CN109810176A - 用于治疗非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化的脂联素受体-1及受体-2的双激动剂肽 - Google Patents
用于治疗非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化的脂联素受体-1及受体-2的双激动剂肽 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化的脂联素受体‑1及受体‑2的双激动剂肽及包含其的药物组合物，该双激动剂肽包含氨基酸序列：P‑X2‑L‑Y‑X5‑F‑X7；其中X2、X5及X7中至少一个为非天然氨基酸，P为脯氨酸，L为亮氨酸，Y为酪氨酸。本明的脂联素受体‑1及脂联素受体‑2的双激动剂肽能够有效治疗非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化，同时具有良好的生物学活性、良好的稳定性、易于放大生产、成本低、低毒性，安全窗口大、用量小等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一类脂联素受体-1及脂联素受体-2的双激动剂肽；本发明还涉及上述双激动剂肽在非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化等相关疾病的预防和/或治疗中的用途。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括非酒精性单纯性肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。NAFLD不仅可以导致肝病、残疾和死亡，还与代谢综合征、2型糖尿病、动脉硬化性心血管疾病及结直肠肿瘤等的高发密切相关。
脂联素作为脂肪细胞补体相关蛋白，由244个氨基酸组成，分为球状域、胶原域、可变域和氨基末端信号序列4个区域。球状域为生物活性的关键部位。脂联素受体-1在全身组织中均有表达，脂联素受体-2特异表达于肝脏中。脂联素通过与脂联素受体结合，对机体的糖脂代谢、胰岛素抵抗、炎症反应、氧化应激等发挥重要的调节作用，此外，脂联素还与动脉粥样硬化、糖尿病、肝肾疾病等代谢性疾病关系密切。脂联素与脂联素受体-1结合，通过激活AMPK通路(AMPK是腺苷酸激活蛋白激酶的简称)，增加葡萄糖的摄取，促进脂肪的β氧化。脂联素与脂联素受体-2结合，通过激活PPARα增加机体对脂肪酸和能量的消耗。具体的机制包括：增加乙酰辅酶A羧化酶的磷酸化、增加脂肪酸消耗、增加葡萄糖摄取率、增加肌细胞产生乳酸。
脂联素受体-1和脂联素受体-2激动剂通过与脂联素受体结合起作用，显示出有效的减轻体重的功能。脂联素(及其受体)信号通路涉及脂肪酸的氧化过程，提升糖的摄取水平，缓解胰岛素抵抗，调节血管内皮细胞炎症应答，阻遏巨噬细胞转化为泡沫细胞等，临床上其和肥胖、代谢综合征、2型糖尿病及心脑血管疾患紧密相关。脂联素相关信号通路间相互串话的网络研究是靶点药物研究的关键。然而在报道中用于治疗非酒精性脂肪肝炎和肝纤维化的药物中，并没有针对脂联素受体-1和脂联素受体-2为靶点的多肽药物开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂联素受体-1及脂联素受体-2的双激动剂肽，能够显著治疗非酒精性脂肪肝炎和肝纤维化等疾病。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：一种脂联素受体-1及脂联素受体-2的双激动剂肽，其包含氨基酸序列：P-X2-L-Y-X5-F-X7；其中X2、X5及X7中至少一个为非天然氨基酸，P为脯氨酸，L为亮氨酸，Y为酪氨酸。
