CN109852721A - 检测慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测慢性关节炎病的生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物或真菌其他成分中的一种或多种，并提出了检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，通过检测慢性关节炎病人人体生物样本中是否存在该生物标志物以及生物标志物的种类，进而作为慢性关节炎病的病因分类辅助诊断、病程观测、治疗方案或预后判断的依据。本发明公开了一种检测慢性关节炎病的生物标志物的检测方法。开辟了慢性关节炎的治疗、根治和预防的新靶点。

Description

检测慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法

技术领域

本发明涉及生物标志物技术领域，具体涉及一种检测慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法。

背景技术

人类关节炎的发病率大约为20-30％(2017年，美国有5400万关节炎患者，占成年人25％)，既全世界当前大约有10多亿人患有关节炎。人类慢性关节炎病的病理机制、关节炎特征、治疗和预后都很相似，目前它们的致病病理机制被认为是遗传因素和环境因素。除创伤性关节、感染性关节炎等已知病因、病原的关节炎外，大多数慢性关节炎病慢性反复发作、多发关节炎，其中包括类风湿关节、银屑病关节炎、强直性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮等结缔组织疾病或自身免疫性疾病的关节炎。早期的主要表现是关节僵直、疼痛、肿胀等多关节滑膜炎症状的表现，特别是指关节受累；晚期累及骨关节，导致骨关节疼痛、变形及全身各脏器受累。由于类风湿性关节炎和银屑病尚未有明确的致病病因，慢性关节炎病目前仍是终身性慢性病，被认为是遗传-环境多因素导致自身免疫性疾病，不能治愈，仅仅对症治疗，缓解病情。

因此，实现慢性关节炎病更早的诊断、治疗和改善预后及分类，需要发现和明确病因及致病机制，根据病因分类能够实现高灵敏度的分类诊断检测慢性关节炎病的生物标志物。

发明内容

针对现有慢性关节炎病的诊断、治疗中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测部分病因不明慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法，可实现慢性关节炎诊断分类。

为达到以上目的，本发明提供了一种检测慢性关节炎病的分类生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物中的一种或多种。

所述致病真菌的特异性核酸序列为聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因或聚多曲霉全基因组。所述聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因为SEQ ID NO:3所示序列。所述聚多曲霉全基因组为SEQ ID NO:4所示序列。所述真菌分泌物包括蛋白和/或蛋白组，任选地，所述真菌分泌物包括曲霉半乳甘露聚糖。

在上述技术方案的基础上，本发明还提供了检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，通过检测人体生物样本中是否存在所述生物标志物，作为慢性关节炎病的病因分类诊断、病程、治疗或预后依据。通过检测人体生物样本中的所述生物标志物的种类和计量，对慢性关节炎进行分类。

本发明还提供了慢性关节炎病的生物标志物的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括感染局部真菌培养法、真菌核酸检测法、真菌蛋白免疫检测法。

所述真菌核酸检测法包括：提取待测样本，PCR扩增、DNA测序、循环血中游离DNA检测；所述真菌蛋白免疫检测法包括：蛋白电泳、蛋白印记酶标检测法和/或蛋白化学或免疫学检测法。

所述血清真菌感染测法包括：抗凝采血，血清真菌成分检测，包括1,3-β-D葡聚糖检测(简称G试验)和半乳甘露聚糖(简称为GM试验)

所述真菌培养法包括以下步骤：

提取待测样本，真菌培养，肉眼或显微镜观察；

若所述样本出现霉菌或菌丝，确认存在生物标志物，若所述样本未出现霉菌或菌丝，将所述未出现霉菌或菌丝的样本进行无菌组织培养，观察；

更换新鲜培养液，真菌培养，肉眼或显微镜观察；若出现霉菌或菌丝，确认存在生物标志物，若未出现霉菌或菌丝，确认无真菌感染。

待测样本包括皮肤表皮、血液、体液或真菌感染组织。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明公开了慢性关节炎的生物标志物为致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物中的一种或多种，并提出了通过检测人体生物样本中生物标志物的存在与否和生物标志物的种类，进而作为慢性关节炎病的诊断、病程、治疗或预后依据，可实现慢性关节炎的诊断分类。

