CN109847068B - 一种獐牙菜苦苷的配位包合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种獐牙菜苦苷的配位包合物及其制备方法和应用，涉及獐牙菜苦苷衍生物技术领域，本发明提供的獐牙菜苦苷的配位包合物，所述配位包合物的主体分子为环糊精或环糊精衍生物，客体分子为獐牙菜苦苷，所述主体分子与客体分子的化学计量比为1:1。本发明采用1H NMR和2D NMR、XRD、FT‑IR等方法对所述配位包合物进行表征，结果显示，獐牙菜苦苷进入环糊精或环糊精衍生物的疏水空腔内并形成配位键，实现了分子结构的重排，进而獐牙菜苦苷的配位包合物相对于獐牙菜苦苷的水溶性、稳定性有显著提高，并减轻了獐牙菜苦苷的苦味。
Description
技术领域
本发明涉及獐牙菜苦苷衍生物技术领域，尤其涉及一种獐牙菜苦苷的配位包合物及其制备方法和应用。
背景技术
萜类化合物是由异戊二烯或异戊烷以不同方式连结而成的一类天然化合物。环烯醚萜类化合物是一类广泛存在于玄参科、茜草科、唇形科及龙胆科植物中的单萜物质，具有利胆、健胃、降糖、抗菌消炎等生理活性。青叶胆(Swertia mileensis)，一种重要的药草属Swertia/Gentianceae植物，在云南彝族和哈尼少数民族地区被用于治疗病毒性肝炎(TCM)。随着Swertia 植物的药理和毒性的研究，青叶胆提取物已正式记录在中国药典(1977-2010 版)。最近临床研究显示，青叶胆的给药治愈率高达90％以上。
獐牙菜苦苷(Swertiamarin，又名獐牙菜苦素)，是植物中发现的环烯醚萜苷的Swertia属，是Swertia植物中的重要组成成分，如Swertia mileensis， Swertia japonicaand Swertia chirata等。其具有重要和广泛的药理活性，包括抗菌，肝保护，抗氧化剂，抗高脂血症，抗胆碱能，抗雌激素和抗痉挛，据报道，獐牙菜苦苷可作为小鼠和大鼠中的抗抑郁药。另外，其具有抗炎、抗病毒作用，用于毛发再生剂。
然而，由于獐牙菜苦苷味苦，在空气中有吸湿性，微溶于水，有吸湿性等缺点，限制了其在药物制剂中的运用，在其味苦方面现研究尚未见报道，需要寻找一种能够改变獐牙菜苦苷的味苦和水溶性的缺点的方式，以提高临床上的应用。
发明内容
本发明为了克服现有獐牙菜苦苷味苦并且水溶性差的缺陷，提供了一种獐牙菜苦苷的配位包合物及其制备方法和应用，通过环糊精或环糊精衍生物与獐牙菜苦苷构建为配位包合物，不仅能有效改善了獐牙菜苦苷的味苦、水溶性，且提高其稳定性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种獐牙菜苦苷的配位包合物，所述配位包合物的主体分子为环糊精或环糊精衍生物，客体分子为獐牙菜苦苷，所述主体分子与客体分子的化学计量比为1:1。
优选的，所述环糊精包括α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
优选的，所述环糊精衍生物包括2-羟丙基-β-环糊精或2,3,6-三甲基-β- 环糊精。
本发明还提供了一种上述技术方案所述獐牙菜苦苷的配位包合物的制备方法，包括以下步骤：
1)以乙醇溶解獐牙菜苦苷，得到獐牙菜苦苷乙醇溶液；
2)向獐牙菜苦苷乙醇溶液中加水至浑浊后，加入环糊精或环糊精衍生物，得到预混合物；
3)将预混合物避光搅拌，得到配位包合物混合物；
4)过滤所述配位包合物混合物，所得滤液进行干燥，得到獐牙菜苦苷的配位包合物。
优选的，步骤1)中，所述獐牙菜苦苷的质量与乙醇的体积之比为 3.5～4mg：1.5～3ml。
优选的，步骤2)中，所述预混合物中獐牙菜苦苷与环糊精或环糊精衍生物的摩尔比为1:1。
优选的，步骤3)中，所述搅拌时间为5～10d。
优选的，步骤4)中，所述过滤为0.45μm微孔滤膜过滤。
优选的，步骤4)中，所述干燥依次包括蒸发干燥步骤和真空干燥步骤。
本发明还提供了前述技术方案所述獐牙菜苦苷的配位包合物或上述技术方案所述方法制备得到的獐牙菜苦苷的配位包合物在制备水溶性药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供的獐牙菜苦苷的配位包合物，所述配位包合物的主体分子为环糊精或环糊精衍生物，客体分子为獐牙菜苦苷，所述主体分子与客体分子的化学计量比为1:1。本发明采用1H NMR和2D NMR、XRD、FT-IR等方法对所述配位包合物进行表征，结果显示，獐牙菜苦苷进入环糊精或环糊精衍生物的疏水空腔内并形成配位键，实现了分子结构的重排，进而獐牙菜苦苷的配位包合物相对于獐牙菜苦苷的水溶性、稳定性有显著提高，并减轻了獐牙菜苦苷的苦味。
附图说明
图1为环糊精及其衍生物的结构示意图；
图2为α-CD、獐牙菜苦苷/α-CD的1H NMR检测结果；(a)α-CD、(b) Swertiamarin/α-CD包合物在25℃的1H NMR谱图(D2O，氘代水峰用星号标注)
图3为环糊精与獐牙菜苦苷包合前后的1H NMR谱图(D2O，25℃)；其中，图3-1的a为β-CD，b为实施例2制备得到的獐牙菜苦苷/β-CD；图3-2 的c为γ-CD，d为实施例3制备得到的獐牙菜苦苷/γ-CD；
图4为环糊精衍生物与獐牙菜苦苷包合前后的1H NMR谱图(D2O， 25℃)；其中，图4-1的a为HPβ-CD，b为实施例4制备得到的獐牙菜苦苷 /HPβ-CD；图4-2的c为TMβ-CD，d为实施例5制备得到的獐牙菜苦苷 /TMβ-CD；
