CN109837224A - 小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂及其制备方法和应用，该小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂是以小龙虾加工废弃物为原料通过乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS‑45和酵母菌S‑78的协同发酵制得。本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂富含多种益生菌和氨基酸，且氨基酸的含量高达56.274μg/g，具有营养价值更高、应用范围更广、经济效益更大等优点，其制备方法具有处理工艺简单、操作方便、处理成本低等优点，能够用于大规模制备，有利于实现工业化生产。本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂作为原料可广泛用于饲料领域，具有较好的经济价值和应用价值。

Description

小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于农畜牧业技术领域，涉及一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂及其制备方法和应用。

背景技术

小龙虾又称克氏原螯虾(Procambarus clarkia)，原产于墨西哥北部和美国南部，大约在20世纪30年代末期被引入我国，现已成为我国最重要的水产经济虾类之一。截止到2016年，全国小龙虾总产量为89.91万吨，年产值564.10亿元。近年来，由于小龙虾养殖规模不断扩大，产量不断增长，在小龙虾加工过程中产生了大量的虾头、虾壳废弃物，这些加工副产品营养物质丰富，但大多被丢弃，很少被利用，这不仅导致水产资源的大量浪费，同时也会对环境造成严重污染。因此，如何科学地开发利用小龙虾加工废弃物，提高其经济价值，己成为目前亟待解决的问题。

研究表明，小龙虾加工废弃物约占虾体重量80%，其含有丰富的蛋白质、脂肪和矿物质，以及活性成分虾青素和甲壳素等。据报道，小龙虾加工废弃物中蛋白质含量丰富，是除水分以外含量最多的营养成分。研究还发现，虾废弃物中蛋白质的氨基酸成分组成均衡，其组成中含必需氨基酸占45.33%，在氨基酸组成上与牛奶蛋白质和酪蛋白极为相近，品质优良，可广泛用于食品、饮料中，亦可完全水解后制成氨基酸营养液用作饲料添加剂，还可用于作为鱼粉的替代品应用动物饲料，缓解我国饲料资源短缺的现状。因此，小龙虾加工废弃物具有良好的应用和开发前景。

目前，小龙虾加工废弃物中虾蛋白质的提取和分离主要有酸碱法、酶解法和微生物发酵法。酸碱法是通过调节提取液pH使蛋白质沉淀析出，具体为先利用酸除去虾壳中的钙，再用碱将虾壳中的蛋白质提取出来，但是酸碱法中酸、碱用量多，会损害虾头、虾壳中甲壳素和虾青素等活性分子的结构，同时由于所用酸和碱均具有较强的腐蚀性，会严重污染环境。酶解法是利用虾头、虾壳中蛋白酶的自溶作用或者外加蛋白酶的水解作用将蛋白质水解分离出来，这种方法虽然可以回收蛋白质，但是所得酶解液腥臭味、苦涩味明显，基本没有鲜味，严重限制了虾蛋白的应用价值。此外，酶解法虽然能够避免了大量使用酸碱试剂，但是利用小龙虾加工废弃物中蛋白酶水解蛋白的作用时间长、自溶作用较慢，容易造成产品腐败和污染病菌，而商品化的酶制剂成本很高，不便于工业化大量生产和大量使用。近年来，微生物发酵法为虾壳和虾头中优质蛋白质的开发利用提供了崭新的思路和方法，如，利用邻单胞杆菌从虾壳中提取虾青素、蛋白质及甲壳素，但是该方法中使用的邻单胞杆菌是一种条件致病菌，会影响产品的安全性，且该邻单胞杆菌的发酵温度为37℃，在该温度条件下容易引起一些其他杂菌（如大肠杆菌等致病菌）的生长，从而污染发酵后产品；同时该方法中在发酵前要求对虾头灭菌，不仅会增加加工成本，也会使虾头中的一些营养成分失活。又如，利用乳酸菌从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素，但是该方法中乳酸菌产活性蛋白酶活性较低，使得蛋白质不能被充分利用和转化，导致发酵周期较长，不仅蛋白质的提取率较低，且加工成本高。另外，现有技术中还存在从发酵虾头中提取虾青素、蛋白质乳酸钙和甲壳素的方法，采用嗜热链球菌发酵虾头，提高虾青素的提取率。虽然该方法中发酵前不需要灭菌，但是在发酵前需要调节虾头匀浆液的pH值和保温处理，这同样增加了发酵前行工序，增加了发酵的能耗和成本，降低了生产效率。更为突出的问题是：该方法中要求在发酵原料虾头壳中加入0.1-20%外源葡萄糖，会增加发酵成本，且发酵温度较高（高达45℃）将增加能耗，同时发酵时间高达72h，降低了生产效率，因此，不利于工业化生产。