附图说明

图1为本发明实施例人体生物样本中的致病真菌的检测方法的流程示意图；

图2为本发明实施例人体生物样本中的致病真菌的检测步骤中培养出的菌丝以及真菌菌丝从人表皮细胞中长出的显微镜下观察图；

图3为真菌-表皮杂交细胞电镜图，1为真菌细胞核，2为细胞膜，3为内质网，4为线粒体；

图4为本发明实施例聚多曲霉的5.8S ribosomal RNA基因的PCR扩增的电泳图；

图5为免疫组化染色的关节炎病人皮肤表皮细胞组织(B)与正常皮肤表皮细胞组织(A)对比图，其中B1和B2是图B的局部放大图；

图6为真菌分泌蛋白的电泳图；

图7为真菌分泌蛋白的印记酶标检测图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：慢性关节炎病的生物标志物的应用

通过检测人体生物样本中是否存在生物标志物，作为慢性关节炎病的病因诊断、病程、治疗或预后依据。通过检测人体生物样本中的所述生物标志物的种类和计量，对慢性关节炎进行分类。

皮下注射真菌分泌蛋白量1.0mL、过滤灭菌的真菌培养液或过滤纯化-浓缩真菌分泌蛋白溶液(200μL)。纯化的蛋白溶液在SDS-PAGE图像定量检测含有大约30种分泌蛋白的混合物，每个蛋白定量大约为0.01至1.5μg/mL。每天注射一次，连续9天，诱发关节炎症状。

实施例2：用标志物来辅助关节炎分类诊断

如图1，从脚底皮肤剪削湘雅病变组织，(湘雅病变即皮肤表皮细胞的细胞内和细胞外真菌感染引起的皮肤病变)，切成两片，分别放入6孔板的A孔和B孔中，加入2.5mL无血清培养液，在37℃培养5日；

肉眼或显微镜下观察是否出现霉菌或菌丝，若出现，则确定存在真菌感染，若没有出现，继续在37℃培养5日，观察是否形成肿瘤样组织；

更换新鲜培养液后，继续培养5日，观察肿瘤样组织和非肿瘤样组织之外的病变组织，是否出现霉菌或菌丝，如果出现，则确定存在真菌感染。图2为显微镜下观察的菌丝，图3为真菌-表皮杂交细胞电镜图，见人体病变上皮中有真菌真菌成分1为真菌细胞核，2为细胞膜，3为内质网，4为线粒体。

电镜检测真菌-表皮杂交细胞(僵尸细胞)见人类表皮细胞内散在的多个真菌细胞核。这样的细胞能分泌真菌蛋白到关节炎病人的血循环中到关节，引起关节炎病对慢性关节炎病因分类诊断。

实施例3：真菌核酸检测法检测慢性关节炎病的生物标志物

真菌核酸检测法包括：提取真菌感染组织，进行PCR扩增、DNA测序、循环血中游离DNA检测，检测扩增产物中是否包括致病真菌的特异性核酸序列，以确定是否存在生物标志物。

在皮肤真菌感染(湘雅病变)处表面清洗、消毒处理，取其表皮组织100-200mg，研磨成碎粉后加入100μL细胞溶解液(5mM EDTA,10mM Tris.HCl pH7.5,Proteinase K 200μg)，用液氮冷冻。加入1μL引物1(1μg/μL)、1μL引物2(1μg/μL)，2μL dNTP(100mM)混合，再加入2μL缓冲液、1μL Taq聚合酶，加水至溶液20μL，控制细胞裂解和DNA变性温度为95℃，时长7min，搅拌并控制温度分别为62℃ 1min，72℃ 3min，94℃ 1min，反应末控制温度72℃7min。取2μL反应产物，加入2μL上样缓冲液(2X)，上样至1.5％琼脂糖凝胶，电泳30min，凝胶成像。扩增DNA片段测序。