图5为獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物的ROESY谱图；
图6为獐牙菜苦苷/γCD的配位包合物的ROESY谱图；
图7为獐牙菜苦苷/HPβCD的配位包合物的ROESY谱图；
图8为獐牙菜苦苷/CDs的配位包合物的可能包结模式与关键的
相关；其中，图8-1表示獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物、獐牙菜苦苷/HPβ-CD的配位包合物的可能包结模式与关键的
相关；图 8-2表示獐牙菜苦苷/γ-CD的配位包合物的可能包结模式与关键的
相关；
图9为实施例7中环糊精包合的各组X-射线衍射检测结果；其中，a、獐牙菜苦苷、b、α-CD、c、獐牙菜苦苷/α-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物、e、β-CD、f、獐牙菜苦苷/β-CD的物理混合物、g、獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物；
图10为实施例7中环糊精衍生物包合的各组X-射线衍射检测结果；a、獐牙菜苦苷、b、HP-βCD、c、獐牙菜苦苷/HPβ-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/HPβ-CD包合物、e、TMβ-CD、f、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的物理混合物、g、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物；
图11为实施例8中环糊精、獐牙菜苦苷及其配位包合物的IR图；其中， a、獐牙菜苦苷、b、α-CD、c、β-CD、d、γ-CD、e、獐牙菜苦苷/α-CD 的配位包合物、f、獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物、g、獐牙菜苦苷/γ-CD 的配位包合物；
图12为实施例8中环糊精衍生物、獐牙菜苦苷及其配位包合物的IR图；其中，a、獐牙菜苦苷、b、HPβ-CD、c、TMβ-CD、d、獐牙菜苦苷/HPβ -CD的物理混合物、e、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的物理混合物、f、獐牙菜苦苷/HPβ-CD的配位包合物、g、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物；
图13为实施例9中α-CD与獐牙菜苦苷复合的SEM图；a、α-CD、b、獐牙菜苦苷、c、獐牙菜苦苷/α-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/α-CD 的配位包合物；
图14为实施例9中β-CD与獐牙菜苦苷复合的SEM图；a、β-CD、b、獐牙菜苦苷、c、獐牙菜苦苷/β-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/β-CD 的配位包合物；
图15为实施例9中γ-CD与獐牙菜苦苷复合的SEM图；a、γ-CD、b、獐牙菜苦苷、c、獐牙菜苦苷/γ-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/γ-CD 的配位包合物；
图16为实施例9中HPβ-CD与獐牙菜苦苷复合的SEM图；a、HPβ-CD、 b、獐牙菜苦苷、c、獐牙菜苦苷/HPβ-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/HP β-CD的配位包合物；
图17为实施例9中TMβ-CD与獐牙菜苦苷复合的SEM图；a、TMβ -CD、b、獐牙菜苦苷、c、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的物理混合物、d、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物；
图18为实施例11中獐牙菜苦苷、獐牙菜苦苷/α-CD包合物、獐牙菜苦苷/γ-CD包合物在不同pH条件下相对吸光度值随时间变化的曲线；相对吸光度值A/A0(A为每12±2h周期测得的吸光度，A0为原始吸光度)；其中：
(a)獐牙菜苦苷在pH＝7.6；(b)獐牙菜苦苷/α-CD包合物在pH＝7.6；(c) 獐牙菜苦苷/γ-CD包合物在pH＝7.6；(d)獐牙菜苦苷在pH＝1.5；(e)獐牙菜苦苷/α-CD包合物在pH＝1.5；(f)獐牙菜苦苷/γ-CD包合物在pH＝1.5时；
图19为实施例11中獐牙菜苦苷、獐牙菜苦苷/β-CD、獐牙菜苦苷/HP- β-CD、獐牙菜苦苷/TM-β-CD包合物在不同pH条件下相对吸光度值随时间变化的曲线；相对吸光度值A/A0(A为每12±2h周期测得的吸光度，A0 为原始吸光度)；其中：
獐牙菜苦苷在pH＝7.6；(g)獐牙菜苦苷/β-CD包合物在pH＝7.6；(h)獐牙菜苦苷/HP-β-CD包合物在pH＝7.6；(i)獐牙菜苦苷/TM-β-CD包合物在 pH＝7.6；(d)獐牙菜苦苷在pH＝1.5；(j)獐牙菜苦苷/β-CD包合物在pH＝1.5； (k)獐牙菜苦苷/HP-β-CD包合物在pH＝1.5；(m)獐牙菜苦苷/TM-β-CD包合物在pH＝1.5时；
