CN109810538A

CN109810538A - 一种线粒体定位染料及其制备方法和应用

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Publication number: CN109810538A
Application number: CN201910106631.4A
Authority: CN
Inventors: 沈健; 周林; 钟秀丽
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2039-02-02
Also published as: CN109810538B

Abstract

本发明公开了一种线粒体定位染料及其制备方法和应用。所述染料分子其结构式如式（I）所示：。本发明以吡啶盐为母体设计得到线粒体定位染料分子，吡啶盐既可作为线粒体定位基团又可作为水溶性基团，产物具有优异的量子效率（以硫酸奎宁为基准16%），并能实现肺癌细胞中线粒体定位研究。与已经商品化的分子相比，本发明的产品具有制备成本低、产率高、后处理简单、光学性能优异等优点，实际的应用价值高。

Description

一种线粒体定位染料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种线粒体定位染料及其制备方法和应用。

背景技术

线粒体是大都数细胞中一类重要的细胞器，直径在0.5到10μm。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，细胞生命活动所需的能量95％来自线粒体，因此又有“细胞动力工厂”之称。此外线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。大量研究表明，线粒体的数量、分布、结构与功能变化等与神经退行性病变(如阿尔兹海默症、帕金森症)、代谢型疾病(如肥胖症、II型糖尿病)、心血管疾病及癌症等病症关系密切。线粒体被冠以“细胞信号传导细胞器”和“细胞死亡之马达”等称号，与之相关的“线粒体学”已经成为生命科学和医学等领域的研究热点。光化学方法是研究线粒体的一类重要方法其相关定位基团的开发成为研究热点。经数十年的发展，线粒体定位基在制备上有了一定的发展但合成步骤复杂，灵敏度不高、斯托克位移小(Cy5)等缺点依然存在(CN 105018074 A)商业化进程缓慢。

发明内容

本发明的目的是针对现有线粒体定位基存在的制备复杂、产率低、灵敏度不高、斯托克位移小等缺点，通过识别基团、信号基团、连接基团的筛选及分子结构、位置关系设计得到一种线粒体定位染料，该染料分子具有制备成本低、产率高、后处理简单、光学性能优异的优点。

技术方案：一种线粒体定位染料，其结构式如式(I)所示：

上述线粒体定位染料分子的分子式为C₁₈H₂₁IN₂O，化学名称为(E)-1-甲基-4-(4-吗啉基苯乙烯基)吡啶-1-碘化物，英文名称为(E)-1-methyl-4-(4-morpholinostyryl)pyridin-1-ium iodide。

上述线粒体定位染料的制备方法，包括如下所示的反应步骤：

在碱存在下，化合物(II)和化合物(III)通过克洛文盖尔反应得到化合物(I)；

其中，化合物(II)通过以下反应制得：

进一步地，反应温度不低于60℃。

进一步地，所述碱选自三乙胺、六氢吡啶或哌啶。

进一步地，化合物(II)和碱的摩尔比为60-90：1。

上述线粒体定位染料在细胞线粒体定位中的应用。

有益效果：本发明以吡啶盐为母体设计得到线粒体定位染料分子，吡啶盐既可作为线粒体定位基团又可作为水溶性基团，产物具有优异的量子效率(以硫酸奎宁为基准16％)，并能实现肺癌细胞中线粒体定位研究。与已经商品化的分子相比，本发明的产品具有制备成本低、产率高、后处理简单、光学性能优异等优点，实际的应用价值高。

附图说明

图1为实施例4的染料分子的紫外吸收及荧光发射谱图。

图2为实施例4的染料分子的细胞毒性试验结果。

图3为实施例4的染料分子的细胞成像图，其中：a为明场通道成像、b为红色通道成像、c为绿色通道成像、d为复合通道。

图4为实施例4的染料分子与tracker-blue在细胞中线性区域的强度分部，其中：B为染料分子、C为tracker-blue。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限定本发明的保护范围。