氨基酸中20种天然氨基酸以外的氨基酸统称为非天然氨基酸，非天然氨基酸相比天然氨基酸具有性质稳定、半衰期长的优点。在现有蛋白或肽的基础上引入非天然氨基酸，能够得到位点特异性修饰的重组蛋白或肽。P-X2-L-Y-X5-F-X7是以现有多肽Pep70(结构序列：PGLYYFD)为基础的合成肽，多肽Pep70能够通过结合脂联素受体-1，激活下游的AMPK信号通路，发挥调节糖脂代谢的作用。
优选的，X2为非天然氨基酸。
优选的，X2是正缬氨酸。
优选的，X5为酪氨酸或丝氨酸。
优选的，X7为丙氨酸或天冬氨酸。
优选的，氨基酸序列中的脯氨酸由氢或乙酰基修饰。
优选的，氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为酪氨酸，X7为丙氨酸。
优选的，氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为酪氨酸，X7为天冬氨酸。
优选的，氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为丝氨酸，X7为天冬氨酸。
优选的，氨基酸序列中的脯氨酸由乙酰基修饰，X2是正缬氨酸，X5为丝氨酸，X7为丙氨酸。
本发明还提供了脂联素受体-1及脂联素受体-2的双激动剂肽在治疗非酒精性脂肪肝炎及其适应症、肝纤维化及其适应症及靶向为脂联素受体-1和脂联素受体-2的适应症中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，含有本发明所述双激动剂肽以及与所述双激动剂肽关联的异源物质。
优选的，所述异源物质为蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇、生物素、白蛋白、人血清白蛋白、人血清白蛋白重组蛋白结合部分、抗体、抗体结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非FnIII支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子中的一种或多种的组合。异源物质的物质比较多，可以从其特性进行分类描述：第一，异源物质为机聚合物，无机聚合物，聚乙二醇或接头时，双激动剂肽的氨基酸被上述异源物质标记，可以通过修饰该异源物质达到修饰双激动剂肽的目的，增加其稳定性、水溶性等药理学活性；第二，异源物质为抗体或抗体相关片段时，能提高双激动剂肽的靶向性，增加其激活受体的作用。第三，异源物质为细胞因子时，能拓展该双激动剂肽的应用范围，即能发挥除了激动脂联素受体1和脂联素受体2的作用以外的效应。
本明的脂联素受体-1及脂联素受体-2的双激动剂肽能够有效治疗非酒精性脂肪肝炎及肝纤维化，同时具有良好的生物学活性、良好的稳定性、易于放大生产、成本低、低毒性，安全窗口大、用量小等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中各组的细胞活性百分比；
图2为实施例3中各组的油红O染色照片；
图3为图2的染色照片对应的染色百分比；
图4为实施例3中各组对应的人肝星状细胞LX-2中提取的α-SMA和GAPDH的WesternBlot电泳照片；
图5为与图4对应的各组的α-SMA/GAPDH相对表达量；
图6为实施例5中给药3周后各组小鼠的体重情况；
图7为实施例5中给药3周后各组小鼠的肝脏谷丙转氨酶水平；
图8为实施例5中给药3周后各组小鼠的HE染色结果；
图9为图8的染色面积比例；
图10为实施例5中给药2周后各组小鼠的糖耐受量；
图11为图10的各曲线下面积；
图12为实施例5中给药3周后各组小鼠的胰岛素耐受量；
图13为图12的各曲线下面积；
图14为实施例5中给药3周后各组小鼠的糖原染色结果；
图15为图14的染色面积比例；
图16为实施例5中给药3周后各组小鼠的肝细胞内脂滴的油红O染色结果；
图17为图16的染色面积比例；
图18为实施例6中给药3周之后各组小鼠的HE染色结果；
图19为图18的染色面积比例；
图20为实施例6中给药3周之后各组小鼠的天狼星红染色结果；
图21为图20的染色面积比例；
