ES2875582T3

ES2875582T3 - Aditivo para alimento para animales y alimento para animales que lo comprenden

Info

Publication number: ES2875582T3
Application number: ES17781560T
Authority: ES
Inventors: Van Den Hil Petra Johanna Roubos; Mark Bouwens
Original assignee: Nutreco IP Assets BV
Current assignee: Nutreco IP Assets BV
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2021-11-10
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: EP3503738B1; CN109922666A; PH12019500340A1; BR112019003779A2; EP3503738A1; CA3034376A1; WO2018038616A1; DK3503738T3; US20210321638A1; EP3503738B8

Abstract

Composición que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill (ABM), en la que el micelio de ABM es cultivado en un cereal, y un agente que afecta a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae), seleccionado entre harina de copra hidrolizada, productos derivados de la pared celular de la levadura, mano-oligosacáridos y beta-1-4-manobiosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Aditivo para alimento para animales y alimento para animales que lo comprenden

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a alimento para animales en general.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El alimento para animales se utiliza para contribuir al normal metabolismo de los animales, para que estos animales tengan buena salud y crezcan hasta su máxima capacidad. En particular, para los animales que a su vez son productores de alimentos, es muy importante que el alimento contribuya en forma óptima a su salud, ya que ésta a menudo se ve reflejada en su rendimiento, que se mide estableciendo el aumento de peso diario del animal, su peso a la edad en que se lo sacrifica y la edad relativa al peso al momento del sacrificio. En particular, en la crianza de animales productores de alimento se presta mucha atención al control de la propagación de bacterias entre un grupo de animales que están dentro de un sitio de producción particular, y también en particular, dado que muchas bacterias pueden ser patógenas para el animal mismo (ya que la infección reduce la salud del animal y, por lo tanto, su rendimiento) o también para los consumidores de dicho animal (seres humanos u otros animales). Los métodos comunes para reducir la propagación de bacterias son el uso de antibióticos y/o la vacunación de los animales. Otro método que se emplea es el confinamiento (cuarentena) del animal, junto con la esterilización del alimento; método que, sin embargo, no resulta conveniente para la crianza de animales para el consumo debido a los altos costos que este método conlleva.

El documento US 2008/187574 A1 describe alimentos para animales que tienen propiedades beneficiosas que se obtienen añadiendo a una sustancia una o más especies de hongos del tipo que excretan substancias en dicho sustrato durante su crecimiento y que son beneficiosas para la salud, el crecimiento y el aumento de peso de un animal o de animales a los que está destinado el alimento, y que permite que el hongo crezca y/o fermente en el sustrato. Las especies de hongos adecuadas incluyen especies de Cordyceps, especies de Ganoderma, especies de Grifola, especies de Trametes, especies de Lentinula, especies de Antrodia, especies de Agaricus, especies de Tremella, especies de Pleurotus, especies de Lentinus, especies de Polypore, especies de Agaricales, especies de Ascomycetes y especies de Basidiomycetes.

El documento CN 101 194 674 A describe un aditivo para piensos que es capaz de promover las funciones intestinales e inmunológicas en los lechones, en la que se utiliza como cepa el Agaricus blazei murrill, un medio de fermentación que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una sal inorgánica para fermento y cultivo; los productos obtenidos se mezclan, se congelan y se secan de acuerdo con la proporción del peso del caldo de fermentación, que es de 0.2-5:1. Cuando se añade el porcentaje 0.05-2 del aditivo del pienso al alimento, el mismo es capaz de reducir el nivel de diarrea, mejorando el incremento de peso diario, incrementando la tasa de conversión del alimento y aumentando el nivel de salud y el peso de los lechones al momento del destete.

El documento WO 2008/051862 A2 describe composiciones para contribuir a la salud de un animal, por ejemplo, para mejorar la inmunocompetencia de un animal o de un ser humano, que comprende cantidades terapéuticamente efectivas de beta-1,3-D-glucano o beta-1,6-D-glucano y un aditivo seleccionado del grupo que consiste en vitamina D, zinc, y una combinación de vitamina D y zinc.

El documento CN 101 371 683 A describe un producto aditivo para alimento de animales de agaricus blazei murill y un método de producción y aplicación del mismo. El aditivo para alimento animal se obtiene mediante la fermentación fúngica en estado sólido y tiene un fuerte efecto bacteriostático.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la invención es proporcionar un alimento para animales que es particularmente adecuado para mejorar el bienestar del animal, preferentemente reducir o mitigar la infección con bacterias patógenas ubicuas, tales como bacterias pertenecientes a las enterobacteriáceas, en particular las especies de Salmonella.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención corresponde a lo que se establece en las reivindicaciones. La descripción se refiere a una composición que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill y un agente que afecta a bacterias pertenecientes a las Salmonellas y/o a las Escherichia. La composición de la descripción en general tiene un efecto positivo en la excreción (shedding, en la versión en inglés) de bacterias de las Enterobacteriaceae, en particular Salmonella y/o Escherichia. Además, la composición es efectiva contra bacterias resistentes de las enterobacteriáceas, in particular de Salmonella y/o Escherichia. La composición puede además reducir la infestación de bacterias en el animal infestado, llevando a una mejora del estado de salud del animal y a un mejor rendimiento del crecimiento. En particular se verificó que la colonización con bacterias patógenas del grupo de las enterobacteriáceas se reduce, lo que está demostrado por un recuento de bacterias más bajo en las heces del animal. Con la composición de la invención puede ser posible reducir la cantidad de antibióticos preventivos que se administra a los animales.