综上所述，现有技术中存在以下缺陷：（1）现有技术中主要是从小龙虾加工废弃物中提取大分子蛋白质和虾青素，但并未涉及提取小分子氨基酸的方法；（2）现有处理工艺中还存在以下问题：需要添加外源营养物质；发酵前需要调节pH值、灭菌或保温处理；所用微生物所需发酵条件苛刻，以上问题的存在，增加了处理工序和处理成本，存在二次污染风险，且不利于工业化生产，因而极大的限制了小龙虾加工废弃物的资源化再利用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种营养价值高、应用范围广、经济效益大的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，还提供了一种处理工艺简单、操作方便、处理成本低的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法以及该小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂作为原料在制备饲料中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，所述小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂是以小龙虾加工废弃物为原料通过乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78的协同发酵制得。

上述的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，进一步改进的，所述小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量为42.506μg/g～56.274μg/g。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、将小龙虾加工废弃物烘干，粉碎，得到小龙虾加工废弃物干粉；

S2、以步骤S1中得到的小龙虾加工废弃物干粉为原料，接种乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78进行固态发酵培养，得到小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂。

上述的制备方法，进一步改进的，所述步骤S2中，所述乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78以菌悬液的形式进行接种，其中乳酸杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液和酵母菌S-78菌悬液的接种总量为固体发酵培养原料总质量的20%～30%。

上述的制备方法，进一步改进的，所述乳酸杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液和酵母菌S-78菌悬液的体积比为1.5～2∶1.5～2∶0.8～1。

上述的制备方法，进一步改进的，所述乳酸杆菌菌悬液的浓度为1×10⁹ cfu/mL～10×10⁹ cfu/mL；所述枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液的浓度为1×10⁹ cfu/mL～10×10⁹ cfu/mL；所述酵母菌S-78菌悬液的浓度为1×10⁸ cfu/mL～10×10⁸ cfu/mL。

上述的制备方法，进一步改进的，所述乳酸杆菌菌悬液的制备方法包括以下步骤：将乳酸杆菌菌种接种到MRS液体培养基中，在温度为37℃～40℃、转速为130r/min～160r/min的条件下活化培养14h～18h，得到乳酸杆菌菌悬液。

上述的制备方法，进一步改进的，所述枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液的制备方法包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌YS-45菌种加入到LB液体培养基中，在温度为35℃～37℃、转速为130r/min～160r/min的条件下活化培养14h～18h，得到枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液。

上述的制备方法，进一步改进的，所述酵母菌S-78菌悬液的制备方法包括以下步骤：将酵母菌S-78菌种加入到YPD液体培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为130r/min～160r/min的条件下活化培养14h～18h，得到酵母菌S-78菌悬液。

上述的制备方法，进一步改进的，所述步骤S1中，所述烘干为在温度为60℃～80℃烘干至恒重。

上述的制备方法，进一步改进的，所述步骤S2中，所述固体发酵培养过程中保持发酵体系的含水量为30%～40%；所述固体发酵培养过程中控制温度为28℃～30℃；所述固体发酵培养的时间为24h～48h。

上述的制备方法，进一步改进的，所述小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量为42.506μg/g～56.274μg/g。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂或上述的制备方法制得的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂作为原料在制备饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，以小龙虾加工废弃物为原料通过乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78的协同发酵制得。本发明的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中主要的营养成分为小分子氨基酸，相比传统从虾加工废弃物种直接分离的大分子蛋白质，具有营养价值更高、应用范围更广、经济效益更大等优点，同时氨基酸的含量高达56.274μg/g。

（2）本发明还提供了一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法，以小龙虾加工废弃物为原料，通过接种乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78进行固态发酵培养，其中，利用乳酸菌在发酵过程中的产酸作用形成的酸性环境，可以防止小龙虾加工废弃物（虾头、虾壳）在自溶过程中发生的腐败，直接抑制或杀灭病原微生物，延长产品的保藏期，且利用乳酸菌发酵还可以消除产品的苦涩味和腥臭味，并可产生新的风味成分；与此同时，在发酵体系中加入高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78，二者结合可以优势互补，在主要利用枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78蛋白酶作用分解蛋白生产大量氨基酸的同时，通过乳酸菌发酵脱除腥臭味和苦涩味，并防止自溶过程发生腐败，最终通过这两类菌的协同发酵作用制成富含氨基酸的微生物发酵制剂。本发明方法将小龙虾加工废弃物制成的营养价值高、应用范围广、经济效益大的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，提高小龙虾产品附加值，为推动国内小龙虾全产业链良性发展奠定基础；同时，本发明方法也为解决小龙虾加工废弃物的综合利用提供了新的出路，是一种能够有效利用小龙虾加工废弃物且切实可行的方法。