图22为实施例6中给药3周后各组小鼠的α-SMA蛋白免疫组织化学染色结果；
图23为对图22的染色面积比例；
图24为实施例6中给药3周之后Col1α1蛋白免疫组织化学染色结果；
图25为图24的染色面积比例；
图26为实施例6中药3周之后各组小鼠的CD68免疫组化染色结果；
图27为图26的染色面积比例；
图28为实施例5中给药3周后各组小鼠体内PPARa、pAMPK、AMPK、GAPDH等蛋白的表达情况；
图29为图28中各组PPARa/GAPDH和pAMPK/AMPK相对表达量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市场购获得。
实施例1、双激动剂肽的合成
材料：所有的氨基酸购自NovaBiochem公司；
如果没有特别说明，其他所有试剂均为分析纯，购自Sigma公司；
采用Protein Technologies PRELUDE 6通道合成肽合成仪；
Phenomenex Luna C18制备柱(46mm x 250mm)用来纯化合成肽；
高效液相色谱仪为Waters公司产品；
质谱分析采用Agilent质谱仪进行测定。
以化合物Pep70(结构序列：PGLYYFD-NH2)为例说明本发明双激动剂肽的合成方法。
a)主肽链的组装：
按照Fmoc/t-Bu策略在CS336X合成肽合成仪(美国CS Bio公司)上合成0.25mmol规模的如下合成肽：Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-Asp(t-Bu)-rink amide树脂。
b)1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基(ivDde)的脱除与亲脂取代基的引入：
用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)＝1∶1(体积比)的溶液中将树脂洗涤两次，加入新鲜制备的3.0％的肼水合物N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，将该反应混合物在室温下振荡10～30分钟进行阱处理步骤，然后过滤。
c)合成肽全保护的脱除与纯化
冰乙醚洗涤沉淀切割后的合成肽，进行高效液相色谱纯化。
基于以上合成步骤，并经过修饰，依次合成如表1所示的双激动剂肽：
表1、实施例1所合成的双激动剂肽结构：
| 序列编号 | 氨基酸序列 |
| A1 | H-P(Nva)LYYFA |
| A2 | H-P(Nva、)LYYFD |
| A3 | H-P(NVa)LYSFD |
| A4 | Ac-P(NVa)LYSFA |
表1中涉及到的三字符号或单字符对应的氨基酸：脯氨酸-P；亮氨酸-L；酪氨酸-Y；苯丙氨酸-F；天冬氨酸-D；丙氨酸-A；丝氨酸-S；正缬氨酸-Nva。另外H为氢：Ac为乙酰基。
实施例2、将实施例1得到的双激动剂肽作为受试物进行的细胞毒性评价
选用人肝星状细胞LX2细胞株，研究并观察受试物对LX2细胞增殖和毒性情况的检测。
将LX2细胞接种到96孔板，用DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗培养基(Thermo Fisher)进行培养，在37℃，5％CO2条件下待细胞生长至70％汇合时，加入不同浓度的受试物，孵育48h后，加入CCK8试剂，在450nm波长下检测吸光度。
图1为各组的细胞活性百分比，图1表明，在0–1024μM浓度范围内，显示受试细胞均保持较高、且基本相同水平的细胞活性，细胞活性并未收到影响，表明受试物对细胞无显著毒性。
实施例3、将实施例1得到的Pep70及双激动剂肽A1-A4作为受试物进行脂肪肝的体外抑制效应实验
选用人肝细胞癌HepG2细胞株，研究并观察受试物对棕榈酸(palmitic acid，简称PA)诱导的HepG2细胞脂肪累积情况的改善。
