CN109810980A - 一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用。所述核酸适配体其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的核酸适配体可用于食品中的检测芳香族生物胺酪胺，达到快速、准确的目的，该核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。

Description

一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，具体涉及一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用。

背景技术

生物胺(Biogenic amines，BA)是一类具有生物活性、含氮的碱性低分子量有机化合物，普遍存在于多种动植物体内及发酵食品中，主要是通过氨基酸脱羧作用或是醛和酮的胺化和转氨基作用形成的。根据生物胺的化学结构，可将其可以分为三类：脂肪族生物胺(尸胺、腐胺、精胺、亚精胺等)；芳香族生物胺(酪胺、β-苯乙胺等)；杂环族生物胺（组胺、色胺等）。生物胺在多种动植物和微生物体内为正常的活性成分，是合成激素、生物碱和核酸的前体物质，维持着免疫系统的代谢活动和内脏功能。然而，高浓度的生物胺不仅会严重影响食品的口感风味甚至会改变其物质成分，过量外源生物胺的摄入还会对人体产生毒害作用，引起血管和动脉的扩张，致使生物体产生不良反应，如头疼、高血压、腹泻和呕吐等，同时生物胺的协同效应还可以增加中毒症状。生物胺含量还是一些食品新鲜程度和被微生物污染程度的标志，是预测某些食品成熟程度和加工过程是否遵循“良好操作规范”的依据，因此近年来各种食品中生物胺的合成机理、影响因素以及检测手段的改进倍受关注和重视，一些国家对食品中个别生物胺含量还法定了限量标准。

适配体是能特异性识别某种靶标物质且具有高度亲和力的核酸序列（DNA或RNA），通常含有40-100个碱基，与抗体等检测元件相比，不仅容易合成和修饰，靶标分子范围广，涵盖了包括蛋白质、核酸以及其它无机、有机等分子，而且热稳定性好、维持活性的pH值和盐浓度范围广、变性和复性可逆。由于适配体的这些优点，它被广泛应用于疾病诊断和治疗、食品安全检测、分离提取等方面。

适配体筛选的技术被称为配体指数富集系统进化技术(systematic evolutionof ligands by exponential enrichment，SELEX)。自1990年，Gold研究组和Szostak研究组开创这一技术以来，针对不同类型的靶标已开发出了多种SELEX技术。而当涉及到小分子靶标时，通常意味着需要对它们进行化学修饰，然后将其固定在基质上，如磁珠或琼脂糖珠。但是这种化学修饰可能改变靶标的固有结构，导致筛选的适配体亲和力降低。此外，没有足够的位点固定小分子量的靶标。因此，出现了一些不进行靶标固定的筛选技术，包括Capture-SELEX，GO-SELEX ，和切换SELEX。

目前，关于生物胺的检测方法，国内外已经做了相当多的研究，成熟的检测方法主要包含有：液相色谱-质谱联用法(LC-MS或LC-MS/MS )、反相高效液相色谱法(RP-HPLC )、气相色谱法(GC)、离子色谱法（IC）、毛细管电泳法(CE)、酶联免疫法、生物传感器、薄层色谱法(TLC)等。其中气相色谱、液相色谱、质谱、原子吸收方法的灵敏度较高，但是它们对样品前处理的要求很严格，复杂且消耗时间长，不适合现场操作。ELISA技术对目标物表现出很强的特异性，但是假阴性和假阳性结果偏多，样品提取液中的杂质成分对结果干扰大、制备抗体时间长、成本高。毛细管电泳法容易引起溶质的吸附，尤其是对一些生物大分子，并且这种吸附是不可逆的，造成基线不稳，重复性差。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种特异识别酪胺的单链DNA核酸适配体及其应用，为开发针对酪胺的新型分析检测和分离富集脱除净化方法奠定良好基础。

一种特异识别酪胺的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，可用修饰材料对上述核酸适配体进行修饰，所述修饰材料为FAM、巯基基团、FITC或生物素。

上述核酸适配体在制备食品中分离富集酪胺试剂中的应用。

上述核酸适配体在制备食品中酪胺检测试剂中的应用。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以酪胺为靶标，筛选获得一条与靶标高亲和性、高特异结合的适配体TYR-2，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体转为检测探针，用于食品中的检测芳香族生物胺酪胺，达到快速、准确的目的。核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。

