CN109843077A - 动物饲料和提供此类饲料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体和一种或多种C1‑C16有机酸的新型动物饲料。本发明还涉及包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体和一种或多种C1‑C16有机酸的组合物、相应的试剂盒、通过向动物提供包括巴西蘑菇菌丝体和一种或多种C1‑C16有机酸的饲料来饲喂动物的方法，以及通过将巴西蘑菇菌丝体和一种或多种C1‑C16有机酸与蛋白质和/或碳水化合物和/或脂肪混合以提供饲料来提供动物饲料的方法。
Description
技术领域
本发明总体涉及动物饲料。
背景技术
动物饲料用于支持动物的正常代谢，以便使这些动物保持健康并发育其全部能力。特别是对于食用动物而言，饲料最佳地支持它们的健康是非常重要的，因为这通常反应在它们的性能中，该性能通过确定动物的日均体重增加、其在屠宰年龄时的体重或其屠宰重量时的年龄来测量。特别是，在培养食用动物中，非常注意在特定生产地点保持的一组动物中控制细菌的传播。特别是因为这种细菌可能对动物本身具有致病性(感染从而降低动物的健康状况并因此降低其性能)，或者也可能对动物的食用者(人或其他动物)具有致病性。减少细菌传播的常用方法是使用抗生素和/或给动物接种疫苗。使用的另一种方法是对动物进行防护(隔离)，结合对其饲料进行灭菌。然而，由于涉及高成本，该方法不适于为食用目的培养动物。
发明目的
本发明的目的是提供一种动物饲料，其特别适于改善动物健康，优选减少或减轻普遍存在的病原菌如属于肠杆菌科的细菌感染，特别是沙门氏菌属和埃希氏菌属的感染。
发明内容
为了实现本发明的目的，已经设计了一种动物饲料，其包括巴西蘑菇(AgaricusBlazei Murril)(ABM)菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸。巴西蘑菇(Agaricus BlazeiMurril)也称为巴西菇(Agaricus Blazei Brasiliensis)、姬松茸(Agaricussubrufescens)或小松菇(Agaricus rufotegulis)。目前，认为姬松茸是正确的名称；然而，在本申请中，将使用更常见的名称巴西蘑菇。在下文中，缩写ABM和术语巴西蘑菇可互换使用。
令人惊讶地发现，当给动物饲喂包括ABM菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸(即，具有酸性性质的有机化合物(关于有机化合物的定义参见Nomenclature of OrganicChemistry:IUPAC Recommendations and Preferred Names 2013,作者Henri A Favre,Warren H Powell,第P-1章:P-10介绍)，特别是具有至少一个羧基的烃，以及有机化合物的盐和其酯(因为已知这两种形式都能够在饲料原料中释放实际的有机酸))的饲料时，可以显著改善动物的一般健康状况，因此改善动物的生长性能。特别是，发现属于肠杆菌科的群体的病原菌的建群可能减少，显示为动物粪便中存在较少的细菌。这本质上意味着细菌向其他动物的传播也减少了。其原因不是100％明确的。应注意，从WO2013/171194中已知施用巴西蘑菇菌丝体给予产蛋鸡。据描述，饲料中ABM菌丝体的存在改善了产蛋和任选地蛋壳质量和产蛋期。在本领域中，还已知使用C1-C16有机酸作为饲料防腐剂，即减少饲料本身的微生物生长(在贮存饲料期间)。关于这些酸对宿主动物感染后病原体生长的影响知之甚少，更不用说当同时在饲料中使用ABM菌丝体(单独或混合到相同饲料组合物中)的综合效果
应注意，ABM菌丝体和有机酸不需要同时存在于相同的饲料中。必要的是，动物摄入的各种饲料组分(固体饲料、饮用水等)作为整体包括两种成分，使得至少在胃肠道中两种成分组合并根据本发明起作用。
作为饲料防腐剂，通常使用脂肪酸，即包括烃链和至少一个末端羧基的任何酸。特别是，通常应用短链C1-C7酸，比如甲酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、苯甲酸和山梨酸，还使用C7-C16中链脂肪酸，比如辛酸、癸酸、月桂酸和棕榈酸。相同的酸可以单独或以并入各种短链和/或中链酸的混合物应用于本发明中。