图20A为獐牙菜苦苷在/β-CD包合物在pH＝3.0(A)的缓冲溶液/乙醇 (V/V＝4:1)的紫外吸收曲线，插图为吸光度的理论值和实际值的拟合曲线；
图20B为獐牙菜苦苷在/HP-β-CD包合物在pH＝3.0(A)的缓冲溶液/乙醇(V/V＝4:1)的紫外吸收曲线，插图为吸光度的理论值和实际值的拟合曲线；
图20C为獐牙菜苦苷在/TM-β-CD包合物在pH＝3.0(A)的缓冲溶液/ 乙醇(V/V＝4:1)的紫外吸收曲线，插图为吸光度的理论值和实际值的拟合曲线；
图20D为獐牙菜苦苷在/α-CD包合物在pH＝3.0(A)的缓冲溶液/乙醇 (V/V＝4:1)的紫外吸收曲线，插图为吸光度的理论值和实际值的拟合曲线；
图20E为獐牙菜苦苷在/γ-CD包合物在pH＝3.0(A)的缓冲溶液/乙醇 (V/V＝4:1)的紫外吸收曲线，插图为吸光度的理论值和实际值的拟合曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种獐牙菜苦苷的配位包合物，其特征在于，所述配位包合物的主体分子为环糊精或环糊精衍生物，客体分子为獐牙菜苦苷，所述主体分子与客体分子的化学计量比为1:1。
獐牙菜苦苷的结构式如式a所示，本发明对獐牙菜苦苷的来源无特殊限定，采用市售购买或自行分离制备的均可。
如图1所示，环糊精(cyclodextrins，CDs)具有疏水空腔和亲水外壁这一独特的性能，可作为一种低毒的药物载体。一般的环糊精包合仅是物理反应，不发生化学键或配位键等反应。本发明提供的獐牙菜苦苷的配位包合物以环糊精或环糊精衍生物为主体分子，獐牙菜苦苷为客体分子，獐牙菜苦苷进入环糊精或环糊精衍生物的疏水空腔内，并且二者之间通过配位键结合，使得构建的配合包合物水溶性提高、稳定性提高，并且减轻了獐牙菜苦苷的苦味。
在本发明中，所述环糊精优选的包括α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精；在本发明中，所述环糊精衍生物优选的包括2-羟丙基-β-环糊精或2,3,6-三甲基-β-环糊精。不同的环糊精或环糊精衍生物作为主体分子时，本发明所述獐牙菜苦苷的配位包合物的表面结构有所差异(如实施例所示)，但是均能够在主体分子与客体分子之间形成配合键，而非简单的结合。
本发明还提供了一种上述技术方案所述獐牙菜苦苷的配位包合物，包括以下步骤：
1)以乙醇溶解獐牙菜苦苷，得到獐牙菜苦苷乙醇溶液；
2)向所述獐牙菜苦苷乙醇溶液中加水至浑浊后，加入环糊精或环糊精衍生物，得到预混合物；
3)将预混合物避光搅拌，得到配位包合物混合物；
4)过滤所述配位包合物混合物，所得滤液进行干燥，得到獐牙菜苦苷的配位包合物。
本发明采用饱和溶液法制备獐牙菜苦苷的配位包合物。具体来说，本发明首先采用乙醇溶解獐牙菜苦苷，得到獐牙菜苦苷乙醇溶液。乙醇起到溶剂作用，用于完全溶解獐牙菜苦苷。在本发明中，所述獐牙菜苦苷的质量与乙醇的体积之比优选为3.5～4mg：1.5～3ml；更优选为3.8mg:2ml。
得到獐牙菜苦苷乙醇溶液后，本发明向獐牙菜苦苷乙醇溶液中加水至浑浊后，加入环糊精或环糊精衍生物，得到预混合物。本发明向獐牙菜苦苷乙醇溶液加水的目的是为了降低溶液中乙醇的浓度，使溶液极性发生改变，进而导致獐牙菜苦苷析出。本发明优选的，添加环糊精或环糊精衍生物直至所述预混合物中獐牙菜苦苷与环糊精或环糊精衍生物的摩尔比为1:1，以满足所述獐牙菜苦苷的配合包合物中主体分子与客体分子的化学计量比为1:1。
得到预混合物后，本发明将预混合物避光搅拌，得到配位包合物混合物。在本发明中，所述搅拌的速率优选为800～1200rpm，更优选为1000rpm。在本发明中，所述避光搅拌时间优选为5～10d，更优选为7d。本发明进行搅拌的目的是为了促进獐牙菜苦苷进入环糊精的空腔。在避光搅拌过程中，獐牙菜苦苷进入环糊精或环糊精衍生物的疏水内壳中并形成配位键，从而反应得到配位包合物，即所述配位包合物混合物中包括由獐牙菜苦苷的配位包合物以及未反应的獐牙菜苦苷、环糊精或环糊精衍生物等。
得到配位包合物混合物后，本发明过滤所述配位包合物混合物，所得滤液进行干燥，得到獐牙菜苦苷的配位包合物。在本发明中，过滤的目的是为了去除未结合的獐牙菜苦苷、环糊精或环糊精衍生物。本发明优选的，所述过滤优选的采用0.45μm微孔滤膜进行。
在本发明中，所述干燥优选的依次包括蒸发干燥步骤和真空干燥步骤。具体的，所述蒸发干燥是为了去除大量水分以及残余的乙醇；在本发明中，所述蒸发干燥的温度优选为50～60℃，更优选为56℃；在本发明中，所述真空干燥的目的是为了进一步去除水分；在本发明中，所述真空干燥的真空度优选为70～80MPa，更优选为75MPa；所述真空干燥的温度优选为40～50℃，更优选为45℃；所述真空干燥的时间优选为20～28min，更优选为24min。
在本发明中，所述制备方法在常温(20～28℃)下反应。
按照本发明所述方法制备得到的獐牙菜苦苷的配位化合物纯度可以达到85％以上，并且溶解度可以得到1.07mg/mL以上，而常规的獐牙菜苦苷在水中的溶解度仅为11.8mg/mL左右。
本发明还提供了前述技术方案所述獐牙菜苦苷的配位包合物或上述技术方案所述方法制备得到的獐牙菜苦苷的配位包合物在制备水溶性药物中的应用。所述水溶性药物包括但不限于颗粒剂、片剂、口服液等。在本发明中，所述獐牙菜苦苷的配位包合物在水溶性药物中的质量百分含量在 1～90％。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
仪器与试剂
獐牙菜苦苷(C16H22O10，FW＝374.34，PC>98％，阿拉丁试剂)，