La composición de la descripción incluye un alimento para animales, una premezcla para alimento para animales y un aditivo para alimento para animales. Por consiguiente, la descripción además se refiere a un aditivo para alimento para animales que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill y un agente que afecta a las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas, en particular un agente que afecta bacterias que pertenecen a las Salmonella y/o las Escherichia. Dicho aditivo para el alimento de animales puede comprender ingredientes que comúnmente se utilizan en los aditivos para alimentos de animales. El aditivo para alimento según la invención puede aplicarse y/o agregarse a una premezcla de un alimento para animales, a alimentos para animales y/o al agua para beber. Puede aplicarse para conservar la premezcla y/o el alimento. El aditivo para alimentos puede también ser utilizado para mejorar la salud del tracto digestivo del animal.

La descripción también se refiere a una premezcla de alimento para animales que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill y un agente que afecta a las bacterias que pertenecen a las Enterobacteriaceae, en particular un agente que afecta bacterias que pertenecen a las Salmonella y/o Escherichia. La premezcla de la descripción puede comprender además ingredientes que comúnmente se utilizan en premezclas de alimento para animales. Las premezclas de la descripción en general son luego procesadas y se agregan otros ingredientes para formar el alimento para animales. Por lo tanto, la descripción también se refiere a un alimento para animales que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill y un agente que afecta a las bacterias que pertenecen a las Enterobacteriáceas, en particular un agente que afecta bacterias que pertenecen a las Salmonelas y/o a las Escherichia. El alimento para animales en general se suministra a los animales. Un alimento para animales por lo general comprende nutrientes para animales, tales como grasas y/o proteínas y/o carbohidratos con los que se alimenta un animal para satisfacer sus requerimientos metabólicos. El alimento para animales puede ser un alimento nutricionalmente completo (es decir que proporciona todos los nutrientes necesarios para contribuir a un metabolismo normal del animal). Ingredientes similares también están contenidos en una premezcla de un alimento para animales, que solo contiene parte de los nutrientes requeridos y debe mezclarse con otros nutrientes o bien se administra separadamente de estos otros nutrientes.

Se señala que Agaricus Blazei Murill también se conoce como Agaricus Blazei Brasiliensis, Agaricus subrufescens, o Agaricus rufotegulis. En esta solicitud, se utilizará el nombre común Agaricus Blazei Murill. En lo sucesivo, se utilizarán indistintamente la abreviatura ABM y el nombre completo Agaricus Blazei Murill.

El micelio de ABM utilizado en las composiciones de acuerdo con la invención puede ser micelio en sí mismo cultivado en una matriz líquida, o puede ser micelio cultivado en un grano o cereal. En esta descripción, se prefiere micelio de ABM cultivado en grano. El grano utilizado para la fermentación puede ser cualquier cereal conocido en la técnica y adecuado para este propósito. Ejemplos de estos granos incluyen maíz, trigo, mijo, sorgo, cebada, centeno, avena y soja. Los cereales preferidos son el mijo, la avena y el centeno, y más preferido es el centeno. En el documento w O 2013/171194 se describen más detalles sobre el micelio de ABM cultivado en grano, incluidas las técnicas de preparación.

Puede elegirse la cantidad deseada de micelio de ABM cultivado en el grano, donde el nivel de fermentación determinará la cantidad. Normalmente, la cantidad de es al menos 1 por ciento en peso (% en peso) y como máximo 50 % en peso, en base al peso total de micelio y grano. Preferiblemente, la cantidad de micelio es al menos 5 % en peso y más preferiblemente como máximo 10 % en peso, y preferiblemente como máximo 40 % en peso, más preferiblemente como máximo 35 % en peso y más preferiblemente como máximo 30 % en peso, en base al peso total de micelio y de grano. Los métodos para determinar la cantidad de micelio como la medición del contenido de ergosterol están descriptos en el documento WO 2013/171194.

En un aspecto, la cantidad de micelio de ABM es al menos 0.001 % en peso, preferiblemente al menos 0.01 % en peso, more preferiblemente al menos 0.1 % en peso y más preferiblemente al menos 0.5 % en peso, y al máximo 30 % en peso, preferiblemente como máximo 20 % en peso, más preferiblemente como máximo 15 % en peso, and más preferiblemente como máximo 10 % en peso, en base al peso total de la composición.

