副作用的影响

基于a-794CATT5/5基因型(CATT 5/5，即最低MIF表达水平)，或非 794CATT5/5基因型(CATT非5/5，即更高MIF表达)将患者分为低表达或高表达MIF基因型。与未服药组相比，高表达MIF基因型组(CATT非-5/5)表现出增加的血浆MIF，HOMA-IR评分和BMI，以及胰岛素，甘油三酯的血浆水平升高和HDL降低(图2A)。相比之下，在CATT 5/5患者中，奥氮平治疗不改变血浆MIF水平，HOMA IR评分，BMI或其他测量代谢指标(即胰岛素，葡萄糖，甘油三酸酯，HDL和总胆固醇)(图2B)。因此，这些数据表明MIF基因变异影响奥氮平诱导的代谢副作用的发展。

实施例3

MIF基因变异对利培酮诱导的代谢副作用的影响

利培酮分别给予C57/B6J野生型和Mif-/-小鼠四周后，检测小鼠的糖脂代谢表型。

结果如图3所示，利培酮处理后，野生型小鼠的体重和摄食量均增加，但利培酮处理前后的Mif-/-小鼠均无明显变化(图3A，3B)。另外，利培酮处理后，小鼠的糖耐量升高(有统计学意义)，而利培酮处理前后的Mif-/-小鼠均无明显变化(图3C)。以上结果表明，利培酮诱导的糖脂代谢紊乱症状在C57/B6J 小鼠中证实与MIF相关。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)基因序列、蛋白、或检测试剂的用途，其特征在于，用于制备诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于判断精神分裂症患者使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险(易感性)。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的二代抗精神病药物选自下组：氯氮平、奥氮平、利培酮、喹硫平、阿立哌唑、齐拉西酮、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的代谢异常包括糖类代谢异常、和/或脂类代谢异常。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的脂类选自下组：总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(ApoB)，较佳地，所述的脂类代谢异常包括(血浆中)总胆固醇水平升高、甘油三酯水平升高、和/或高密度脂蛋白水平降低。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的糖类代谢异常为葡萄糖代谢异常。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的代谢异常包括胰岛素水平增加、HOMAIR(胰岛素抵抗)评分增加、和/或BMI(体重指数)增加。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的判断是对测试对象的MIF基因的四核苷酸微卫星重复(-794CATT_5-8，rs5844572)进行检测，若所述的四核苷酸微卫星重复为CATT₅重复，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险低，若所述的四核苷酸微卫星重复为CATT_6-8重复，则说明使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险高。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂用于检测精神分裂症患者的MIF基因型，较佳地为MIF基因四核苷酸微卫星重复的类型。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的判断包括辅助判断和/或治疗前判断。

10.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测MIF的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于判断精神分裂症患者使用二代抗精神病药物治疗后发生代谢异常的风险。