α-环糊精(α-CD，FW＝972.86)、beta-环糊精(β-CD，FW＝1134.98)、γ-环糊精(γ-CD，FW＝1297.15)、2-羟丙基-beta-环糊精(HPβCD，FW＝1460)、 2,3,6-三甲基-beta-环糊精(TMβ-CD，FW＝1429)百灵威试剂有限公司，直接使用；
其余试剂均为分析纯试剂；所有实验用水均为超纯水。
实施例1獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物的制备
室温下，准确称取獐牙菜苦苷(0.01mM，3.8mg)于圆底烧瓶中，然后与2mL乙醇混合，搅拌至药品完全溶解，加入一定量的水至溶液呈浑浊即可，随后加入α-环糊精(0.01mM，9.7mg)，避光下搅拌7d。用0.45μm微孔滤膜过滤除去未反应的獐牙菜苦苷，将滤液蒸干，真空干燥，得到白色固体粉末的獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物(产率80％)。
α-CD、獐牙菜苦苷/α-CD的1H NMR检测结果如图2所示。1H NMR(400MHz，D2O，TMS):δ7.67(s,1H,Swertiamarin的H-3),5.69(s,1H, Swertiamarin的H-1),5.37(dt,1H,Swertiamarin的H-9),5.28(dd,1H, Swertiamarin的H-10),4.99–5.00(s,7H,β-CD的H-1质子),3.30–3.90(m,>50H, β-CD的H-2～6位氢和部分Swertiamarin质子),2.96-2.99(d,1H,Swertiamarin的 H-8),1.74-2.01(m,1H,Swertiamarin的H-6)。
实施例2獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物的制备
室温下，准确称取獐牙菜苦苷(0.01mM，3.8mg)于圆底烧瓶中，然后与2mL乙醇混合，搅拌至药品完全溶解，加入一定量的水至溶液呈浑浊即可，随后加入β-环糊精(0.01mM，11.4mg)，避光下搅拌7d。用0.45μm微孔滤膜过滤除去未反应的獐牙菜苦苷，将滤液蒸干，真空干燥，得到白色固体粉末獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物(产率90％)。
1H NMR(500MHz，D2O，TMS):δ7.68(s,1H,Swertiamarin的H-3),5.69(s, 1H,Swertiamarin的H-1),5.36(dt,1H,Swertiamarin的H-9),5.27(dd,1H, Swertiamarin的H-10),4.97–4.99(s,7H,β-CD的H-1质子),3.20–3.80(m,>50H, β-CD的H-2～6位氢和部分Swertiamarin质子),2.94-2.98(d,1H,Swertiamarin的 H-8),1.76-1.96(m,1H,Swertiamarin的H-6)。
实施例3獐牙菜苦苷/γ-CD的配位包合物
室温下，准确称取獐牙菜苦苷(0.01mM，3.8mg)于圆底烧瓶中，然后与2mL乙醇混合，搅拌至药品完全溶解，加入一定量的水至溶液呈浑浊即可，随后加入γ-环糊精(0.01mM，11.3mg)，避光下搅拌7d。用0.45μm微孔滤膜过滤除去未反应的獐牙菜苦苷，将滤液蒸干，真空干燥，得到白色固体粉末獐牙菜苦苷/γ-CD的配位包合物(产率89％)。
1H NMR(500MHz,D2O,TMS):δ7.68(s,1H,Swertiamarin的H-3),5.69(s, 1H,Swertiamarin的H-1),5.36(dt,1H,Swertiamarin的H-9),5.27(dd,1H, Swertiamarin的H-10),4.98–5.00(s,7H,γ-CD的H-1质子),3.24–3.88(m,>50H, γ-CD的H-2～6位氢和部分Swertiamarin质子),2.94-2.98(d,1H,Swertiamarin的 H-8),1.76-1.96(m,1H,Swertiamarin的H-6)。
实施例4獐牙菜苦苷/HPβ环糊精的配位包合物
室温下，准确称取獐牙菜苦苷(0.01mM，3.8mg)于圆底烧瓶中，然后与2mL乙醇混合，搅拌至药品完全溶解，加入一定量的水至溶液呈浑浊即可，随后加入HPβ-CD(0.01mM，14.6mg)，避光下搅拌7d。用0.45μm微孔滤膜过滤除去未反应的獐牙菜苦苷，将滤液蒸干，真空干燥，得到白色固体粉末獐牙菜苦苷/HPβ-CD的配位包合物(产率90.5％)。
1H NMR(500MHz,D2O,TMS):δ7.66(s,1H,Swertiamarin的H-3),5.67(s, 1H,Swertiamarin的H-1),5.34(dt,1H,Swertiamarin的H-9),5.27(dd,1H, Swertiamarin的H-10),4.95–4.98(s,7H,HPβCD的H-1质子),3.21–3.93(m,100H, HPβCD的H-2～6位氢、亚甲基氢和2,3,6甲基氢及部分Swertiamarin质子),2.95-2.97(d,1H,Swertiamarin的H-8),1.75-1.96(m,1H,Swertiamarin的 H-6)。
实施例5獐牙菜苦苷/TMβ环糊精的配位包合物