En otro aspecto, la cantidad de micelio de ABM es al menos 0.1 % en peso, preferiblemente al menos 0.5 % en peso, más preferiblemente al menos 1 % en peso and más preferiblemente al menos 2 % en peso, y al máximo 30 % en peso, preferiblemente como máximo 20 % en peso, más preferiblemente como máximo 15 % en peso, y más preferiblemente como máximo 10 % en peso, en base al peso total del aditivo de alimento para animales.

En otro aspecto aún, la cantidad de micelio de ABM es al menos 0.001 % en peso, preferiblemente al menos 0.01 % en peso, more preferiblemente al menos 0.1 % en peso y más preferiblemente al menos 0.15 % en peso, y como máximo 5 % en peso, preferiblemente como máximo 2 % en peso, más preferiblemente como máximo 1 % en peso, y más preferiblemente como máximo 0.5 % en peso, en base al peso total del alimento para animales.

En otro aspecto aún, la cantidad de micelio de ABM es al menos 0.01 % en peso, preferiblemente al menos 0.1 % en peso, more preferiblemente al menos 1 % en peso y más preferiblemente al menos 1.5 % en peso, y como máximo 15 % en peso, preferiblemente como máximo 12 % en peso, más preferiblemente como máximo 10 % en peso, y más preferiblemente como máximo 5 % en peso, en base al peso total de la premezcla del alimento para animales.

El agente que afecta a las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas de la descripción puede ser cualquier agente conocido en la técnica. Estos agentes incluyen ingredientes farmacéuticamente activos e ingredientes nutricionalmente activos. Los ingredientes farmacéuticamente activos son agentes que son capaces de matar a las bacterias e incluyen a los antibióticos como las cefalosporinas y las fluoroquinolonas. La combinación con el micelio de la invención puede permitir una reducción de la cantidad del ingrediente farmacéuticamente activo que se administra al animal de forma preventiva o curativa. Los ingredientes nutricionalmente activos son agentes que afectan la salud intestinal y/o el sistema inmunológico del animal y/o que son capaces de reducir la reproducción de las bacterias ya sea en el alimento y/o en el tracto digestivo del animal. Ejemplos de dichos agentes incluyen ácidos orgánicos, tales como ácido fórmico, ácido láctico, butirato y ácido benzoico; carbohidratos prebióticos, tales como mono, di y polisacáridos de mananos, mono, di y polisacáridos de arabinoxilanos, mono, di y polisacáridos de fructanos de tipo inulina, galacto-oligosacáridos, xilo-oligosacáridos y quito-oligosacáridos; fibras prebióticas tales como fibra de guisante, fibra de palmiste, fibra de coco, fibra de trigo, fibra de avena y otros productos procesados; extractos de plantas tales como aceites esenciales, carvacrol, timol, eugenol, cinamaldehído y capsacina; y probióticos o productos derivados de microbios tales como Bacillus spp., Saccharomyces spp., Lactobacillus spp., así como productos y coproductos fermentados de los mismos como productos derivados de la pared celular de la levadura. Los agentes preferidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido fórmico, ácido láctico, ácido benzoico, harina de copra hidrolizada, productos derivados de la pared celular de la levadura, mano-oligosacáridos y p-1,4-manobiosa. Incluso más preferida es la harina de copra hidrolizada, los productos derivados de la pared celular de la levadura, loa mano-oligosacáridos y p-1,4-manobiosa. Aún más preferidos son los mano-oligosacáridos y p-1,4-manobiosa. La más preferida es p-1,4-manobiosa.

En un aspecto, la cantidad del agente que afecta las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas es al menos 0.001 % en peso, preferiblemente al menos 0.01 % en peso, more preferiblemente al menos 0.1 % en peso y más preferiblemente al menos 0.5 % en peso, y como máximo 30 % en peso, preferiblemente como máximo 20 % en peso, más preferiblemente como máximo 15 % en peso, y más preferiblemente como máximo 10 % en peso, en base al peso total de la composición.

En otro aspecto, la cantidad de agente que afecta las bacterias que pertenecen a enterobacteriáceas es al menos 0.1 % en peso, preferiblemente al menos 0.5 % en peso, more preferiblemente al menos 1 % en peso y más preferiblemente al menos 2 % en peso, y como máximo 30 % en peso, preferiblemente como máximo 20 % en peso, más preferiblemente como máximo 15 % en peso, y más preferiblemente como máximo 10 % en peso, en base al peso total del aditivo de alimento para animales.

En otro aspecto aún, la cantidad de agente que afecta las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas es al menos 0.001 % en peso, preferiblemente al menos 0.01 % en peso, more preferiblemente al menos 0.1 % en peso y más preferiblemente al menos 0.15 % en peso, y como máximo 5 % en peso, preferiblemente como máximo 2 % en peso, más preferiblemente como máximo 1 % en peso, y más preferiblemente como máximo 0.5 % en peso, en base al peso total del alimento para animales.

