CN109846872B

CN109846872B - 一种用于防治创伤后应激综合征的药物和功能性食品

Info

Publication number: CN109846872B
Application number: CN201711235555.4A
Authority: CN
Inventors: 陈建国; 吴鹏飞; 王芳; 关鑫磊; 沈祖成; 罗涵
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2037-11-30
Also published as: CN109846872A

Abstract

本发明公开了一种用于预防或/和治疗创伤后应激综合征的药物或功能性食品，由S‑甲基‑L‑半胱氨酸(硫甲基L型半胱氨酸)或硫甲基L型半胱氨酸的氨基酸盐和制药学上或食品工业上可接受的添加剂或/和载体组成，所述的S‑甲基‑L‑半胱氨酸可以由作为原料的富含S‑甲基‑L‑半胱氨酸的植物提取物提供。本发明药物或功能性食品通过降低体内氧化应激水平、减少自由基、增强相关脑区NMDA受体依赖的突触可塑性等特性，产生对创伤应激相关恐惧记忆的促消散作用，从而治疗创伤后应激带来的行为异常。

Description

一种用于防治创伤后应激综合征的药物和功能性食品

技术领域

本发明涉及一种氨基酸口服液的制备方法，及其在制备防治创伤后应激综合征的药物和功能性食品中的新用途。

背景技术

随着我国社会的发展和生活节奏的加快，如影随形的压力和应激已成为人们的烦恼之源。适度的应激有益机体产生适应压力源的耐受性和抵抗力，但突然面对严重的不可预测的应激状态则会引起很多人罹患精神疾病。创伤后应激障碍(posttraumatic stressdisorder,PTSD)是指个体经历、目睹或遭遇到一个或多个创伤性事件后所导致的个体延迟出现和持续存在的精神障碍，其核心症状包括：创伤性再体验症状、回避和麻木类症状、警觉性增高症状，严重损伤患者的身心健康和生活质量。PTSD的发病率报道不一，女性比男性更易发展为创伤后应激障碍。目前临床上对于PTSD的治疗和预防还缺乏有效手段。常用的治疗方法包括：心理治疗和药物治疗，首选治疗方法为SSRIs类抗抑郁药。由于PTSD一般在精神创伤性事件发生后数天至6个月内发病，若能在创伤事件发生后通过一些方式进行早期干预，将有助于预防高危人群发展成严重的PTSD。

现在很多医药公司和医院都在积极寻找治疗PTSD的有效药物。循证医学研究发现，创伤应激带来的强烈的恐惧记忆可能是PTSD发病的核心病理机制之一。恐惧是人类的基本情感之一，在人类适应和生存中具有重要作用，但是当人类或动物长期处于强烈的恐惧情绪状态中，则可能发展成焦虑症、恐惧症、创伤后应激障碍等相关情绪障碍。神经科学研究表明，杏仁核在条件恐惧记忆形成和引发条件恐惧反应中起促进作用，而促进杏仁核依赖的条件恐惧记忆的消退可能是PTSD治疗的关键。目前，临床和实验研究发现，通过药物分子如D-环丝氨酸等增强皮层-杏仁核环路NMDA受体依赖的突触可塑性长时程增强(LTP)会显著促进恐惧记忆的消散。

发明人的前期基础研究发现，条件性恐惧应激会刺激大鼠杏仁核脑区发生明显的氧化应激反应。在多数大鼠中，这种氧化应激水平的升高在一定时间后会被内源性的谷胱甘肽系统调节回正常水平。这些大鼠也表现出较好的恐惧记忆消散训练效果。但是，在一部分大鼠中，这种氧化应激水平会持续升高，这些大鼠的恐惧记忆消散训练效果会被明显抑制，提示我们：恢复杏仁核脑区的氧化应激稳态，可能对PTSD高发人群防治PTSD有重要意义。

S-甲基-L-半胱氨酸是一种在十字花科蔬菜如甘蓝、卷心菜等中富含的含硫氨基酸。已经报道其具有抗肿瘤、调节免疫及调节果蝇运动能力失衡等多种药理学作用，但关于其对精神疾病的预防治疗等方面的作用国内外尚无研究报道。发明人首次发现，S-甲基-L-半胱氨酸可以制备成一种新型的氨基酸口服液，通过降低创伤后应激引起的氧化应激升高，恢复氧化还原稳态，用于防治PTSD的发生。