将HepG2细胞铺板于6孔板，用DMEM(高糖)+10％FBS+1％双抗培养基(ThermoFisher)进行培养，在37℃，5％CO2条件下待细胞生长至70％汇合时，使用终浓度为0.25mM的棕榈酸(palmitic acid，简称PA)诱导HepG2细胞24h，随后加入100μM受试物，对照组加入同等体积的DMEM，作用24h之后，进行油红O染色，检测药物对脂肪变性细胞的作用。
图2为受试物与对照组的油红O染色照片，染色区域即脂滴累积区域，染色区域面积越小，表明脂肪积累越少；图3为利用Image J图像处理软件对图2的油红O染色照片进行分析得出的染色百分比；由图2和图3可知，受试物与对照组分别作用于PA诱导的细胞之后，受试物能够很好的改善HepG2细胞的脂肪变性，抑制脂滴在肝脏中的积累，其中，A1组染色区域比例最低，显示出最好的抑制脂肪累积的效果。
实施例4、将实施例1得到的双激动剂肽作为受试物进行肝纤维化的体外抑制效应实验
选用人肝星状细胞株LX-2，研究并观察不同剂量受试物对LX-2细胞活化标志物α-SMA表达量的影响。
将人肝星状细胞LX-2铺板于35mm细胞培养皿，用DMEM(高糖)+10％FBS+1％双抗培养基(Thermo Fisher)进行培养，在37℃，5％CO2条件下待细胞生长至70％汇合时无血清过夜，翌日早上，用受试物(溶于PBS)处理24小时后提取细胞蛋白，进行Western Blot，以GAPDH为内参，以Image J 1.50i灰度分析α-SMA和GAPDH的表达量。阴性对照组仅加入与受试物相同体积的DMEM。
图4为对照组和受试物作用的人肝星状细胞LX-2中提取的α-SMA和GAPDH的Western Blot电泳照片，其中电泳照片染色颜色越少，蛋白表达量越低；图5为利用Image J1.50i软件对图5进行灰度分析得到的α-SMA/GAPDH相对表达量数据；由图4和图5可知，A1显示出最好的抑制α-SMA表达的效果，其他受试物相比对照组也具有不同程度抑制α-SMA表达的效果。
实施例5、将实施例1得到的双激动剂肽A1作为受试物对HFD(高脂饮食high fatdie,简称HFD)诱导的小鼠脂肪肝的改善治疗作用实验。
1、受试物：双激动剂肽A1。保存条件-20℃。
2、将18只雄性C57BL/6J小鼠，周龄6周，由中山大学实验动物中心提供，随机分为3组，每组6只
1组)普通饲料对照组(SD组)；腹腔注射生理盐水；
2组)高脂饲料对照组(HFD组)；腹腔注射生理盐水；
3组)高脂饲料实验组(A1组)；腹腔注射500μg/kg双激动剂肽A1；
3、实验小鼠在高脂饲料或普通饲料培养12周后，对小鼠进行给药(双激动剂肽A1)或给生理盐水处理，给药后两周进行葡萄糖耐受实验(OGTT)，在给药三周后，进行胰岛素耐受实验(ITT)。给药4周后取材，进行血清学指标检测及病理观察。
4、实验结果：HFD诱导的小鼠培养12周后，其表现特征为：肥胖，胰岛素抵抗，高糖血症，血脂异常和肝脏脂肪空泡样变性等。
1)给药4周治疗后，各组小鼠的体重情况如图6所示，各组小鼠的肝脏谷丙转氨酶水平如图7所示，实验结果表明：A1组小鼠，体重降低明显，肝脏谷丙转氨酶水平。
2)在给药4周之后，处理小鼠进行取材，通过眼球后静脉取血进行血清学指标检测，取肝脏组织用于病理学分析。图8为三组的HE染色照片，图9为利用Image J 1.50i软件对图8进行灰度分析得到空泡面积比例；图8和图9显示A1组小鼠的肝细胞空泡样变相对于HFD组小鼠显著减轻。
3)图10为各组在给药2周结束后各组小鼠的糖耐受量；图11为图10中各曲线下面积，结果表明A1组小鼠的糖耐受情况相对于HFD组小鼠得到改善；
图12为给药3周时，各组小鼠的胰岛素耐受量，图13为图12中各曲线下面积，由图12、图13可知，A1组小鼠的胰岛素抵抗情况相对于HFD组小鼠得到改善。
在胰岛素抵抗存在的情况下，葡萄糖合成增加，糖酵解减少，糖原会储存在肝脏中，导致肝脏中糖原积累。图14为给药3周后糖原染色(PAS染色)结果，图15为利用Image J1.50i软件对图14中染色照片分析得到染色面积比例；图14和图15表明HFD组的肝组织中存在明显的糖原累积，而在A1组小鼠在A1治疗之后，糖原明显减少。