附图说明

图1为本发明筛选分离核酸适配体的流程图。

图2为实施例1中得到的熔解曲线， R2-R18分别代表Capture-SELEX筛选过程中的循环轮数。

图3为实施例1中Mfold预测适配体TYR-2的二级结构。

图4为实施例1中适配体TYR-2的饱和结合曲线。

图5为实施例1中适配体TYR-1、TYR-2、TYR-9的特异性分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明首先将随机ssDNA文库通过互补杂交固定在亲和素包被的磁珠表面。然后，在SELEX的分离步骤中有效分离了与靶标结合的ssDNA。通过针对酪胺十八轮筛选后，对获得的ssDNA富集文库进行克隆测序，并采用荧光法分析代表序列的亲和力和特异性。最终，获得了对酪胺具有高亲和力和特异性的核酸适配体。具体过程如图1所示。

实施例1

1、随机ssDNA文库互补杂交和固定

第一轮筛选反应体系为1 mL，将随机ssDNA文库和生物素化的文库互补短链P1按照1：1.5的摩尔比加入到BB缓冲液（50mM Tris-HCl，5mM KCl，100mM NaCl，1mM MgCl₂，pH7.4)中，混匀后于95℃变性处理10min后，于37℃、130rpm条件下振荡孵育3h互补杂交。随后向其中加入一定量的1mg/mL亲和素包被的磁珠溶液在37℃、130rpm下反应6h，通过亲和素-生物素的特异性作用，使ssDNA文库固定在磁珠上。ssDNA固定化的磁珠采用BB缓冲液清洗10次以上，以去除非特异性结合的ssDNA，

2、靶标与随机ssDNA文库的孵育与分离

ssDNA固定化的磁珠溶液与靶标（酪胺，初始浓度为0.1 mmol/L）在37℃下孵育2h，与靶标特异性结合的ssDNA从磁珠上解离下来，形成ssDNA-靶标复合物。在外加磁场作用下，得到能与靶标结合的ssDNA文库，以此作为模板进行PCR扩增。

3、PCR扩增、纯化及ssDNA单链制备

50μL PCR扩增反应体系为：超纯水41.5μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP (5 nmol/L) 1μL，上游引物 (10μmol/L)0.5μL，下游磷酸化引物 (10μmol/L) 0.5μL，模板1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火 30s，72℃延伸30s，PCR循环数为大约20次（每一轮筛选中对PCR循环次数进行优化），然后72℃延伸5min，最后4℃冷却。PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳及Bio-Rad凝胶成像仪检测扩增结果后，用PCR产物纯化试剂盒纯化。用NanoDrop-2000超微量分光光度计测定纯化的PCR产物的核酸浓度。然后加入一定量的Lambda核酸外切酶于37℃反应30- 60min，75℃灭酶10min，以消化5′端磷酸基团修饰的DNA链，制备ssDNA。酶切产物采用含7M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证酶切完全后，用酚/氯仿法进行纯化。将纯化后得到的ssDNA单链溶于40μL TE缓冲液并利用NanoDrop-2000超微量分光光度计定量后作为次级文库用于下一轮筛选。

4、循环筛选

第二轮至第十八轮按照第一轮方法进行筛选，筛选反应体系为300μL。为增加筛选压力，提高筛选得到的适配体的亲和性，随着筛选轮数的增加，ssDNA次级文库和靶标的用量逐渐减少(ssDNA次级文库用量由第二轮的100pmol逐渐减少到第十八轮的10pmol，靶标用量由最初的100μM逐渐减低到 30μM、孵育时间由最初的2h缩减到30min。为提高适配体的特异性，从第五轮开始每隔一轮用靶标的结构类似物进行反向筛选，以去除能与这些物质结合的ssDNA。所用的反筛物质包括：β-苯乙胺、组胺、色胺、酪氨酸、苯丙氨酸、多巴胺盐酸盐。ssDNA文库固定化磁珠先加入反筛物质孵育清洗后再与靶标孵育结合。