本发明提供的线粒体定位染料如式(I)所示：

其制备方法包括如下所示的反应步骤：

在碱的存在下，式(II)化合物和式(III)化合物通过克洛文盖尔反应得到式(I)化合物。

式(II)化合物为吡啶盐衍生物，具体是以4-甲基吡啶和碘甲烷为起始原料，通过一步反应制备得，反应式为：

具体包括如下步骤：

S1：混合有机溶剂、弱碱、式(II)化合物和式(II)化合物；

S2：加热S1所得反应体系，升温至反应温度，经后处理得式(I)化合物；

其中，反应温度不低于60℃，反应温度为60℃～回流温度，回流温度取决于反应体系中各组分(包括溶剂、反应物和弱碱)的沸点以及共沸关系，具体温度点值为60℃、70℃、80℃、90℃或者低于回流温度的更高的温度点值，优选反应温度为80℃。

制备方法中，式(II)化合物和式(III)化合物的摩尔比并无特别的限定，优选摩尔比为1:1。

制备方法中，反应结束后的后处理方式并无特别的限定，本领域技术人员可依据物料的理化性质，结合公知常识的分离手段，采用常规的有机分离手段来实现目标产物的分离。优选的技术方案为，所述分离的方式为重结晶分离。

优选的技术方案为，弱碱为选自三乙胺、六氢吡啶、哌啶中的至少一种。

制备方法中，溶剂并无特别的限定，例如有机溶剂可为苯、甲苯、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、二氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、正己烷、四氢呋喃(THF)、甲醇、乙醇等中的一种或至少两种的混合溶剂。优选的有机溶剂为乙腈。

反应体系中式(II)化合物与弱碱的摩尔比为(60～90)：1。上述比值包括但不限于60:1、70:1、80:1或90：1等位于上述比值区间范围内的点值，优选的式(II)化合物与弱碱的摩尔比为80:1。

制备方法中，可通过TLC(薄层色谱法)板监测反应终点，反应时间无特别的限定，包括但不限于8-16h，具体的反应时间为8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h或更长时间点值，优选为10～12h。

在本发明中采用将反应液先减压蒸馏除去溶剂旋干后，获得粗品化合物，进一步的，进一步用乙醇重结晶得到纯品化合物。

在本发明中，式(II)化合物的具体制备过程为：称取0.93g(10mmol)4-甲基吡啶，1.42g(10mmol)碘甲烷于30mL乙腈中，85℃下搅拌至用TLC检测到原料点消失，冷却至室温，将溶液缓慢倒入水中，过滤得固体，用庚烷重结晶，得到棕色固体(2.02g,86.1％)。式(II)化合物核磁共振氢谱表征：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)8.82-8.84(d,2H),7.95-7.97(d,2H),4.5(3H),2.4(s,3H)。

实施例1

向反应瓶中加入式(II)和式(III)化合物各10mmol、乙腈20mL搅拌并加热回流，TLC追踪。反应10h后冷却，旋干溶剂后析出固体，乙醇重结晶得到红色固体，收率62.5％。

实施例2

向反应瓶中加入式(II)和式(III)化合物各10mmol、0.1mmol的三乙胺、20mL乙腈搅拌，并加热回流，TLC追踪。反应10h后冷却，旋干溶剂，固体乙醇重结晶得到红色固体，收率70.3％。

实施例3

向反应瓶中加入式(II)和式(III)化合物各10mmol、0.1mmol的六氢吡啶、20mL乙腈搅拌，并加热回流，TLC追踪。反应10h后冷却，旋干溶剂，固体乙醇重结晶得到红色固体，收率78.4％。

实施例4

向反应瓶中加入式(II)和式(III)化合物各10mmol、0.1mmol的哌啶、20mL乙腈搅拌，并加热回流，TLC追踪。反应10h后冷却，旋干溶剂，固体乙醇重结晶得到红色固体，收率87.1％。

实施例5-8

实施例5-8基于实施例4，区别在于反应温度，其他工艺参数相同，反应收率见下表：

实施例	温度(℃)	对应实施例	产物收率(％)
				实施例5	60	实施例4	67.8
实施例6	70	实施例4	80.5
				实施例7	80	实施例4	88.1
实施例8	回流(90℃)	实施例4	87.1