突触传递是学习记忆功能最重要的神经生物学基础之一。突触传递效率在某些因素的作用下可出现不同程度的持续性上调或下调，称为突触可塑性。杏仁核脑区突触可塑性长时程增强(LTP)被认为是新的情感记忆形成的基础，也是近年来国际公认的创伤记忆消退的细胞生物学模型。本研究还发现，S-甲基-L-半胱氨酸作为一种天然含硫氨基酸，可以有效增强杏仁核区的LTP，是一种新型的突触可塑性调节剂。因此，其可以用于制备辅助改善学习记忆功能的新型药物，从而治疗PTSD。

饮食疗法在治疗和预防多种疾病中的重要作用已被越来越多的医学研究证明。由于PTSD一般在精神创伤性事件发生后数天至6个月内发病，若能在创伤事件发生后通过一些方式进行早期干预，预防高危人群发展成严重的PTSD，往往比治疗具有更大的意义。硫甲基L型半胱氨酸是一种在食物中发现的天然含硫氨基酸，具有极大的食用价值。本研究表明，S-甲基-L-半胱氨酸具有较低的毒性和较好的安全性。因此，本发明也提供了硫甲基L型半胱氨酸口服液用于制备预防PTSD的功能性食品中的新用途。

发明内容

本发明的任务是提供一种用于防治创伤后应激综合征的药物或功能性食品。

实现本发明的技术方案是：本发明提供的用于防治创伤后应激综合征的药物或功能性食品含有有效量的S-甲基-L-半胱氨酸(硫甲基L型半胱氨酸)或硫甲基 L型半胱氨酸的氨基酸盐，即本发明的技术方案是将S-甲基-L-半胱氨酸(硫甲基 L型半胱氨酸)或硫甲基L型半胱氨酸的氨基酸盐用来制备用于预防或/和治疗创伤后应激综合征的药物或功能性食品。

本发明提供的用于预防或/和治疗创伤后应激综合征的药物制剂或功能性食品，由S-甲基-L-半胱氨酸(硫甲基L型半胱氨酸)或硫甲基L型半胱氨酸的氨基酸盐和制药学上或食品工业上可接受的添加剂或/和载体组成；所述的制剂可以是为软胶囊、口服液等剂型；所述的S-甲基-L-半胱氨酸的浓度范围为0.01％-0.1％；所述的载体可以为溶剂，所述的溶剂是无菌超纯水、无菌生理盐水或食用油，如玉米油等。本发明可以使用富含S-甲基-L-半胱氨酸的植物提取物作为S-甲基-L- 半胱氨酸(硫甲基L型半胱氨酸)的来源，即可以直接使用富含S-甲基-L-半胱氨酸的植物提取物作为制备本发明药物或功能性食品的原料以提供所需要的S-甲基-L-半胱氨酸。

本发明提供的用于预防或/和治疗创伤后应激综合征的药物或功能性食品，可以制成口服液剂型，该口服液由S-甲基-L-半胱氨酸和溶剂组成，其中S-甲基 -L-半胱氨酸的浓度范围为0.01％-0.1％，即每1百毫升溶剂中含0.01至0.1克S- 甲基-L-半胱氨酸，所述的溶剂可以是无菌超纯水、无菌生理盐水或食用油。

本发明提供的用于预防或/和治疗创伤后应激综合征的药物或功能性食品，还可以是以上述的口服液为内容物的软胶囊。

本发明针对创伤后应激障碍(PTSD)治疗中的技术问题，提出S-甲基-L-半胱氨酸口服液在制备防治PTSD的药物及功能性食品中的应用。利用本研究发现的 S-甲基-L-半胱氨酸可增强脑内抗氧化能力、降低氧自由基、神经细胞死亡、调节突触可塑性等特性，用其制备的药物及功能性食品保护脑功能、缓解PTSD症状的发生。本发明中把S-甲基-L-半胱氨酸作为主要功效学成分制成氨基酸口服液，由此制得的药物及功能性食品可以用于PTSD治疗。本发明的实施也可采用临床可适用的任何药物剂型或食品形式，如包含有该口服液的软胶囊。可以单独使用，也可加入药用赋形剂或形成药用盐后使用。可以采用合适的药物释放系统以得到更有利的效果。