室温下，准确称取獐牙菜苦苷(0.01mM，3.8mg)于圆底烧瓶中，然后与2mL乙醇混合，搅拌至药品完全溶解，加入一定量的水至溶液呈浑浊即可，随后加入TMβ-CD(0.01mM，14.3mg)，避光下搅拌7d。用0.45μm微孔滤膜过滤除去未反应的獐牙菜苦苷，将滤液蒸干，真空干燥，得到白色固体粉末獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物(产率86％)。
1H NMR(500MHz,D2O,TMS):δ7.62(s,1H,Swertiamarin的H-3),5.65(s, 1H,Swertiamarin的H-1),5.33(dt,1H,Swertiamarin的H-9),5.21-5.27(dd,1H,Swertiamarin的H-10),5.19–5.22(s,7H,TMβ-CD的H-1质子), 3.19–3.89(m,>110H,TMβ-CD的H-2–6位和OCH3-2,3,6氢及部分 Swertiamarin质子),2.92-2.95(d,1H,Swertiamarin的H-8),1.71-1.97(m,1H, Swertiamarin的H-6)。
对比例1
按摩尔比为1:1称取獐牙菜苦苷(0.01mM)和α-CD(0.01mM)样品于玛瑙研钵中，加入少量水，研磨使其充分混合均匀，减压浓缩，真空干燥，得到獐牙菜苦苷/α-CD物理混合物。
对比例2
按摩尔比为1:1称取獐牙菜苦苷(0.01mM)和β-CD(0.01mM)样品于玛瑙研钵中，加入少量水，研磨使其充分混合均匀，减压浓缩，真空干燥，得到獐牙菜苦苷/β-CD物理混合物。
对比例3
按摩尔比为1:1称取獐牙菜苦苷(0.01mM)和γ-CD(0.01mM)样品于玛瑙研钵中，加入少量水，研磨使其充分混合均匀，减压浓缩，真空干燥，得到獐牙菜苦苷/γ-CD物理混合物。
对比例4
按摩尔比为1:1称取獐牙菜苦苷(0.01mM)和HPβ-CD(0.01mM)样品于玛瑙研钵中，加入少量水，研磨使其充分混合均匀，减压浓缩，真空干燥，得到獐牙菜苦苷/HPβ-CD物理混合物。
对比例5
按摩尔比为1:1称取獐牙菜苦苷(0.01mM)和TMβ-CD(0.01mM)样品于玛瑙研钵中，加入少量水，研磨使其充分混合均匀，减压浓缩，真空干燥，得到獐牙菜苦苷/TMβ-CD物理混合物。
实施例6核磁共振测定
1H NMR和二维ROESY使用瑞士Bruker公司Avance DRX 500MHz核磁共振仪。1H NMR和2D NMR是确定包合物是否形成和包合模式的重要手段。将实施例1～5制备的獐牙菜苦苷/αCD、獐牙菜苦苷/βCD、獐牙菜苦苷/γCD、獐牙菜苦苷/HPβCD、獐牙菜苦苷/TMβ-CD溶于99.98％D2O中，过滤后于 298K下测定(以三甲基硅(TMS)为基准)。检测结果参见实施例1～5。
为了研究獐牙菜苦苷与β-CD及其衍生物的配位包合模式，本文比较了獐牙菜苦苷在主体环糊精或环糊精衍生物存在时的1H NMR谱图和空白CDs (环糊精、环糊精衍生物)的1H NMR谱图，如图3、4所示。
在1H NMR谱图中，通过比较药物的质子峰与环糊精H-1质子峰的积分面积比例，可计算出主体分子环糊精与客体分子獐牙菜苦苷在配位包合物的计量比。结果显示药物獐牙菜苦苷与环糊精或环糊精衍生物在配位包合物的化学计量比为1:1。为了进一步研究药物与环糊精的包合模式，对有无獐牙菜苦苷存在下的环糊精(β-CD、γ-CD、HPβ-CD、TMβ-CD)质子的化学位移做了比较，如表1和表2示。
表1β-CD、γ-CD、獐牙菜苦苷/βCD、獐牙菜苦苷/γCD包合物的H1位移值(δ)
表1中，包合前后对环糊精分子上H的化学位移发生明显变化，β-CD变化为0.07～0.09ppm，γ-CD的变化为0.02～0.05ppm。其中，α-CD上的H-3变化了0.01ppm，而H-5变化了0.03ppm；据H-3、H-5均位于环糊精的空腔内，且 H-3位于大口端，H-5位于小口端，可推断客体分子獐牙菜苦苷是通过α-CD 的小口端进入环糊精空腔包合。β-CD上的H-3变化了0.08ppm，而H-5变化了 0.09ppm；γ-CD上的H-3变化了0.04ppm，而H-5变化了0.02ppm，据H-3、 H-5均位于环糊精的空腔内，且H-3位于大口端，H-5位于小口端，可推断客体分子獐牙菜苦苷是通过β-CD的小口端进入环糊精空腔包合的，γ-CD的大口端进入环糊精空腔包合的。
表2中，HPβ-CD的变化为0.02～0.08ppm，TMβ-CD变化为0.05～0.09ppm。其中，HPβ-CD上的H-3变化了0.06ppm，而H-5变化了0.08ppm；TMβ-CD上的H-3变化了0.07ppm，而H-5变化了0.08ppm，据H-3、H-5均位于环糊精的空腔内，且H-3位于大口端，H-5位于小口端，可推断客体分子獐牙菜苦苷是通过HPβ-CD、TMβ-CD的小口端进入环糊精空腔包合的。
表2 HPβ-CD，TMβ-CD，獐牙菜苦苷/HPβ-CD，獐牙菜苦苷/TMβ-CD包合物的H1位移值(δ)
图5显示了药物獐牙菜苦苷与β-CD之间配位包合的ROESY二维谱图。从 ROESY谱图中可以看出，β-CD空腔内部的H-3和H-5质子与獐牙菜苦苷分子H-3,6位有NOE相关(相关峰A、B)。两个相关点表明，獐牙菜苦苷分子部分进入了β-CD空腔内。