本发明还涉及包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸的组合物。此类组合物可以用于与营养成分混合以提供符合本发明的动物饲料，或者例如单独饲喂，例如与饮用水混合(与实际饲料分开)，使得其被动物摄取并与动物胃肠道中的饲料组合。本发明还涉及一种试剂盒(kit-of-parts)，该试剂盒包括第一构成部分和第二构成部分，该第一构成部分包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体，该第二构成部分包括一种或多种C1-C16有机酸，并且该试剂盒任选地包括将试剂盒的这两个部分口服施用给动物的说明。应注意，为了本发明的意义，这些部分不需要存在于一个单个容器中。可预见的是，这些部分在分开的容器中提供，不是包装在一起的，但是明确意图是根据本发明的教导进行使用(例如通过在网站上提供的指示、单独的说明书等)，例如，通过将一个或两个部分添加到动物饲料中，和/或将一个或两个部分添加到与其饲料一起提供给动物的饮用水中。
本发明还实现了通过向动物提供包括巴西蘑菇菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸的饲料来饲喂动物的方法。这可以例如通过使动物饲料中存在两种成分，或通过用包括ABM菌丝体的第一物质和包括有机酸的第二物质(例如存在酸的饮用水)饲喂动物来实现。本发明还实现了通过将巴西蘑菇菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸与蛋白质和/或碳水化合物和/或脂肪混合以提供饲料来提供动物饲料的方法。
定义
动物饲料是包括比如脂肪和/或蛋白质和/或碳水化合物的动物营养物质的组合物，其被饲喂给动物以提供于其代谢需求。动物饲料可以是营养完全饲料(即，提供所有所需营养物质以支持动物的正常代谢)，但它也可以是仅含有部分所需营养物质的预混物或其他组合物，其将与其他营养物质混合或与这些其他营养物质分开饲喂。
饲料的每日总摄入量是动物每天摄入的完整饲料质量，不包括饮用水。
具体实施方式
在根据本发明的饲料的第一实施方式中，ABM菌丝体的存在量为0.01kg至10kg/吨每日饲料总摄入量。换句话说，饲喂动物的饲料总量(不包括饮用水)包括每1000千克，0.01kg至10kg的ABM菌丝体。该量可以照此以0.01kg至10kg/吨该饲料原料的水平存在于营养完全饲料中，或者可以例如存在于浓缩的饲料原料中(超过10kg/吨饲料原料)，只要该量/每日饲料总摄入量在0.01kg和10kgABM菌丝体/吨之间即可。特别是，饲喂ABM菌丝体的量为0.05kg至2kg/吨每日饲料总摄入量。这些量看起来足以用于根据本发明的用途。
在进一步的实施方式中，一种或多种C1-C16酸的存在量为0.1kg至10kg/吨每日饲料总摄入量，特别是其存在量为0.5kg至6kg/吨每日饲料总摄入量。
在又另一个实施方式中，ABM菌丝体在谷物基质上生长，特别是黑麦(rye)(黑麦(Secale cereal))或小米(millet)(黍稷(Panicum miliaceum))基质。在进一步的实施方式中，将其上生长有菌丝体的谷物基质掺入动物饲料中。这看起来是提供动物饲料的便利方法。特别地，ABM菌丝体在谷物基质上生长，直到菌丝体的量为谷物和菌丝体混合物干重的至少10％(w/w)。低于该水平，需要将相对高量的谷物基质与其他营养组分混合，以便提供足够的经济效果。优选ABM菌丝体在谷物基质上生长，直到菌丝体的量在谷物和菌丝体混合物干重的10％和20％(w/w)之间。
在另一个实施方式中，一种或多种酸选自C1-C16脂肪族酸，特别是C1-C7短链酸和/或C8-C16中链酸。
在又另一个实施方式中，动物饲料是营养不完全的，例如因为动物饲料作为所谓的预混物提供(将与其他饲料原料混合)。因此，为了生产更完全的动物饲料，营养不完全动物饲料必须与一种或多种其他营养组分(比如例如蛋白质和/或碳水化合物和/或脂肪)混合。
本发明进一步涉及本发明组合物对抗肠杆菌科的抗性细菌，特别是沙门氏菌和/或埃希氏菌的用途。术语“抗性细菌”意为对常规抗生素具有抗性的细菌。此类抗性细菌的示例包括抗头孢噻肟大肠杆菌(Escherichia Coli)、抗碳青霉烯肠杆菌和产超广谱β内酰胺酶的大肠杆菌(产ESBL的大肠杆菌)。优选地，本发明涉及本发明组合物在动物饲料中对抗肠杆菌科的抗性细菌(特别是沙门氏菌和/或埃希氏菌)的用途。
实施例