在脑内氧化应激平衡的调控过程，蛋氨酸亚砜还原酶A是恢复氧化还原稳态的重要分子，过表达蛋氨酸亚砜还原酶A可以显著降低多种神经细胞病理模型中的氧自由基水平，并还原已经发生的氧化损伤，重建氧化还原平衡。硫甲基L 型半胱氨酸作为一种蛋氨酸亚砜还原酶A的底物，既可以与氧自由基发生直接反应，其氧化产物可在蛋氨酸亚砜还原酶A的催化下还原，产生一种循环清除自由基的效果，又可以作为一种蛋氨酸亚砜还原酶A的功能增强剂。本发明人的实验证明，硫甲基L型半胱氨酸可以显著增加脑组织的抗氧化能力，并且降低了氧自由基在神经细胞中的积累。因此，增强机体对于氧自由基的清除作用是硫甲基L 型半胱氨酸作为神经保护药物的重要药理基础。

此外，由于硫甲基L型半胱氨酸具有和蛋氨酸类似的结构，可以有效减少蛋白质中蛋氨酸残基的氧化，从而减少关键蛋白质的氧化失活。本实验室的前期研究已经报道，蛋白质中蛋氨酸残基氧化引起的钙超载直接会导致NMDA受体依赖的突触可塑性损伤，因此，硫甲基L型半胱氨酸可能在氧化应激相关神经损伤中发挥钙拮抗剂的药理作用。因此，钙拮抗剂可能是硫甲基L型半胱氨酸作为神经保护药物的另一重要药理基础。

本发明人发现，用硫甲基L型半胱氨酸预处理人源性神经细胞株SH-SY5Y，可以剂量依赖性(200μM-5mM)的减少过氧化氢引起的细胞活性降低，可以剂量依赖性(200μM-5mM)的减少环境毒素MPP诱导的细胞活性降低，抑制神经细胞凋亡。由于氧化性损伤在糖皮质激素引起的神经细胞损伤中扮演了重要角色，说明硫甲基L型半胱氨酸在糖皮质激素相关神经损伤的治疗中有应用价值，可以用于制备治疗糖皮质激素相关障碍性疾病的的神经保护剂及功能性食品。

本发明人发现，用硫甲基L型半胱氨酸处理大鼠脑片，可以剂量依赖性(200 μM-1mM)的增强大鼠脑组织杏仁核区突触可塑性。由于杏仁核脑区突触可塑性LTP被认为是新的情感记忆形成的基础，也是近年来国际公认的创伤记忆消退的细胞生物学模型。我们的研究提示硫甲基L型半胱氨酸可以增强LTP，可以用于制备预防治疗多种创伤性应激障碍疾病的功能性食品。

本发明人发现，用不同浓度(0.1-100mM)硫甲基L型半胱氨酸孵育人源性神经细胞株SH-SY5Y 72h不会引起细胞活性下降，没有细胞毒性。小鼠急性灌胃硫甲基L型半胱氨酸口服液(2000mg/kg)，观察两周未见急性毒性作用。我们的研究显示硫甲基L型半胱氨酸在制备神经保护剂药物、药物组合物或功能性食品中的广泛用途。

本发明的特征可用参考以下实施例进行进一步描述，但这些实施例不应认为是任何对于本发明的限制范围。

附图说明

图1SMLC增强了脑组织的抗氧化能力。图1反映的是不同浓度SMLC加到脑组织匀浆液后，对脑组织总抗氧化能力的影响。图中,1代表的是正常脑组织匀浆液清除过氧化氢的能力；2代表的是加入了抗氧剂Trolox(62.5μM)后的脑组织匀浆液清除过氧化氢的能力；3代表的是加入了SMLC(1mM)后的脑组织匀浆液清除过氧化氢的能力；4代表的是加入了SMLC(0.5mM)后的脑组织匀浆液清除过氧化氢的能力。