En otro aspecto aún, la cantidad de agente que afecta las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas es al menos 0.01 % en peso, preferiblemente al menos 0.1 % en peso, more preferiblemente al menos 1 % en peso y más preferiblemente al menos 1.5 % en peso, y como máximo 15 % en peso, preferiblemente como máximo 12 % en peso, más preferiblemente como máximo 10 % en peso, y más preferiblemente como máximo 5 % en peso, en base al peso total de la premezcla del alimento para animales.

En una realización de la invención, la relación de peso de micelio de ABM y el agente que afecta las bacterias que pertenecen a enterobacteriáceas en las composiciones de la invención es al menos 0.01, preferiblemente al menos 0.1, more preferiblemente al menos 0.3 y más preferiblemente al menos 0.5, y como máximo 50, preferiblemente como máximo 20, más preferiblemente como máximo 10 y más preferiblemente como máximo 5.

Las composiciones de la descripción son efectivas contra las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas. En particular, las composiciones de la invención son efectivas contra las enterobacteriáceas que son patógenas para animales, en particular para animales de ganadería y granja, tales como pollos, cerdos y rumiantes. Dichas bacterias incluyen Salmonella tales como S. Typhimurium, S. Infantis, S. Heidelberg, S. Enteritidis, S. Tennessee, S. Brandenburg, S. Newport, S. Mbandaka, S. Cubana, S. Senftenberg, S. Yoruba, S. Derby, S. Kedoudgo, S.Cholerae-suis, S. Livingstone, S. Lexington, S. Gallinarum y S. Agona; y Escherichia tales como E. Coli y E. Vulnerus. Los agentes preferidos afectan a una o más bacterias seleccionadas del grupo de las S. Typhimurium, S. Enteritidis y E.Coli.

Se señala que el micelio de ABM y el agente que afecta las bacterias que pertenecen a enterobacteriáceas no necesariamente deben estar presentes en la misma materia prima del alimento al mismo tiempo. Es esencial que los varios componentes alimentarios (alimento sólido, agua para beber, etc.) que consume el animal en su totalidad incluyan ambos ingredientes, de modo tal que al menos en el tracto gastrointestinal ambos ingredientes se combinen y actúen de acuerdo con la presente invención.

La invención también se refiere a un kit de partes que comprende una primera parte constituyente que comprende micelio de Agaricus Blazei Murril (ABM) y una segunda parte constituyente que comprende uno o más agentes que afectan a las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas, y opcionalmente una instrucción para administrar en forma oral ambas partes del kit a un animal. Se señala que, con relación a la presente invención, las partes no necesariamente deben estar presentes en un único envase. Se prevé que las partes estén suministradas en envases separados, no confeccionadas juntas, pero con la clara intención (por ejemplo, mediante indicaciones proporcionadas en un sitio web, en un folleto separado, etc.) de ser utilizadas de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, añadiendo una o ambas partes al alimento para animales y/o ambas partes al agua que se ofrece para que el animal beba junto con su alimento.

La invención también permite un método para alimentar a un animal proporcionando un alimento que comprende micelio de Agaricus Blazei Murril y uno o más agentes que afectan a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas. Esto puede lograrse por ejemplo poniendo ambos ingredientes en el alimento para animales, o alimentando al animal con una primera sustancia que comprende el micelio de ABM y una segunda sustancia que comprende el agente que afecta las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas (por ejemplo, agua para beber en la que están presente los ácidos). La invención también habilita un método para proporcionar un alimento para animales mezclando micelio de Agaricus Blazei Murril y uno o más agentes que afectan a las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas con proteínas y/o carbohidratos y/o grasas para proporcionar el alimento.

En una primera realización del alimento de acuerdo con la invención, el micelio de ABM está presente en el alimento para animales en una cantidad de al menos 0.01 kg por tonelada de ingesta diaria total, preferiblemente al menos 0.02, más preferiblemente al menos 0.05 kg por tonelada, y como máximo 10 kg por tonelada de ingesta diaria total de alimento, preferiblemente como máximo 5 kg por tonelada, más preferiblemente como máximo 2 kg por tonelada, y más preferiblemente como máximo 1 kg por tonelada de ingesta diaria total. En el contexto de esta solicitud, la ingesta diaria total de alimento es la masa completa de alimento que un animal ingiere por día, excluyendo el agua que bebe. Esta cantidad puede estar presente en un alimento nutricional completo en sí mismo, a un nivel de 0.01 a 5 kg por tonelada de dicha materia prima del alimento, o puede, por ejemplo, estar presente en la materia prima del alimento concentrado (superior a los 5 kg/tonelada de materia prima del alimento) siempre que la cantidad por ingesta diaria total de alimento esté entre 0.01 y 5 kg de micelio de ABM por tonelada. En particular, el micelio de ABM se administra en una cantidad de 0.05 a 2 kg por tonelada de ingesta diaria total de alimento. Estas cantidades parecen ser suficientes para el uso de acuerdo con la actual invención.