实施例1描述了用于评估抗微生物剂对细菌生长的影响的体外模型研究。
实施例2描述了用于评估ABM菌丝体与有机酸组合对细菌脱落的影响的体内研究。
实施例3描述了用于评估ABM菌丝体与有机酸组合对细菌脱落的影响的第二种体内研究。
实施例4描述了用于评估ABM菌丝体与有机酸组合对细菌脱落的影响的体内研究
实施例5描述了评估沙门氏菌传播的肉鸡的体内研究。
图1显示了ABM菌丝体与有机酸组合对沙门氏菌脱落的影响。
图2显示了ABM菌丝体与有机酸组合对腹泻的影响。
图3显示了ABM菌丝体与有机酸组合对饲料摄入量的影响。
图4显示了ABM菌丝体与有机酸组合对饲料功效的影响。
图5显示了在进一步的体内研究中ABM菌丝体与有机酸组合对肠杆菌脱落的影响。
实施例1
实施例1描述了用于评估ABM菌丝体对细菌粘附的影响的体外模型研究。在该方法中，评估了鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)对ABM菌丝体的粘附。
使用96孔板，其上涂布ABM菌丝体。为此，将ABM菌丝体(在本例和以下每例中实际使用发酵黑麦产品，其产品中ABM菌丝体的量为约15％w/w)悬浮于PBS中至最终浓度为1％(w/v)并彻底混合。随后将悬浮液离心以除去不溶物质。此后，将上清液用于涂布微量滴定板的孔。为了粘附性评估，将鼠伤寒沙门氏菌悬浮液加入微量滴定板。然后将板孵育30分钟，并且在该孵育步骤后用PBS洗涤。随后将生长培养基加入孔，并测定达到开始(onset)OD600值的时间。使用光密度(OD)测量作为工具来比较96孔板的用不同化合物涂布的孔的粘附细菌的数量。粘附细菌的初始细胞密度与通过光密度测量对生长的时间依赖性检测相关。达到初始OD600值的时间越短表示细菌对基质越粘附，因此预期更高的体内生长的减少。
鼠伤寒沙门氏菌试验的结果显示，与对照(仅PBS)相比，达到初始OD600的平均时间为4.9小时(±0.3h)，而对照的达到初始OD600的平均时间为7.3小时(±0.1小时)。猜测对粘附具有潜在作用的约20种其他化合物(本实施例中未示出的化合物)显示达到初始OD600的平均时间通常在5小时和8.5小时之间。
在第二个体外研究中，重复试验，并另外测量了对肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)和大肠杆菌的影响。而且，ABM菌丝体的量以全量(参见上文；表示为“100％”)、该量的一半(“50％”)和该量的四分之一(“25％)”使用。结果表示在此处下表1中。
表1.通过测量达到初始OD600的时间(以小时计)，各种量的ABM菌丝体对各种肠杆菌的粘附的影响。
| 化合物 | 鼠伤寒沙门氏菌 | 肠炎沙门氏菌 | 大肠杆菌 |
| 对照 | 7.0 | 6.3 | 7.1 |
| ABM 100％ | 6.0 | 5.5 | 5.7 |
| ABM 50％ | 5.7 | 5.5 | 5.9 |
| ABM 25％ | 5.7 | 5.5 | 6.4 |
从模型研究中看出，ABM菌丝体对各种肠杆菌的粘附有显著影响。该影响看起来与细菌的类型无关，尽管事实为特别是埃希氏菌是与沙门氏菌完全不同的种类。如此来看ABM菌丝体的量对于获得粘附效果并不是关键的。
实施例2
实施例2描述了用于评估ABM菌丝体与有机酸组合对细菌脱落的影响的体内研究。在该研究中，评估了体外观察到的效果(参见实施例1)是否确实对应于体内细菌脱落。特别是，评估了是否通过在猪的饲料中引入ABM菌丝体，在本例中与有机酸共混物组合，可以减少活细菌的脱落。作为对照，使用利用常规饲料的阴性对照，并且作为阳性对照的是具有添加的丁酸盐、在家禽饲料中商业使用以减少细菌脱落的特定的短链脂肪酸的相同饲料。有机酸共混物是常规的C1-C16有机酸共混物，含有甲酸和乳酸的组合，每100kg加入4升。
共使用了24只Topi*Hypor公猪仔猪。研究中仅包括未接受抗生素且沙门氏菌阴性的健康雄性动物(通过定性检查粪便确定)。通过单独编号的耳标识别动物。按重量和窝(litter)将动物分成三个处理组(每组8只动物)。
在断奶(24天龄+/-3天)后直接将仔猪单独圈养在含有新的条缝地板的围栏(0.8×1.6m)中。断奶后的第一个24小时，提供持续光照，之后是16小时光照和8小时黑暗。仔猪随意接受饲料和饮用水。在整个研究期间(从断奶到研究结束)如下表2中所示在饲料中施用不同的处理。
表2饲料处理
| 处理 | 动物的数量 | 添加剂 | 内含物水平 |