图2SMLC减少了ROS在神经细胞中的积累。图2反映的是不同浓度的 SMLC预处理后的人源性神经细胞株(SH-SY5Y)，减少了其中ROS的积累。图中,1代表的是未加过氧化氢处理的正常SH-SY5Y细胞；2代表的是用100μM 过氧化氢处理1h后的SH-SY5Y细胞；3代表的是用SMLC(0.5mM)和100μ M过氧化氢共处理1h后的SH-SY5Y细胞；4代表的是用SMLC(1mM)和100 μM过氧化氢共处理1h后的SH-SY5Y细胞。

图3SMLC减少了过氧化氢引起的神经细胞损伤。图3反映的是不同浓度的SMLC预处理后的人源性神经细胞株(SH-SY5Y)，对过氧化氢引起的细胞损伤有更强的耐受。图中，1：代表正常SH-SY5Y神经细胞的细胞存活率；2：代表过氧化氢(250μM)造模处理12h后模型组的细胞存活率；3：代表SMLC(1 mM)处理后加过氧化氢(250μM)造模后的细胞存活率；4：代表SMLC(0.5 mM)处理后加过氧化氢(250μM)造模后的细胞存活率；5：代表SMLC(0.1 mM)处理后加过氧化氢(250μM)造模后的细胞存活率；6：代表SMLC(0.05 mM)处理后加过氧化氢(250μM)造模后的细胞存活率。

图4SMLC增强了海马区的突触可塑性。图4反映的是不同浓度的SMLC 预处理后的大鼠脑片，其突触可塑性长时程增强的提高。图中，1:代表正常大鼠 (3个月)BLA区突触可塑性长时程增强LTP的水平；2：代表SMLC(100μ M)处理15分钟后，正常大鼠(3个月)BLA区突触可塑性长时程增强LTP的水平；3：代表SMLC(500μM)处理15分钟后，正常大鼠(3个月)BLA区突触可塑性长时程增强LTP的水平。

具体实施方式

实施例1 SMLC增强了脑组织的抗氧化能力

鲁米诺反应用于检测脑组织的总抗氧化能力。我们采用脑组织-过氧化氢- 鲁米诺发光体系，观察在脑组织中一些酶的催化下，过氧化氢和鲁米诺反应产生的化学发光。过氧化氢购自Merck公司。鲁米诺、SMLC及Trolox等药品购自 Sigma公司，纯度>99％。检测仪器为Bayer Centaur 240全自动化学发光仪，在测定管中依次加入0.1mol/L PBS 135μL、5mmol/L鲁米诺15μL、大鼠海马组织提取液上清10μL，加入20μL不同浓度的SMLC供试液(5mM,1mM)或阳性对照强抗氧化剂Trolox(62.5μM)，混匀后置于仪器中于37℃加入过氧化氢(100mM) 20μL启动反应，延时2s后，测定10分钟内每隔30s的发光强度，每种样品平行测定3次，其发光强度的消减速率反映了脑组织的总抗氧化能力。如附图1 中所反映的，终浓度1mM和0.5mM SMLC加速了过氧化氢鲁米诺发光强度的消减速率，显著增强了体系的抗氧化能力。

实施例2 SMLC减少了ROS在神经细胞中的积累

利用荧光探针DCFH-DA进行神经细胞株SH-SY5Y内ROS的检测。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的脂酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被负载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF的荧光代表了细胞内的活性氧水平。人源性神经母瘤细胞株SH-SY5Y用含15％胎牛血清的DMEM培养基培养于37摄氏度5％CO2培养箱。每3-5天传代一次。实验前将SH-SY5Y种到6 孔板中。使用不同药物浓度的SMLC(0mM,0.5mM,1mM)处理的神经细胞株 SH-SY5Y，培养24小时后，加入过氧化氢250μM处理1小时，去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的10μM DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为宜。 37℃孵育30min后，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。DCF的荧光强度用Leica荧光显微镜观察拍照比较。使用不加药物和过氧化氢处理的SH-SY5Y为空白对照。如附图2反映的是，0.5mM和1mM的 SMLC处理的神经细胞株SH-SY5Y，加入过氧化氢250μM处理1小时后，其胞内DCF的荧光水平显著低于未加药物的过氧化氢处理细胞组。