图6显示了药物獐牙菜苦苷与γ-CD之间配位包结的ROESY二维谱图。图 7显示了药物獐牙菜苦苷与HPβ-CD之间配位包结的ROESY二维谱图。从 ROESY谱图中可以看出，γ-CD、HPβ-CD空腔内部的H-3和H-5质子与獐牙菜苦苷分子的H-3,6位质子有NOE相关(相关峰A、B)。从相关点表明，獐牙菜苦苷分子的部分进入了γ-CD、HPβ-CD空腔内。
综上述的核磁共振(1HNMR与2D NMR)分析，及主体-客体之间以1:1 化学计量配位包合，可推测出环糊精(β-CD、γ-CD、HPβ-CD和TMβ-CD) 与獐牙菜苦苷可能的包结模式如图8-1和8-2所示。
实施例7 X-射线粉末衍射(XRD)测定
XRD使用D/max-3B衍射仪；实验操作：Cu Kα(k＝1，5460A°)，40kV， 100mA，扫描范围为从2θ＝0.02°到2θ＝3°至50°，扫描速率5°/min。将待测的样品放在准备的样品台上，用称量纸等工具压匀实，然后进行测定，最后通过测量得到各物质的衍射图。
对獐牙菜苦苷、α-CD、β-CD、实施例1制备的獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物、实施例2制备的獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物以及对比例1制备的獐牙菜苦苷与α-CD的物理混合物、对比例2制备的獐牙菜苦苷与β-CD的物理混合物进行XRD测定，结果如图9所示；
对獐牙菜苦苷、HPβCD、TMβ-CD、实施例4制备的獐牙菜苦苷/HPβCD 的配位包合物、实施例5制备的獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物以及对比例4制备的獐牙菜苦苷与HPβ-CD的物理混合物、对比例5制备的獐牙菜苦苷与TMβ-CD的物理混合物进行XRD测定，结果如图10所示。
根据上述XRD测定结果比较药物、包合物及原环糊精晶型结构，验证包合物是否形成。
从图9中可以看出，獐牙菜苦苷(图9中的a)的衍射峰为晕模式、α-CD (图9中的b)具有明显的晶形特征，两者的物理混合物(图9中的c)为獐牙菜苦苷和α-环糊精的特征衍射峰的叠加，而獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物的衍射峰(图9中的d)为无定型，在2θ＝15°至25°处有较强的衍射峰，与晶态的獐牙菜苦苷、α-CD的形态、强度完全不同，说明了α-CD和獐牙菜苦苷形成包合物。另外β-CD(图9中的e)在2θ＝5°处有较强的衍射峰，两者的物理混合物(图9中的f)为獐牙菜苦苷和β-环糊精的特征衍射峰的叠加，且物理混合物的衍射峰与β-CD的角度2θ较有偏移，而獐牙菜苦苷/β-CD包合物的衍射峰(图9中的g)为有较强的衍射峰，且包合物的峰型与獐牙菜苦苷、β-CD 完全不同。
类似地，从图10中可以看出，HPβCD(图10中的b)为无定型，TM-β-CD (图10中的e)有明显的晶形结构，在2θ＝5°至10°有较强的衍射峰，它们的物理混合物(图10中的c、f)包合了獐牙菜苦苷和环糊精的特征衍射峰，配位包合物獐牙菜苦苷/HPβCD的粉末X-射线衍射(图10中的d)显示了无定型，但衍射峰的外形较物理混合的相似，这可能是因为HPβCD的空腔为骷髅状，表面有小孔，药物以扦插的形式形成包合物，衍射峰的强度较獐牙菜苦苷增强，角度2θ完全不同。同样，在獐牙菜苦苷/TMβ-CD包合物的衍射峰表现出TMβ-CD的峰型，与獐牙菜苦苷、TMβ-CD的衍射峰完全不同。另外在 2θ＝15°至20°处獐牙菜苦苷/HPβCD、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的衍射峰有相同的部分，这可能是因为客体药物相同或者是HPβCD与TMβ-CD的母体一样，药物进入空腔的方式一样导致的。
实施例8包合物的红外吸收光谱法(IR)
傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)可以定性测量药物的相互作用，因此在药物领域得到广泛应用，它是一种有效的包合物确认方法。实验具体操作：将待测样品置于红外灯下光照一段时间至样品干燥，用压片法将待测样品和 KBr混合制成薄透状片，进行测定(可扣除空气和KBr背景)。
獐牙菜苦苷、α-CD、β-CD、γ-CD、獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物、獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物以及獐牙菜苦苷/γ-CD的配位包合物的红外吸收如图11所示。
HPβCD、TM-β-CD，獐牙菜苦苷/HPβCD的配位包合物、獐牙菜苦苷/TM β-CD的配位包合物以及对比例4制备的獐牙菜苦苷/HPβCD的物理混合物、对比例5制备的獐牙菜苦苷/HPβCD的物理混合物的红外吸收如图12所示。
通过红外谱图来说明客体是否进入环糊精空腔及相互作，可据獐牙菜苦苷药物分子中的羰基特征基团，在1692cm-1附近伸缩振动的峰型及波速变化来说明。3412.04cm-1处为獐牙菜苦苷(图11a)的O-H的伸缩振动峰，1273cm-1处为C-O-C的伸缩振动峰。在配位包合物獐牙菜苦苷/α-CD、獐牙菜苦苷 /β-CD以及獐牙菜苦苷/γ-CD的红外谱图中，獐牙菜苦苷的特征峰不在能够全被识别，有部分重叠，1692cm-1处的C＝O峰强度大幅度降低。配位包合物獐牙菜苦苷/α-CD(图11e)的红外谱图中，獐牙菜苦苷药物分子中的羰基峰减弱，O-H峰变宽且由3412cm-1位移至3436cm-1左右。同样包合物獐牙菜苦苷/β-CD(图11f)和獐牙菜苦苷/γ-CD(图11g)的红外谱图中，也可看到这种现象。这也证明药物獐牙菜苦苷与环糊精(α-CD、β-CD、γ-CD)形成配位包合物。