En otra realización, el agente o más agentes que afectan las bacterias que pertenecen a enterobacteriáceas están presentes en el alimento para animales en una cantidad de al menos 0.01 kg por tonelada de ingesta diaria total, preferiblemente al menos 0.02, más preferiblemente al menos 0.05 kg por tonelada, y como máximo 10 kg por tonelada de ingesta diaria total de alimento, preferiblemente como máximo 5 kg por tonelada, más preferiblemente como máximo 2 kg por tonelada, y más preferiblemente como máximo 1 kg por tonelada de ingesta diaria total.

La descripción se refiere además al uso de la composición de la invención contra bacterias resistentes de las enterobacteriáceas, en particular de las Salmonella y/o las Escherichia. Con el término "bacterias resistentes" se hace referencia a bacterias que son resistentes a los antibióticos convencionales. Ejemplos de dichas bacterias resistentes incluyen a las Escherichia coli resistentes a la cefotaxima, enterobacteriáceas resistentes a los carbapenémicos y Escherichia coli productoras de betalactamasa de espectro extendido (E. coli productora de BL-EE). Preferiblemente, la divulgación se refiere al uso de la composición inventiva en la alimentación para animales contra bacterias resistentes de las enterobacteriáceas, en particular de las Salmonella y/o las Escherichia.

EJEMPLOS

El ejemplo 1 describe un estudio de modelo in vitro para evaluar el efecto de un antimicrobiano sobre el crecimiento bacteriano.

El Ejemplo 2 describe un estudio in vivo para evaluar el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos sobre la diseminación (shedding) de bacterias.

El Ejemplo 3 describe un segundo estudio in vivo para evaluar el efecto del micelio ABM combinado con ácidos orgánicos sobre la diseminación de bacterias.

El ejemplo 4 describe un estudio in vitro sobre el cultivo bacteriano con diferentes tratamientos.

El ejemplo 5 describe un estudio in vivo para evaluar el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos sobre la diseminación de bacterias.

El ejemplo 6 describe un estudio in vivo con pollos de engorde que evalúa la transmisión de Salmonella.

La Figura 1 muestra el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la diseminación (shedding) de Salmonella.

La Figura 2 muestra el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la diarrea.

La Figura 3 muestra el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la ingesta de alimento.

La Figura 4 muestra el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la eficacia del alimento.

La Figura 5 muestra el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la diseminación de enterobacteriáceas en otros estudios in vivo.

Ejemplo 1

El ejemplo 1 describe un estudio modelo in vitro para evaluar el efecto del micelio de ABM en la adherencia bacteriana. En este método, se evalúa la adherencia de Salmonella typhimurium al micelio de ABM.

Se utilizó una placa de 96 pocillos que se recubrió con el micelio de ABM. Para ello, se suspendió el micelio de ABM (en este y en cada caso a continuación en realidad se utilizó un producto de centeno fermentado en el que la cantidad de micelio de ABM era aproximadamente 15% p/p) en PBS hasta una concentración final de 1% (p/v) y se agitó bien. Posteriormente, se centrifugó la suspensión para eliminar material insoluble. A continuación, el sobrenadante se usó para recubrir los pocillos de la placa microtituladora. Para evaluar la adherencia, se agregó una suspensión de Salmonella typhimurium a la placa microtituladora. La placa fue luego incubada durante 39 minutos y después de este paso de incubación se lavó con PBS. A continuación, se añadió un medio de cultivo a los pocillos y se determinó el tiempo hasta el inicio del valor DO600. Se utilizó la medición de la densidad óptica (DO) como herramienta para comparar las cantidades de bacterias adheridas a los pocillos recubiertos de los 96 pocillos de la placa con diferentes compuestos. La densidad celular inicial de bacterias adheridas se correlaciona con la detección dependiente del tiempo de cultivo mediante la medición de la densidad óptica. Un tiempo más corto para el inicio del valor DO600 representa más adherencia de las bacterias al sustrato y por lo tanto se espera una mayor disminución en el cultivo in vivo.

Los resultados de los ensayos con Salmonella typhimurium mostraron que el tiempo promedio hasta el comienzo de DO600 fue de 4.9 horas (± 0.3h) comparado con el control (solo PBS) que tuvo un tiempo promedio al comienzo de DO600 de 7.3 horas (± 0.1h). Aproximadamente otros veinte compuestos que se sospechaba tenían un efecto potencial de adherencia (compuestos no indicados en este ejemplo) mostraron un tiempo promedio al comienzo de DO600 generalmente entre 5 y 8.5 horas.

En un segundo estudio in vitro se repitió el ensayo y además se midió el efecto en Salmonella enteritidis y E. coli. Asimismo, la cantidad de micelio de ABM se utilizó en una cantidad total (véase arriba; indicada como "100%"), la mitad de esta cantidad ("50%") y un cuarto de esta cantidad ("25%)". Los resultados se indican a continuación, en la Tabla 1.

Tabla 1. Efecto del micelio ABM en varias cantidades sobre la adhesión de varias enterobacteriáceas, midiendo el tiempo de aparición de la DO600 en horas.