实施例9-12

实施例9-12的工艺参数基于实施例4，区别在于化合物(II)和弱碱的摩尔比，反应收率见下表：

实施例	n<sub>(II)</sub>：n<sub>弱碱</sub>	对应实施例	产物收率(％)
				实施例9	60:1	实施例4	74.1
实施例10	70:1	实施例4	75.6
				实施例11	80:1	实施例4	88.2
实施例12	90:1	实施例4	85.4

对实施例1-12所制备得到的红色固体物质进行结构表征和性能测试：

1、化合物的结构确认

实验仪器：X-4显微熔点测定仪；Bruker公司AVANCE III-400型核磁共振仪，CHCl₃为溶剂，TMS为内标；双聚焦VG-ZAB-HS型质谱仪；

经仪器检测确定实施例1-14所制备得到的化合物均为相同的产物，即本发明式(I)化合物，其各结构确认参数如下所示：

核磁共振氢谱：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.75(d,J＝6.6Hz,2H),8.10(d,J＝6.3Hz,2H),7.93(d,J＝16.2Hz,1H),7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.28(d,J＝16.2Hz,1H),7.05(d,J＝8.9Hz,2H),4.20(s,3H),3.84-3.64(m,4H).

质谱(EMI-MS)：m/z 409.31[M+1]⁺。

2、式(I)化合物的紫外吸收光谱和荧光发射光谱测试

实验仪器：Varian公司Cary50紫外-可见光谱仪和Cary Eclipse荧光分析仪；

实验步骤：取4.08mg实施例4制备的红色固体溶于10mL水中，搅拌均匀，得到浓度为1mmol/L的待测液，紫外吸收波长扫描范围200-800nm，荧光光谱设置条件如下：激发波长480nm，采集范围500-750nm。

如图1所示，在480nm光激发下，该材料在水溶液中的荧光发射波长为614nm，呈明亮的红色量子效率达15％，是一类优良的红光分子。

3、式(I)化合物的细胞性能测试

将浓度为1×10⁶个/mL的肺癌细胞培养在含有10％牛胎血清、50unit/mL青霉素和50μg/mL链霉素的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基中，置于37℃、通CO₂的细胞培养箱内。实验前24h，将细胞接种到6孔培养皿中的无菌玻璃盖玻片上，用培养基稀释至浓度为1×10⁴个/mL。细胞用含有10μmol/L FD的培养基在37℃下孵育30min。荧光成像前，细胞用0.10mol/L PBS溶液(pH 7.4)再洗涤3次。观察物镜放大倍数为40倍，激发波长为488nm。

MTT法被用于细胞毒性测试，将肺癌细胞置于96孔板，维持浓度约90μL well^-1加入不同浓度的实施例4制得的化合物(20、40、60、80、100μg.mL^-1)在5％CO₂及37℃条件下孵化24小时。将1mg/mL MTT溶液分别加入每空中，在孵化4小时，除去培养基加入150μL二甲亚砜，混匀15分钟用酶标仪测吸光度。如图2所示，细胞在10μM浓度下依然保持95％的成活率，表明该化合物具有低毒性。

将实施例4制得的化合物和商业化的线粒体定位分子tracker blue在肺癌细胞中共同孵化。如图3和图4所示，两个分子在肺癌细胞的绿色和红色通道中线性区域及强度分布很接近，说明本发明的染料分子与线粒体有很强的亲和性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种线粒体定位染料，其特征在于：其结构式如式（I）所示：

。

2.权利要求1所述的线粒体定位染料的制备方法，其特征在于：包括如下所示的反应步骤：

，

在碱存在下，化合物（II）和化合物（III）通过克洛文盖尔反应得到化合物（I）；

其中，化合物（II）通过以下反应制得：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：反应温度不低于60℃。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述碱选自三乙胺、六氢吡啶或哌啶。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：化合物（II）和碱的摩尔比为60-90：1。

6.权利要求1所述的线粒体定位染料在细胞线粒体定位中的应用。