类似地，在图12红外谱图中，物理混合为药物獐牙菜苦苷与环糊精的简单叠加，药物的羰基峰在包合物中减弱，O-H峰变宽且发生移动。总之，图11和图12中环糊精的O-H的伸缩振动峰基本上都发生了改变，说明了药物獐牙菜苦苷与环糊精形成配位包合物，羟基伸缩振动峰型发生变化可能是因为配位包合物形成后，环糊精分子中羟基的氢键受到破坏，这也说明药物獐牙菜苦苷分子嵌入环糊精分子空腔中，而不是简单的吸附过程。
实施例9扫描电镜(SEM)测定
扫描电镜(SEM)图通过FEI PHENO台式扫描电镜仪拍摄得到。测试条件：电压为20KV，分辨率500、700、1500、3000倍，甚至10000倍，对獐牙菜苦苷及獐牙菜苦苷/αCD的配位包合物、獐牙菜苦苷/βCD的配位包合物、獐牙菜苦苷/γCD的配位包合物、獐牙菜苦苷/HPβCD的配位包合物、獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物进行测试。
为了研究獐牙菜苦苷/环糊精配位包合物的晶体外表结构形态，通过扫描电子显微镜(SEM)进行观察研究，得到了扫描电镜图。从扫描电镜图13 中可以看出，α-CD为无规则的条状晶体(图13中的a)，药物獐牙菜苦苷结构显示出致密均匀的片状晶体(图13中的b)，獐牙菜苦苷/α-CD的物理混合物只是纯物质类似于獐牙菜苦苷和α-CD简单的堆积(图13中的c)；然而，獐牙菜苦苷/α-CD配位包合物为集状体，形貌结构发生了明显的变化 (图13中的d)，透露出药物獐牙菜苦苷与α-环糊精发生了相互作用。
从扫描电镜图14中可以看出，β-CD为块状晶体(图14中的a)，药物獐牙菜苦苷结构显示出致密均匀的片状晶体(图14中的b)，獐牙菜苦苷 /β-CD的物理混合物显示出药物与β-CD类似于纯物质间的相互混合(图14 中的c)；然而，獐牙菜苦苷/β-CD的配位包合物显示出无定形的块状结构，与獐牙菜苦苷、β-CD的形貌截然不同(图14中的d)，揭示药物獐牙菜苦苷与β-CD发生了相互作用。
γ-CD、獐牙菜苦苷、獐牙菜苦苷/γ-CD的物理混合无、獐牙菜苦苷/γ-CD 的配位包合物的电镜图如图15所示，从图中可以看出，γ-CD为大小空心球状晶体(图15中的a)，药物獐牙菜苦苷结构显示出致密均匀的片状晶体(图 15中的b)，獐牙菜苦苷/γ-CD的物理混合物显示出獐牙菜苦苷与小部分γ-CD 混合叠加(图15中的c)；值得一提的是獐牙菜苦苷/γ-CD的配位包合物呈现块状晶体，与獐牙菜苦苷或γ-CD的晶体外貌形态千差万别，由此说明药物獐牙菜苦苷与γ-CD发生了配位包合作用(图15中的d)。
同样地，从图16中可以看出，HPβ-CD显示出有空腔结构的骷颅状晶体 (图16中的a)，药物獐牙菜苦苷结构显示出致密均匀的片状晶体(图16 中的b)，獐牙菜苦苷/HPβ-CD的物理混合物显示出药物獐牙菜苦苷嵌于HPβ-CD的球状结构中，可观察到残留的HPβ-CD晶形和獐牙菜苦苷的聚集体(图16中的c)；獐牙菜苦苷/HPβCD的配位包合物呈现无规则的聚团状，类似麻花，说明药物獐牙菜苦苷与HPβ-CD发生配位包合作用后，晶体外表结构形态会发生很大的变化，在包合物的结构表面仍然保留着HPβ-CD特有的小孔外形，这可能是因为药物与环糊精形成包合物时，药物獐牙菜苦苷的片状结晶性可能降低(图16中的d)。
类似地，从图17中可以看出，TMβ-CD呈现带孔的片状结构(图17中的a)，药物獐牙菜苦苷结构显示出致密均匀的片状晶体(图17中的b)，獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物显示出无孔片状，较獐牙菜苦苷与 TMβ-CD的简单混合的结构形态发生很大的变化，这也揭示了獐牙菜苦苷与 TMβ-CD发生了包合作用(图17中的d)。
环糊精及其衍生物与獐牙菜苦苷配位包合后，包合物与药物客体或主体环糊精的结构形貌完全不同，不是两者的简单叠加，说明獐牙菜苦苷与环糊精及其衍生物形成包合物后，分子间的作用力使其结构上发生了某种程度上的重新排列，比起单一的獐牙菜苦苷化合物结构更为稳定。
实施例10水溶性实验
室温pH＝7.0的条件下，取过量獐牙菜苦苷及实施例1～5制备的配位包合物，分别加入2ml蒸馏水，避光涡旋一段时间后用0.45μml滤膜过滤除去未溶解物，减压旋蒸，得到黄色固体物，称量后，计算出各配位包合物与原药獐牙菜苦苷相比水溶性的增加量。
首先查得獐牙菜苦苷的溶解度：分别取适量的獐牙菜苦苷及其包合物溶于2ml的蒸馏水中，在25℃下放置24h，用微孔滤膜进行过滤、减压旋蒸。称重计算出獐牙菜苦苷溶解度为11.8mg/ml、獐牙菜苦苷/α-CD溶解度为50.2 mg/ml、獐牙菜苦苷/γ-CD溶解度为54.6mg/ml、獐牙菜苦苷/β-CD溶解度为 41.4mg/ml、獐牙菜苦苷/HP-β-CD溶解度为50.6mg/ml、獐牙菜苦苷 /TM-β-CD溶解度为41.2mg/ml。
其次将12.4mg獐牙菜苦苷/α-CD的配位包合物、19.5mg獐牙菜苦苷 /β-CD的配位包合物、17.3mg獐牙菜苦苷/γ-CD的配位包合物、19.7mg獐牙菜苦苷/HPβ-CD的配位包合物和23.3mg獐牙菜苦苷/TMβ-CD的配位包合物均溶解于2mL水中，室温搅拌2d，过滤蒸干，称重计算得到各配位包合物里獐牙菜苦苷的含量为1.07mg/mL、1.79mg/mL、1.52mg/mL、1.23mg/mL。与空白的獐牙菜苦苷相比，可知獐牙菜苦苷的溶解度得到提高。