De los estudios del modelo surge que el micelio de ABM tiene un efecto significativo en la adherencia de varias enterobacteriáceas. El efecto parece ser independiente del tipo de bacteria a pesar del hecho de que en particular esas bacterias Escherichia son de una especie completamente diferente de las bacterias Salmonella. La cantidad de micelio de ABM no parece ser crucial para obtener el efecto de adherencia como tal.

Ejemplo 2 (Ejemplo de referencia)

El ejemplo 2 describe un estudio in vivo para evaluar el efecto del micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la diseminación (shedding) bacteriana. En este estudio se evaluó si el efecto que se había observado in vitro (véase el Ejemplo 1) corresponde efectivamente a la diseminación bacteriana in vivo. En particular, se evaluó si al introducir el micelio de ABM en el alimento de cerdos, en este caso combinado con una mezcla de ácidos orgánicos, podría reducirse la diseminación de bacterias viables. Como controles, se utilizó un control negativo usando el alimento normal y como control positivo el mismo alimento con el añadido de butirato, un ácido graso de cadena corta particular que se utiliza comercialmente en el alimento para aves para reducir la diseminación bacteriana. La mezcla de ácidos orgánicos era una mezcla de ácidos orgánicos CrC¹⁶regular que contenía una combinación de ácido láctico y fórmico añadidos a 4 litros por 100 kg.

Se utilizó un total de 24 lechones de jabalí Topi*Hypor. En este estudio solo se incluyeron machos saludables que no habían recibido antibióticos y habían dado negativo de Salmonella (determinado mediante examinación cualitativa de las heces). Los animales fueron identificados mediante marcas numeradas únicas colocadas en las orejas. Se dividió a los animales en tres grupos de tratamiento (8 animales por grupo) por peso y por camada. Los lechones fueron alojados separadamente directamente después del destete (a los 24 días de edad /- 3 días) en corrales de 0.8 x 1.6 m con suelos suaves con rejillas de listones. Durante las primeras 24 horas posteriores al destete se les proporcionó luz continua, luego 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Los lechones recibieron alimento y agua ad libitum. Se administraron los diferentes tratamientos en el alimento durante todo el periodo del estudio (desde el destete hasta el fin del estudio) según se indica en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Tratamientos con alimento

Después de 10 días los lechones fueron infectados por vía oral con Salmonella typhimurium (en un medio BHI) provisto por una matriz de alimento preinoculado que contenía 1 ml 1*109 cfu/ml. La infección por vía oral se realizó de esta manera durante 7 días consecutivos.

Se tomaron muestras de materia fecal los días 1, 2, 3, 4, y 7 después de la infección con Salmonella. Las muestras se guardaron a 4 grados y se analizaron al día siguiente. Las muestras se diluyeron y homogenizaron en BPW con contenido de novobiocina. Se realizaron diluciones seriales y se emplataron en placas de agar cromogénico selectivo y se incubaron durante la noche a 37°C. Se contaron las colonias típicas de Salmonella y se calculó la cantidad (ufc/gramo). De cada muestra dos presuntas colonias de Salmonella fueron confirmadas por qPCR tanto para Salmonella como para Salmonella typhimurium. En los casos que no se observaron colonias en las placas de la menor dilución las muestras se examinaron para detectar la presencia (cualitativa) de Salmonella después del preenriquecimiento mediante el método convencional de MSRV/XLD.

Los resultados se indican en la Figura 1, que muestra el efecto de micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la diseminación de Salmonella. En apariencia, la combinación de micelio de ABM y ácidos orgánicos efectivamente tiene un efecto significativo en la diseminación de bacterias viables de salmonella. En particular, el efecto es muy grande si se lo compara con el butirato, un compuesto que se utiliza en aves de corral para este propósito. Por lo tanto, queda claro que el modelo in vitro (Ejemplo 1) es predictivo de la reducción in vivo de la diseminación bacteriana.

La Figura 2 muestra el efecto en la diarrea. Se realizó una puntuación respecto de las heces en forma diaria a partir del día 3 después del destete hasta el final del estudio. La puntuación de diarrea fue la siguiente: 0 = heces normales; 1 = heces delgadas; 2 = heces húmedas; 3 = heces acuosas. Los resultados que se informa en la Figura 2 muestran una reducción importante del micelio de ABM en la diarrea.

Para evaluar el rendimiento, los lechones fueron inspeccionados diariamente. Se determinó el peso corporal y la ingesta de alimentos en el momento del destete, antes de la infección, y los días 7, 14, y 21 después de la infección (día 0, 10, 17, 24, y 31). La eficacia del alimento se determinó como cultivo en gramos/ingesta de alimento en gramos. La Figura 3 muestra el efecto de micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la ingesta de alimento. La Figura 4 muestra el efecto de micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la eficacia del alimento. Los resultados muestran un impacto positivo significativo en el rendimiento atribuible a la presencia del micelio de ABM en el alimento.