（3）本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法，还具有以下优点：发酵原料只有小龙虾加工废弃物，不需要添加外源营养物质；发酵前不需要调pH、灭菌以及保温处理；发酵温度低，发酵周期短。相比传统的方法，本发明方法有利于简化发酵工艺、降低成本、节约能耗，具有处理工艺简单、操作方便、处理成本低等优点，能够用于大规模制备，有利于实现工业化生产。

（4）本发明还提供了一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂作为原料在制备饲料中的应用，在饲料中添加本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，可以部分替代常规蛋白饲料源豆粕或者鱼粉，降低饲料成本。本发明中，由于小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中富含多种氨基酸，添加到饲料中能够促进动物肠道细胞对营养物质的吸收作用，增强机体的抗氧化和免疫能力，同时改善肌肉营养组成，提高肌肉中风味物质含量。本发明中，由于小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中还含有多种益生菌（乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78），能够促进动物生长发育，提高生长性能，调整动物肠道内菌群的平衡，增强机体免疫能力，降低肠道内有害物质的产生。本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂可广泛用于饲料领域，具有较好的经济价值和应用价值。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。本发明的实施例中，若无特别说明，所采用工艺为常规工艺，所采用设备为常规设备，且所得数据均是三次以上试验的平均值。

实施例1：

一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将小龙虾加工废弃物（如虾头、虾壳）置于烘箱内，在温度为70℃下烘干至恒重，粉碎，制成小龙虾加工废弃物干粉。

（2）培养基的配制：

LB液体培养基的配制：将1.0g蛋白胨、0.5g酵母膏和1.5g氯化钠用水溶解，加水定容到100mL，灭菌。

MRS液体培养基的配制：将1.0g蛋白胨、1.0g牛肉膏、0.5g酵母膏、2.0g葡萄糖、0.2g磷酸氢二钾、0.025g硫酸锰、0.2g柠檬酸二胺、0.058g硫酸和0.1mL吐温用水溶解，加水定容到100mL，调节pH值为6.4，灭菌。

YPD液体培养基的配制：将2.0g葡萄糖、1.0g蛋白胨和0.5g酵母膏用水溶解，加水定容到100mL，灭菌。

（3）菌种活化培养：

将乳酸杆菌菌种（市售，购于北京帕尔阳光科技开发有限公司）接种到20mL 步骤（2）中制得的MRS液体培养基中，在转速为160r/min的摇床上进行培养，其中培养过程中控制温度为37℃，培养时间为18h，得到乳酸杆菌菌悬液，该乳酸杆菌菌悬液的浓度为5×10⁹ cfu/mL。

将枯草芽孢杆菌YS-45菌种接种到20mL 步骤（2）中制得的LB液体培养基中，在转速为160r/min的摇床上进行培养，其中培养过程中控制温度为37℃，培养时间为18h，得到枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液，该枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液的浓度为5×10⁹ cfu/mL。

将酵母菌S-78菌种接种到20mL 步骤（2）中制得的YPD液体培养基中，在转速为160r/min的摇床上进行培养，其中培养过程中控制温度为30℃，培养时间为18h，得到酵母菌S-78菌悬液，该酵母菌S-78菌悬液的浓度为2×10⁸ cfu/mL。

（4）以步骤（1）中制得的小龙虾加工废弃物干粉为原料，接种乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78，其中乳酸杆菌菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78以菌悬液的形式进行接种，乳酸杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液和酵母菌S-78菌悬液（这三种菌悬液由步骤（3）中的方法培养制得）的接种总量为固体发酵培养原料总质量的20%，且乳酸杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液和酵母菌S-78菌悬液的体积比为2∶2∶1。接种乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78后，加水使发酵体系（固体发酵培养原料）的含水量达到35%，搅拌均匀，置于固态发酵罐中，在温度为28℃下进行固态发酵培养24h，得到小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂。

一种上述本发明实施例中的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂作为原料在制备饲料中的应用。

实施例2

一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法，与实施例1中的制备方法基本相同，区别仅在于：实施例2的步骤（4）中，发酵温度为30℃，接种总量为24%，发酵时间为48h。