5.8S ribosome RNA基因序列：

TGTTCTGGGAATGCGGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA

通过生物标志物曲霉菌5.8S ribosome RNA基因序列测序结果，来检测来自关节炎患者生物样本中存在关节炎标志物曲霉的种类，所述生物标志物可以用于表征关节炎的预后、诊断或治疗。例如在确定标志物曲霉菌的物种后，来决定有效的治疗方案和药物选择。

致病真菌的特异性核酸序列为聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因或聚多曲霉全基因组，聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因为SEQ ID NO:3所示序列，聚多曲霉全基因组为SEQ ID NO:4所示序列。检测聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因的特异性引物为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示序列。

图4为本发明实施例聚多曲霉的5.8S ribosomal RNA基因的PCR扩增的电泳。

实施例4：以真菌蛋白免疫检测法检测慢性关节炎病的生物标志物

提取待测样本，通过蛋白电泳、蛋白印记酶标检测和/或其他蛋白化学或免疫学方法来检测是否包括血清半乳甘露聚糖。

检测血清半乳甘露聚糖(GM)，用于慢性关节炎辅助诊断。曲菌特有的细胞壁多糖成分是β(1-5)呋喃半乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。半乳甘露聚糖检测是通过检测人类血液中是否有半乳甘露聚糖，辅助诊断机体是否遭到入侵的曲菌感染的检测方法。GM释放量与菌量成正比，可反映关节炎与曲霉菌相关性。关节炎病人血清中GM试验阳性也可作辅助诊断的重要指标，特别是关节炎复发(检测阳性)期于关节炎缓解期(检测阴性)的GM试验结果比较，能够辅助诊断关节炎的类型。

用抗曲霉菌可溶性蛋白抗体检测关节炎病人皮肤表皮细胞组织，可发现曲霉菌蛋白，用抗曲霉菌可溶性蛋白抗体检测，正常皮肤表皮细胞组织。(如图5)可见部分病变细胞大量表达曲霉菌蛋白。

关节炎病人血样本中曲霉菌抗原检测(GM试验)。深部曲霉菌严重感染时，GM试验结果应当大于0.5，而表面皮肤感染所致的关节炎，血中曲霉半乳甘露聚0-0.5。

种属	G试验*	GM试验**
			念珠菌	+	-
镰刀菌属	+	-
			隐球菌属	-	+
曲霉菌属	+	+
			青霉菌	+	+
皮癣菌属	-	-

*G试验：检测真菌的细胞壁成分---(1,3)-β-D-葡聚糖

**GM试验：检测血清曲霉菌半乳甘露聚糖抗原

GM试验：检测的是半乳甘露聚糖，用于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断或隐匿性曲菌感染。曲霉菌特有的细胞壁多糖成分是β(1-5)呋喃半乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，释放的抗原。GM释放量与生长菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测GM可作为治疗疗效的监测。

G试验：检测的是真菌的细胞壁成分---(1,3)-β-D-葡聚糖，被吞噬细胞吞噬真菌后，释放该物质，血液及体液中增高(表浅真菌感染可能不会)。1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎(Limulus)变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固。

关节炎病人的这些检测阳性，特别是动态观察的阳性成度与关节炎病情一致，则提示真菌分泌蛋白介导的关节炎，而进行抗真菌药物口服或局部的试验性治疗。

关节炎病人血样本中存在曲霉菌、青霉菌、念球菌、镰刀菌、隐球菌及其分泌物，通过检测病人血清中这两种物质，G试验和GM试验两种检测，一是可以更确定曲霉菌和青霉菌的感染；二是可以鉴别不同真菌感染，比如念珠菌、瘾球菌、曲霉菌等。