Ejemplo 3 (Ejemplo de referencia)

El ejemplo 3 describe un segundo estudio in vivo para evaluar el efecto del de micelio de ABM combinado con ácidos orgánicos en la diseminación bacteriana. En este estudio, como control positivo se utilizó la misma mezcla ácida en sí misma (es decir, sin el micelio de ABM).

Se utilizó un total de 36 lechones de jabalí Topi*Hypor. En el estudio solamente se incluyeron machos saludables que no habían recibido antibióticos y que habían dado negativo de Salmonella (determinado mediante un examen cualitativo de las heces). Los animales fueron identificados mediante marcas numeradas únicas colocadas en las orejas. Se dividió a los animales en tres grupos (12 animales en cada grupos) por peso y por camada.

Los lechones fueron alojados separadamente directamente después del destete (a los 24 días de edad /- 3 días) en corrales de 0.8 x 0.8 m) con suelos suaves con rejillas de listones. Durante las primeras 24 horas posteriores al destete se les proporcionó luz continua, luego 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Los lechones recibieron alimento y agua ad libitum. Se administraron los diferentes tratamientos en el alimento durante todo el periodo del estudio (desde el destete hasta el fin del estudio) según se indica en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3 Tratamientos con alimentos

Después de 8 días, los lechones fueron infectados por vía oral con Salmonella typhimurium (en un medio BHI) administrado mediante una matriz de alimento preinoculada que contenía 1 ml 1*109 ufc/ml. Se realizó la infección por vía oral de esta manera durante 7 días consecutivos. El muestreo fecal se realizó los días 1, 2, 3, 4, y 5 posteriores a la infección de Salmonella. Las muestras se guardaron a 4 grados y se analizaron al día siguiente. Las muestras fueron diluidas y homogenizadas en BPW que contenía novobiocina. Se realizaron diluciones seriales y se emplataron en placas de agar cromogénico selectivo y se incubaron durante la noche a 37°C. Se contaron las colonias típicas de Salmonella y se calculó la cantidad (ufc/gram). De cada muestra, dos presuntas colonias de Salmonella fueron confirmadas mediante qPCR respecto tanto de la Salmonella como de la Salmonella typhimurium. Cuando no se observaron colonias en las placas de dilución más baja, las muestras fueron analizadas para detectar la presencia (cualitativa) de Salmonella después del preenriquecimiento mediante el método MSRV/XLD convencional. Los resultados se indican en la Figura 5 y corresponden a los resultados según se indica en la Figura 1.

El experimento in vivo anterior fue repetido para evaluar el efecto diseminación de Escherichia coli en cerdos. El experimento se realizó en correspondencia con el experimento con Salmonella descripto antes, con 10 animales utilizados por cada grupo. Los resultados mostraron que el día de la infección artificial con E. coli ninguno de los animales dio positivo en sus heces respecto de E. coli. El día 12, más del 70% de los animales de cada grupo dio positivo. Dos días más tarde, los dos grupos de control (control negativo y grupos de mezcla ácida) el porcentaje de animales positivos era del 60%, mientras en que el grupo ^aB^mno hubo presente ningún diseminador (shedder) (0% de los animales dio positivo de E. coli).

Ejemplo 4

Se realizó un estudio de modelo in vitro de acuerdo con el protocolo descripto en el Ejemplo 1. En este método, la adherencia de Salmonella typhimurium y de Escherichia Coli al micelio de ABM en centeno, a (3-1,4-manobiosa, y a tres combinaciones de micelio de ABM en centeno y p-1,4-manobiosa con diferentes combinaciones, es decir, 75:25, 50:50 y 25:75. La cantidad total de los agentes es la misma en todos los experimentos.

Los resultados de los ensayos con Salmonella typhimurium se muestran en la Tabla siguiente.

Tabla 4. Efecto del micelio ABM sobre centeno y p-1,4-manobiosa en diversas cantidades sobre la adhesión de diversas enterobacteriáceas, midiendo el tiempo de aparición de la DO600 en horas.

Los estudios del modelo muestran que micelio de ABM en centeno y p-1,4-manobiosa tienen un efecto significativo en la adherencia de Salmonella typhimurium. El DO600 inicial medido respecto de las diferentes combinaciones de micelio de ABM en centeno y p-1,4-manobiosa es significativamente más bajo que el DO600 inicial medido respecto del micelio de ABM y p-1,4-mannobiosa solos.

Los experimentos con E. coli revelan que el micelio de ABM en centeno reduce considerablemente el DO600 inicial respecto del control. Los experimentos también muestran que p-1,4-manobiosa tiene un DO600 inicial que es superior al inicio observado respecto del control, lo que muestra que p-1,4-manobiosa no tiene un efecto en la adherencia de E. coli. Las combinaciones de micelio de ABM en centeno y p-1,4-manobiosa muestran un DO600 inicial considerablemente más bajo que el control y p-1,4-manobiosa solos. Se señala además que los valores de DO600 inicial de las combinaciones son más bajos que los que se esperaba en base a una relación lineal entre los valores de OD iniciales del micelio de ABM en centeno solo y p-1,4-manobiosa sola.