| 阴性对照 | 8 | - | - |
| 丁酸盐 | 8 | 丁酸盐+酸共混物 | 6kg/吨+4L/吨 |
| ABM菌丝体 | 8 | ABM+酸共混物 | 2kg/吨+4L/吨 |
10天后，使仔猪经口感染通过含有1ml 1×109cfu/ml的预接种饲料基质给予的鼠伤寒沙门氏菌(在BHI培养基中)。连续7天以这种方式进行经口感染。
在沙门氏菌感染后第1、2、3、4和7天进行粪便取样。将样品储存在4度并在第二天进行分析。将样品稀释并在含有新生霉素的BPW中均质化。制备系列稀释液并将其涂在选择性显色琼脂板上，并在37℃孵育过夜。计数典型的沙门氏菌菌落并计算量(cfu/克)。在每个样品中，针对沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌两者通过qPCR确认了两种推定的沙门氏菌菌落。当在最低稀释板中未观察到菌落时，在通过常规MSRV/XLD方法预富集后筛选样品的沙门氏菌存在(定性)。
结果如图1所示，其显示ABM菌丝体与有机酸组合对沙门氏菌脱落的影响。看起来ABM菌丝体和有机酸的组合确实对活沙门氏菌细菌的脱落具有显著影响。特别是，与丁酸盐(家禽中用于该目的的化合物)相比，效果非常大。因此也清楚的是，体外模型(实施例1)可预测细菌脱落的体内减少。
图2显示了对腹泻的影响。从断奶后第3天开始每天进行粪便评分直至研究结束。腹泻评分测定为：0＝正常粪便；1＝扁平粪便；2＝湿粪便；3＝水样粪便。如图2所描绘的结果显示ABM菌丝体使腹泻显著减少。
为了评估性能，每天检查仔猪。在断奶、感染前和感染后第7、14和21天(第0、10、17、24和31天)测定体重和饲料摄入量。饲料功效测定为克生长/克饲料摄入量。
图3显示了ABM菌丝体与有机酸组合对饲料摄入量的影响。图4显示了ABM菌丝体与有机酸组合对饲料功效的影响。结果表明，由于饲料中存在ABM菌丝体，对性能有显著的积极影响。
实施例3
实施例3描述了用于评估ABM菌丝体与有机酸组合对细菌脱落的影响的第二种体内研究。在该研究中，作为阳性对照，使用酸共混物本身(因此没有ABM菌丝体)。
共使用36只Topi*Hypor公猪仔猪。研究中仅包括未接受抗生素且沙门氏菌阴性的健康雄性动物(通过定性检查粪便确定)。通过单独编号的耳标识别动物。按重量和窝将动物分成三组(每组12只动物)。
在断奶(24天龄+/-3天)后，直接将仔猪单独圈养在含有新的条缝地板的围栏(0.8×0.8m)中。断奶后的第一个24小时，提供持续光照，之后是16小时光照和8小时黑暗。仔猪随意接受饲料和饮用水。在整个研究期间(从断奶到研究结束)如下表3中所示在饲料中施用不同的处理。
表3饲料处理
| 处理 | 动物的数量 | 酸共混物 | ABM |
| 阴性对照 | 12 | 无 | - |
| 酸共混物 | 12 | 4L/吨 | - |
| 酸共混物+ABM菌丝体 | 12 | 4L/吨 | 2kg/吨 |
8天后，使仔猪经口感染通过含有1ml 1×109cfu/ml的预接种饲料基质给予的鼠伤寒沙门氏菌(在BHI培养基中)。连续7天以这种方式进行经口感染。
在沙门氏菌感染后第1、2、3、4和5天进行粪便取样。将样品储存在4度并在第二天进行分析。将样品稀释并在含有新生霉素的BPW中均质化。制备系列稀释液并将其涂在选择性显色琼脂板上，并在37℃孵育过夜。计数典型的沙门氏菌菌落并计算量(cfu/克)。在每个样品中，针对沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌两者通过qPCR确认了两种推定的沙门氏菌菌落。当在最低稀释板中未观察到菌落时，在通过常规MSRV/XLD方法预富集后筛选样品的沙门氏菌存在(定性)。结果表示在图5中，并对应于图1中所示的结果。
重复上述体内实验以评估猪大肠杆菌脱落的影响。该实验与上文所述的沙门氏菌实验相对应进行，每组使用10只动物。结果显示，在人工大肠杆菌感染当天，没有动物的粪便呈大肠杆菌阳性。在第12天，每组中超过70％的动物是阳性的。两天后，在两个对照组(阴性对照和酸共混物组)中，阳性动物的百分比为60％，而在ABM组中，根本没有脱落物(0％的动物检测为大肠杆菌阳性)存在。
实施例4
根据实施例2中描述的方案进行体内研究，只是每个处理组使用12只动物并且基于抗头孢噻肟大肠杆菌的存在选择仔猪；5天后，使选择的动物感染肠炎沙门氏菌。在该研究中，针对黑麦上的ABM菌丝体和针对50:50的黑麦上的ABM菌丝体与β-1,4-甘露二糖的组合的抗头孢噻肟大肠杆菌脱落。有机酸共混物为含有甲酸和乳酸的组合的常规C1-C16有机酸共混物。所有实验中试剂的总量相同。