图6为本发明实施例真菌分泌蛋白的电泳观察，这些蛋白注射到人体皮下后可引起或加重关节炎；图7为本发明实施例真菌分泌蛋白的印记酶标检测图，显示病人血清中抗真菌抗体与部分分泌蛋白有结合反应。

本发明公开了慢性关节炎的生物标志物为致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物中的一种或多种，并提出了通过检测人体生物样本中生物标志物的存在与否和生物标志物的种类，进而作为慢性关节炎病的诊断分类、病程观察、治疗选择或预后评估的依据，可实现慢性关节炎的诊断分类。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110> 朱小湘

<120> 生物标志物和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 547

<212> DNA

<213> 聚多曲霉(Aspergillus sydowii)

<400> 3

tgttctggga atgcggggct gcctccgggc gcccaacctc ccacccgtga atacctaaca 60

ctgttgcttc ggcggggaac cccctcgggg gcgagccgcc ggggactact gaacttcatg 120

cctgagagtg atgcagtctg agtctgaata taaaatcagt caaaactttc aacaatggat 180

ctcttggttc cggcatcgat gaagaacgca gcgaactgcg ataagtaatg tgaattgcag 240

aattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc ccctggcatt ccggggggca 300

tgcctgtccg agcgtcattg ctgcccatca agcccggctt gtgtgttggg tcgtcgtccc 360

ccccggggga cgggcccgaa aggcagcggc ggcaccgtgt ccggtcctcg agcgtatggg 420

gctttgtcac ccgctcgact agggccggcc gggcgccagc cgacgtctcc aaccattttt 480

cttcaggttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg 540

gaggaaa 547

Claims (10)

1.一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物或真菌其他成分中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述致病真菌的特异性核酸序列为聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因或聚多曲霉全基因组。

3.如权利要求2所述的一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述聚多曲霉5.8S ribosomal RNA基因为SEQ ID NO:3所示序列。

4.如权利要求2所述的一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述聚多曲霉全基因组为SEQ ID NO:4所示序列。

5.如权利要求1所述的检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述真菌分泌物包括蛋白和/或蛋白组或真菌其他成分，任选地，所述真菌分泌物包括曲霉半乳甘露聚糖和1,3-β-D葡聚糖。

6.一种如权利要求1～5任意一项所述的检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，其特征在于：通过检测关节炎病人人体生物样本中是否存在所述生物标志物，作为慢性关节炎病的病因诊断分类、病程观察、治疗选择或预后评估依据。

7.一种如权利要求1～5任意一项所述的检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，其特征在于：通过检测人体生物样本中的所述生物标志物的种类和计量，对关节炎进行分类。

8.一种如权利要求1～5任意一项所述的慢性关节炎病的生物标志物的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括真菌培养法、真菌核酸检测法、真菌蛋白或真菌其他成分免疫检测法，优选的，包括GM试验和G试验。

9.如权利要求8所述的一种慢性关节炎病的生物标志物的检测方法，其特征在于：所述真菌核酸检测法包括：提取待测样本，PCR扩增、DNA测序、循环血中游离DNA检测；所述真菌蛋白免疫检测法包括：蛋白电泳、蛋白印记酶标检测法和/或蛋白化学或免疫学方法，任选地，待测样本包括皮肤表皮、血液、体液或真菌感染组织。

10.如权利要求8所述的一种慢性关节炎病的生物标志物的检测方法，其特征在于：所述真菌培养法包括以下步骤：

提取待测样本，真菌培养，肉眼或显微镜观察；

若所述样本出现霉菌或菌丝，确认存在生物标志物，若所述样本未出现霉菌或菌丝，将所述未出现霉菌或菌丝的样本进行无菌组织培养，观察；

更换新鲜培养液，真菌培养，肉眼或显微镜观察；若出现霉菌或菌丝，确认存在生物标志物，若未出现霉菌或菌丝，确认无真菌感染。