Ejemplo 5 (Ejemplo de referencia)

Se condujo un estudio in vivo de acuerdo con el protocolo descripto en el Ejemplo 2, excepto que se utilizaron 12 animales por grupo de tratamiento y los lechones se seleccionaron en base a la presencia de Escherichia Coli resistente a la cefotaxima; a los animales seleccionados se los infectó con Salmonella entiritidis después de 5 días. En este ensayo se estudió la diseminación de Escherichia Coli resistente a la cefotaxima a micelio de ABM en centeno y a una combinación de micelio de ABM en centeno y p-1,4-manobiosa al 50:50. La mezcla de ácido orgánico fue una mezcla de ácido orgánico regular C¹-C¹⁶que contenía un ácido fórmico y un ácido láctico. La cantidad total de los agentes es la misma en todos los experimentos

En la siguiente Tabla se muestran los resultados de los ensayos con Escherichia Coli resistente a la cefotaxima. Tabla 5. Efecto de micelio de ABM en centeno y p-1,4-manobiosa en la diseminación de Escherichia Coli resistente a la cefotaxima mediante la medición durante los primeros 4 días y durante 16 días

El estudio muestra que el micelio de ABM en centeno con o sin p-1,4-manobiosa tiene un efecto significativo en la diseminación de Escherichia Coli resistente a la cefotaxima. La mezcla ácida sola no proporciona una reducción significativa de la diseminación de Escherichia Coli resistente a la cefotaxima.

Ejemplo 6. ((Ejemplo de referencia)

Se realizó un estudio in vivo utilizando dos grupos, cada grupo comprendía 6 corrales iguales con 30 aves. Tres aves de cada corral fueron infectadas con Salmonella enteritidis (las aves sembradoras). Los pollos se alimentaron con una dieta de alimento de engorde convencional durante 42 días. Un grupo de pollos fue tratado con micelio de ABM en centeno y una mezcla de ácido orgánico. La mezcla de ácido orgánico fue una mezcla de ácido orgánico regular de C¹-C¹⁶que contenía una combinación de ácido fórmico y ácido láctico. La transmisión de Salmonella a las aves no sembradoras se estableció determinando el número de aves positivas o infectadas luego de 28 y 42 días.

Luego de 28 días, el grupo de control (no tratado) mostró un 83% de aves infectadas, mientras que el grupo tratado contenía 55% de aves infectadas. Luego de 42 días, el 60% de las aves estaba infectada en el grupo de control y el 35% de las aves era positiva en el grupo tratado. Esto demuestra claramente que el tratamiento ayuda a la contención de la Salmonella en los pollos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill (ABM), en la que el micelio de ABM es cultivado en un cereal, y un agente que afecta a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae), seleccionado entre harina de copra hidrolizada, productos derivados de la pared celular de la levadura, mano-oligosacáridos y beta-1-4-manobiosa.

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el agente que afecta las bacterias que pertenece a las enterobacteriáceas es (3-1,4- manobiosa.

3. Composición de acuerdo con cualquiera de las precedentes reivindicaciones en la que la relación de peso de micelio de ABM y el agente que afecta a las bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas en las composiciones de la invención es al menos 0.01 y como máximo 50.

4. Alimento para animales que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill (ABM), en el que el micelio de ABM es cultivado en un cereal, y un agente que afecta a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas seleccionado entre harina de copra hidrolizada, productos derivados de la pared celular de la levadura, mano-oligosacáridos y beta-1-4-manobiosa.

5. Alimento para animales de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el micelio de ABM está presente en el alimento para animales en una cantidad de entre 0.01 y 5 kg por tonelada de ingesta diaria total.

6. Premezcla de alimento para animales que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill (ABM), en donde el micelio de ABM es cultivado en un cereal, y un agente que afecta a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas, seleccionado entre harina de copra hidrolizada, productos derivados de la pared celular de la levadura, mano-oligosacáridos y beta-1-4-manobiosa.

7. Aditivo para alimento que comprende micelio de Agaricus Blazei Murill (ABM), en el que el micelio de ABM es cultivado en un cereal, y un agente que afecta a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas, seleccionado entre harina de copra hidrolizada, productos derivados de la pared celular de la levadura, mano-oligosacáridos y beta-1-4-manobiosa.

8. Kit de partes que comprende una primera parte constituyente que comprende micelio de Agaricus Blazei Murril (ABM), en el que el micelio de ABM es cultivado en un cereal, y una segunda parte constituyente que comprende uno o más agentes que afectan a bacterias que pertenecen a las enterobacteriáceas, seleccionados de entre harina de copra hidrolizada, productos derivados de las paredes celulares de la levadura, mano-oligosacáridos y beta-1-4-manobiosa, y opcionalmente una instrucción para administrar ambas dichas partes en forma oral a un animal.