实施例11稳定性试验测试
模拟人体肠液(pH＝7.6)和胃液(pH＝1.5)的环境下对獐牙菜苦苷、獐牙菜苦苷/α-CD、獐牙菜苦苷/γ-CD、獐牙菜苦苷/β-CD、獐牙菜苦苷/HP- β-CD、獐牙菜苦苷/TM-β-CD进行稳定性测试。取12个25mL棕色容量瓶，分别移取一定体积的獐牙菜苦苷及其配伍包合物加入容量瓶中，在其中10 个容量瓶中加入适量的环糊精，分别用体积比为1:4的乙醇和pH为1.5和 7.6的缓冲溶液定容，静止一段时间，待溶液稳定后在37℃水浴锅中恒温水浴1h于最大吸收波长下每隔12±2h对样品进行紫外跟踪测定。
由图18可知，獐牙菜苦苷在pH＝7.6下紫外吸收随着时间的增加而降低了约32.64％，在pH＝1.5降低了约11.97％，这表明在一定程度下MAA会慢慢分解且獐牙菜苦苷在酸性条件下比在碱性条件下稳定。其中獐牙菜苦苷 /α-CD包合物降低了16.08％(pH＝7.6)、4.43％(pH＝1.5)；獐牙菜苦苷/ γ-CD包合物降低了6.89％(pH＝7.6)、4.08％(pH＝1.5)，表明形成包合物后不管是在酸性还是碱性条件下獐牙菜苦苷的稳定性均有所提高。
分析图19可得，在40h的时候獐牙菜苦苷在酸性条件下开始缓慢分解，分解速度明显大于包合物的分解速度，经过对比发现獐牙菜苦苷/β-CD包合物不管是在酸性还是在碱性条件下都比獐牙菜苦苷/HP-β-CD、獐牙菜苦苷 /TM-β-CD包合物分解的要慢，表明獐牙菜苦苷/β-CD包合物比其衍生物形成的包合物要稳定。
实施例12紫外滴定试验
保持獐牙菜苦苷及其各配位包合物的浓度均为0.06mmol·L-1，按照表3 的浓度梯度依次配制CDS溶液，用溶剂为pH＝3.0的缓冲溶液与乙醇 (V/V＝4:1)定容，静置30min，开始测定吸光度，通过观察药液的吸光度随 CDS浓度的变化规律，得到主-客体包合物的紫外光谱图，所有实验平行测定3次。
表3紫外-可见光谱滴定中CDS在pH＝3.0条件下的浓度梯度
由非线性最小二乘法计算出pH＝3.0值下獐牙菜苦苷与CDS包合稳定常数以及Gibbs自由能变化，如表4所示。
图20(A～E)右上角插图为獐牙菜苦苷与CDS包结配位的曲线拟合结果，反映出实验值与理论值之间具有良好的线性关系，证实了獐牙菜苦苷与 CDS是按1:1进行包合的。
表4 獐牙菜苦苷与CDS形成包合物时稳定常数(Ks)、Gibbs自由能变化 (-ΔG°)
由以上实施例可知，本发明所述獐牙菜苦苷的配位包合物水溶性有显著提高，并且分子结构发生了改变，由于环糊精与药物包合后獐牙菜苦苷进入环糊精空腔内使得药物得以掩蔽，从而通过物理屏蔽作用有效掩盖了獐牙菜苦苷的苦味，并提高了其稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种獐牙菜苦苷的配位包合物，其特征在于，所述配位包合物的主体分子为环糊精或环糊精衍生物，客体分子为獐牙菜苦苷，所述主体分子与客体分子的化学计量比为1:1；
所述环糊精包括α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精；
所述环糊精衍生物包括2-羟丙基-β-环糊精或2,3,6-三甲基-β-环糊精；
所述獐牙菜苦苷的配位包合物的制备方法，包括以下步骤：
1）以乙醇溶解獐牙菜苦苷，得到獐牙菜苦苷乙醇溶液；步骤1）中，所述獐牙菜苦苷的质量与乙醇的体积之比为3.5~4mg：1.5~3ml；
2）向獐牙菜苦苷乙醇溶液中加水至浑浊后，加入环糊精或环糊精衍生物，得到预混合物；步骤2）中，所述预混合物中獐牙菜苦苷与环糊精或环糊精衍生物的摩尔比为1:1；
3）将所述预混合物避光搅拌，得到配位包合物混合物；步骤3）中，所述搅拌的时间为7d；所述搅拌的速率为800~1200rpm；
4）过滤所述配位包合物混合物，所得滤液进行干燥，得到獐牙菜苦苷的配位包合物；步骤4）中，所述过滤用微孔滤膜为0.45μm；步骤4）中，所述干燥依次包括蒸发干燥步骤和真空干燥步骤；所述蒸发干燥的温度为56℃；所述真空干燥的真空度为70~80MPa；所述真空干燥的温度为40~50℃；所述真空干燥的时间为20~28min。
2.权利要求1所述獐牙菜苦苷的配位包合物的制备方法，包括以下步骤：
1）以乙醇溶解獐牙菜苦苷，得到獐牙菜苦苷乙醇溶液；步骤1）中，所述獐牙菜苦苷的质量与乙醇的体积之比为3.5~4mg：1.5~3ml；
2）向獐牙菜苦苷乙醇溶液中加水至浑浊后，加入环糊精或环糊精衍生物，得到预混合物；步骤2）中，所述预混合物中獐牙菜苦苷与环糊精或环糊精衍生物的摩尔比为1:1；
3）将所述预混合物避光搅拌，得到配位包合物混合物；步骤3）中，所述搅拌的时间为7d；所述搅拌的速率为800~1200rpm；
4）过滤所述配位包合物混合物，所得滤液进行干燥，得到獐牙菜苦苷的配位包合物；步骤4）中，所述过滤用微孔滤膜为0.45μm；步骤4）中，所述干燥依次包括蒸发干燥步骤和真空干燥步骤；所述蒸发干燥的温度为56℃；所述真空干燥的真空度为70~80MPa；所述真空干燥的温度为40~50℃；所述真空干燥的时间为20~28min。
3.权利要求1所述獐牙菜苦苷的配位包合物或权利要求2所述方法制备得到的獐牙菜苦苷的配位包合物在制备水溶性药物中的应用。
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