实施例3 SMLC减少了过氧化氢引起的神经细胞损伤

人源性神经母瘤细胞株SH-SY5Y用含15％胎牛血清的DMEM培养基培养于37摄氏度5％CO2培养箱。每3-5天传代一次。实验前将SH-SY5Y种到96 孔板里。使用过氧化氢250μM处理12小时造氧化应激损伤细胞模型。SMLC (1mM和0.5mM)于过氧化氢加入前2小时加入培养基，并一直保持到实验结束。实验结束后使用MTT检测细胞活性。各孔吸除孔内培养上清液，加入含有0.5mg/ml MTT的无血清细胞培养液200ul继续孵育4小时，终止培养，吸除孔内培养上清液，每孔加100μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解后立即进行比色，测定波长为570nm，在酶标仪上测定各孔吸光度即OD值。检测孔 OD值减去空白孔调零孔OD值即为检测孔实际OD值。结果参见附图3，使用 SMLC(1mM、0.5mM)处理后的SH-SY5Y对于氧化引起的细胞损伤有明显的保护效果。

实施例4 SMLC增强了大鼠海马区的突触可塑性(长时程增强)

配制人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mM)：NaCl 119；KCl 3.5；NaH2PO4.2H2O 1；MgSO4.7H2O 1.3；CaCl2 2.5；glucose 10；NaHCO3 26。实验选择SD大鼠，剪断其头部，迅速将头部的颈侧(断口处)浸泡于0℃左右的ACSF中，约10s后取出，从嗅球端头颅骨横状面横剪(与断头面平行)，然后沿头颅两侧(冠状面)分别剪开头颅骨，用镊子夹住嗅球处的头颅骨将整个头颅盖翻开并将整个大脑半球取出，迅速浸泡于在-80℃低温冰箱中冰冻过的 ACSF中1～2min。然后取出大脑，502胶均匀涂于切片机托板(用于放置脑组织) 底座，其中脑干面紧靠琼脂块，以防脑片在切片过程中倾斜或者变形。用振动切片机沿冠状面切取厚度为400μm的脑片。切好的脑片转移至孵育槽，用配好的 ACSF孵育1～2h后用于实验。将记录电极插入锥体细胞树突层100～200μm处，记录BLA区锥体细胞的场兴奋性突触后电位(fEPSP)。刺激电极和记录电极间距在显微镜下约为0.3～0.5cm。由小至大调节输出电压幅度(1.5V～6V)，记录出幅度由小变大的fEPSP。输出TEST单刺激，每30s刺激一次标本，记录基础 fEPSP曲线，作为平均的基值(100％)。TEST刺激(一般使用电压刺激，性质为连续单刺激)设置参数如下：幅度大小以能引起最大fEPSP的30％～40％为准，波宽0.1ms，延时40ms，刺激频率0.033Hz。基础fEPSP记录稳定超过20min 后，给予高频刺激，然后继续用TEST刺激方式刺激记录fEPSP(每30s刺激一次)。观察fEPSP幅度和斜率变化，如增加20％，持续30min以上，视为LTP 诱发成功。LTP计算方法：将HFS后30～60min的fEPSP斜率叠加平均值与HFS 前fEPSP斜率均值的比值计为LTP的幅度。LTP由高频强直刺激诱导，强直刺激为3串，间隔30s，每串由100Hz，100个脉冲的刺激组成。结果如附图4所示，用SMLC(100μM；500μM)在高频刺激前15min循环孵育脑片，不影响基础突触传递，但能增强BLA区高频刺激诱发的LTP，这种效应至少可持续60 min。

实施例5氨基酸口服液的制备方法

配方:SMLC 1g,加入无菌生理盐水1000ml，搅拌溶解，加蔗糖适量，加枸橼酸和枸橼酸钠调节PH至6.8。搅拌均匀,过滤后分装，灭菌、印字、包装后低温保存(4度)。建议剂量：成年人40-50ml/天。

Claims

1.S-甲基-L-半胱氨酸在制备用于预防或/和治疗创伤后应激综合征的药物中的应用。