取实施例1和实施例2制得的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂、小龙虾加工废弃物（即实施例1的步骤（1）中所用原料），采用高效液相色谱HPLC仪（CBM-10A VP Plus、日本岛津有限公司）检测这三种样品中氨基酸的含量，即为小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量。

本发明实施例1中制得的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量为42.506μg/g，而小龙虾加工废弃物（原料）中氨基酸的含量仅为0.7344μg/g，是小龙虾加工废弃物（原料）中氨基酸含量的57.8785倍。

本发明实施例2中制得的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量为56.274μg/g，是小龙虾加工废弃物（原料）中氨基酸含量的76.6258倍。

综上可知，本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中富含多种氨基酸，其中氨基酸含量高达56.274μg/g，添加到饲料中能够促进动物肠道细胞对营养物质的吸收作用，增强机体的抗氧化和免疫能力，同时改善肌肉营养组成，提高肌肉中风味物质含量；同时，由于小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中还含有多种益生菌（乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78），添加到饲料中能够促进动物生长发育，提高生长性能，调整动物肠道内菌群的平衡，增强机体免疫能力，降低肠道内有害物质的产生。相比传统从虾加工废弃物种直接分离的大分子蛋白质，本发明小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂具有营养价值更高、应用范围更广、经济效益更大等优点，可广泛用于饲料领域，具有较好的经济价值和应用价值。另外，本发明中，采用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78进行协同发酵，既能获得较高的氨基酸产量，又能提高产品的品质，由此产生的效益远远大于单菌种发酵，这是因为单独利用乳酸杆菌对小龙虾加工废弃物进行发酵生产氨基酸时，由于乳酸杆菌产生的蛋白酶活性较低，导致发酵周期较长，氨基酸提取率较低；而单独利用枯草芽孢杆菌YS-45或者酵母菌S-78进行发酵时，虽然能生产大量氨基酸，但是在发酵过程中产品容易产生苦涩味和腥臭味，同时出现腐败现象，严重影响了产品的品质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，其特征在于，所述小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂是以小龙虾加工废弃物为原料通过乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78的协同发酵制得。

2.根据权利要求1所述的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂，其特征在于，所述小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量为42.506μg/g～56.274μg/g。

3.一种小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将小龙虾加工废弃物烘干，粉碎，得到小龙虾加工废弃物干粉；

S2、以步骤S1中得到的小龙虾加工废弃物干粉为原料，接种乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78进行固态发酵培养，得到小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌YS-45和酵母菌S-78以菌悬液的形式进行接种，其中乳酸杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液和酵母菌S-78菌悬液的接种总量为固体发酵培养原料总质量的20%～30%。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液和酵母菌S-78菌悬液的体积比为1.5～2∶1.5～2∶0.8～1。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸杆菌菌悬液的浓度为1×10⁹ cfu/mL～10×10⁹ cfu/mL；所述枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液的浓度为1×10⁹ cfu/mL～10×10⁹ cfu/mL；所述酵母菌S-78菌悬液的浓度为1×10⁸ cfu/mL～10×10⁸ cfu/mL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸杆菌菌悬液的制备方法包括以下步骤：将乳酸杆菌菌种接种到MRS液体培养基中，在温度为37℃～40℃、转速为130r/min～160r/min的条件下活化培养14h～18h，得到乳酸杆菌菌悬液；

所述枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液的制备方法包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌YS-45菌种加入到LB液体培养基中，在温度为35℃～37℃、转速为130r/min～160r/min的条件下活化培养14h～18h，得到枯草芽孢杆菌YS-45菌悬液；

所述酵母菌S-78菌悬液的制备方法包括以下步骤：将酵母菌S-78菌种加入到YPD液体培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为130r/min～160r/min的条件下活化培养14h～18h，得到酵母菌S-78菌悬液。

8.根据权利要求3～7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述烘干为在温度为60℃～80℃烘干至恒重；

所述步骤S2中，所述固体发酵培养过程中保持发酵体系的含水量为30%～40%；所述固体发酵培养过程中控制温度为28℃～30℃；所述固体发酵培养的时间为24h～48h。

9.根据权利要求3～7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂中氨基酸的含量为42.506μg/g～56.274μg/g。

10.一种如权利要求1或2所述的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂或权利要求3～9中任一项所述的制备方法制得的小龙虾加工废弃物微生物发酵制剂作为原料在制备饲料中的应用。