5、熔解曲线

随着筛选的进行，得到的ssDNA文库的复杂程度降低，文库Q-PCR扩增后的熔解曲线的溶解温度Tm值会提高。因此将筛选得到的ssDNA次级文库进行Q-PCR以监测文库的富集程度。根据制造商的方案在Applied Biosystems 7900HT序列检测系统中使用SYBR greenPCR master mix（20μL反应体积）进行Q-PCR扩增，熔解曲线从7900 v2.4软件获得，并用作筛选富集的指标。

溶解温度取决于双链体的内部结构和稳定性。 PCR过程中形成异源双链和同源双链，其比例反映文库中序列的复杂度。随着筛选的进行，文库模板复杂度越低，形成更多的同源双链使PCR产物的溶解温度越高。如图2所示，第2-18轮ssDNA文库的溶解温度随着轮数的增加而增加，溶解温度在第18轮达到最大值，表明文库的富集程度已达到饱和。因此，筛选进行了18轮。

6、克隆测序及序列分析

筛选十八轮后，将针对酪胺筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增，将PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行克隆测序。最后获得40条序列，采用DNAMAN V6和Mfold分析40条序列的同源性信息以及二级结构。结合两种软件分析结果将序列分为几个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，自由能（△G）较低的序列共9条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端标记FAM的适配体，用于亲和力和特异性分析。图3为Mfold预测适配体TYR-2的二级结构。

7、适配体亲和力与特异性分析

7.1、亲和力分析

基于氧化石墨烯氧化具有吸附单链DNA的特性，构建了荧光法分析每条序列对靶标的亲和力。在200μL体系中，将10μM的靶标分别与梯度浓度(10、25、50、75、100、150、200nM)的ssDNA混合，37℃避光孵育1h，并以 BB缓冲液代替靶标作为阴性对照组。然后，加入最佳用量比的GO吸附未与靶标结合的适配体，继续避光孵育30min，离心操作后取上清液，用Biotek Synergy H1测定485nm激发下520nm发射的荧光强度。实验组和对照组均做3次重复实验。采用GraphPad Prism 5软件，以ssDNA浓度为横坐标，实验组和对照组的荧光差值(ΔF)为纵坐标进行非线性拟合，绘制饱和结合曲线图（见图4），并计算各ssDNA的解离常数Kd值，结果如表1所示。从中选择Kd值较小，即与靶标亲和力较强的ssDNA进行特异性分析。

表 1 挑选出的ssDNA序列的解离常数Kd值

7.2、特异性分析

根据亲和力分析的结果，选择与酪胺具有较高亲和力的TYR-1、TYR-2、TYR-9，采用荧光法进行特异性分析。在200μL体系中, 200nM ssDNA 分别与酪胺、β-苯乙胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组胺、色胺、多巴胺盐酸盐各10μM混合，并以BB缓冲液代替靶标作为阴性对照组，37℃避光孵育1h。然后加入GO，继续避光孵育30min，吸附未与靶标结合的适配体，离心分离取上清液。实验组和对照组均做3次重复实验。上清液用Biotek Synergy H1测定荧光强度，计算相对荧光比率，相对荧光比率＝ΔF_target/ΔF_counter，其中ΔF_target和ΔF_counter分别表示靶标和其他反筛物质的相对荧光强度；相对荧光强度＝F-F₀，其中F和F₀分别表示实验组和对照组的荧光强度。结果如图5所示，TYR-2与酪胺的结合能力都明显强于它们与其他反筛物质的结合能力，且表现出显著的特异性。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种特异识别生物胺的核酸适配体及其应用

<130> 20190201

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataggagtca cgacgaccag aggtgttaag cacatagctg aatcttggaa aggttatcgg 60

tatgtgcgtc tacctcttga 80

Claims (4)

1. 一种特异识别酪胺的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：可用修饰材料对所述核酸适配体进行修饰，所述修饰材料为FAM、巯基基团、FITC或生物素。

3.权利要求1所述的核酸适配体在制备食品中分离富集酪胺试剂中的应用。

4.权利要求1所述的核酸适配体在制备食品中酪胺检测试剂中的应用。