用抗头孢噻肟大肠杆菌进行试验的结果显示在下表中。
表4.通过在头4天内和16天内的测量，黑麦上的ABM菌丝体和β-1,4-甘露二糖对抗头孢噻肟大肠杆菌脱落的影响
该研究显示，含有或不含β-1,4-甘露二糖的黑麦上的ABM菌丝体对抗头孢噻肟大肠杆菌的粘附有显著影响。单独的酸共混物不能显著降低抗头孢噻肟大肠杆菌的粘附性。
实施例5
使用两个组进行体内研究，每个组包括具有30只禽类的6个重复栏。每栏中的三只禽类(种禽)被肠炎沙门氏菌感染。在42天内给肉鸡饲喂常规的肉鸡日粮。一组肉鸡用黑麦上的ABM菌丝体和有机酸共混物处理。有机酸共混物为含有甲酸和乳酸的组合的常规C1-C16有机酸共混物。通过测定28天和42天后感染或阳性禽类的数量，确定沙门氏菌向非种禽的传播。
28天后，对照(未处理)组包括83％的感染禽类，而处理组含有55％的感染禽类。42天后，在对照组中60％的禽类感染，并且在处理组中35％的阳性禽类。这清楚地表明该处理有助于防范肉鸡中的沙门氏菌。
Claims (17)
1.动物饲料，所述动物饲料包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸。
2.根据权利要求1所述的动物饲料，其特征在于，所述ABM菌丝体的存在量为0.01kg至10kg/吨每日饲料总摄入量。
3.根据权利要求2所述的动物饲料，其特征在于，所述ABM菌丝体的存在量为0.05kg至2kg/吨每日饲料总摄入量。
4.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其特征在于，所述一种或多种C1-C16酸的存在量为0.1kg至10kg/吨每日饲料总摄入量。
5.根据权利要求4所述的动物饲料，其特征在于，所述一种或多种C1-C16酸的存在量为0.5kg至6kg/吨每日饲料总摄入量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其特征在于，所述ABM菌丝体生长在谷物基质上，特别是黑麦或小米基质上。
7.根据权利要求6所述的动物饲料，其特征在于，将其上生长有菌丝体的所述谷物基质掺入所述饲料中。
8.根据权利要求7所述的动物饲料，其特征在于，所述ABM菌丝体在所述基质上生长，直到菌丝体的量为谷物和菌丝体混合物干重的至少10％(w/w)。
9.根据权利要求8所述的动物饲料，其特征在于，所述ABM菌丝体在所述基质上生长，直到菌丝体的量在所述谷物基质总质量的10％和20％(w/w)之间。
10.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其特征在于，所述一种或多种酸选自C1-C16脂肪族酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其特征在于，所述一种或多种酸选自C1-C7脂肪族酸。
12.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其特征在于，所述一种或多种酸选自C8-C16脂肪族酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其特征在于，所述动物饲料营养不完全。
14.组合物，所述组合物包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸。
15.试剂盒，所述试剂盒包括第一构成部分和第二构成部分，所述第一构成部分包括巴西蘑菇(ABM)菌丝体，所述第二构成部分包括一种或多种C1-C16有机酸，并且任选地包括将这两个部分口服施用给动物的说明。
16.通过向动物提供饲料来饲喂动物的方法，所述饲料包括巴西蘑菇菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸。
17.提供动物饲料的方法，所述方法通过将巴西蘑菇菌丝体和一种或多种C1-C16有机酸与蛋白质和/或碳水化合物和/或脂肪混合来提供所述饲料。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190604 |
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