5)图16为给药3周后各组小鼠的肝细胞内脂滴的油红O染色结果，图17为利用Image J 1.50i软件对图16分析得到的染色面积比例，图16和17显示HFD诱导的小鼠的肝内脂滴聚集情况在A1理疗后得到显著改善。
6)图28为给药3周后各组小鼠体内PPARa、pAMPK、AMPK、GAPDH等蛋白的表达情况；图29为各组PPARa/GAPDH和pAMPK/AMPK相对表达量；图28-图29可知，在高脂诱导的脂肪性肝炎小鼠中，给予双激动剂肽A1治疗后，肝脏腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)的活化增加，说明有脂联素受体-1介绍的信号通路被激活；肝脏内PPARα的表达增加，说明由受体-2介导的信号通路被激活；由AMPK和PPARα信号通路的活化可证明。
由以上结果可知，本申请的双激动剂肽A1能够同时激活脂联素受体-1及受体-2，发挥双激动剂的效应；能治疗由HFD导致的肝脏脂肪空泡样变性及非酒精性脂肪性肝炎。
5、使用的实验方法为：
OGTT:小鼠过夜禁食后，腹腔注射A1(500μg/kg)或者同等体积的生理盐水。4h之后，按照2g/kg灌胃葡萄糖(浓度为400mg/ml)，在灌胃葡萄糖后，小鼠尾巴尖部取血，检测0、15、30、60和120min的血糖水平。
ITT:OGTT测完一周之后，小鼠禁食5h，然后腹腔注射A1(500μg/kg)或者同等体积的PBS，并记录此时的血糖水平。1h后，按照0.25U/kg腹腔注射胰岛素，记录0、15、30、60和120min的血糖水平。
HE染色：取石蜡包埋的组织切片，60℃烘1h。脱蜡水化：二甲苯20min→二甲苯20min→无水酒精15min→无水酒精15min→95％酒精10min→90％酒精5min→80％酒精5min。染色：苏木精7min→自来水冲洗干净→1％盐酸乙醇分化1s→自来水冲洗→伊红染色15–20s→自来水冲洗。脱水透明：75％酒精1s→85％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精1s→二甲苯1s→二甲苯1s。封片晾干30分钟，树胶封片。
PAS染色：流水冲3min→高碘酸氧化5min→双蒸水涮30s→Schiff试剂滴染15min(切片变成微粉红)→自来水冲洗5min→苏木素1min→水洗5min→脱水，干燥，封片。
实施例6、将实施例1得到的双激动剂肽A1作为受试物进行对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的改善治疗作用实验
1、双激动剂肽A1，保存条件-20℃。将18只雄性C57BL/6J小鼠，周龄8周，由中山大学实验动物中心提供，随机分为3组，每组6只：
1组)玉米油组(Corn Oil组)：腹腔注射生理盐水；
2组)CCl4诱导对照组(CCl4组)：腹腔注射生理盐水；
3组)CCl4诱导实验组(A1组)：腹腔注射生理盐水。
2、实验小鼠在玉米油或CCl4处理3周后，对小鼠进行给药(双激动剂肽A1)或给生理盐水处理，在给药三周后取材，进行血清学指标检测及病理观察。
3、实验结果：
在CCl4诱导3周后的小鼠现特征为：中央静脉区域周围有炎性细胞浸润，肝细胞水肿变性，汇管区及肝小叶间隔有大量胶原纤维沉积等。
1)在给药3周之后，处理小鼠进行取材，通过眼球后静脉取血进行血清学指标检测，取肝脏组织用于病理学分析。图18为给药3周之后各组HE染色结果，结果表明小鼠由CCl4处理而出现炎性细胞浸润，细胞坏死的情况在A1给药后有显著的改善；图19为给药3周之后各组肝脏谷丙转氨酶水平，结果表明；图在A1治疗后小鼠的肝脏谷丙转氨酶水平降低。
3)图20为在给药3周之后各组小鼠的天狼星红(Sirius Red)染色结果，图21为利用Image J 1.50i软件对图20分析得到的染色面积比例，图20和图21表明由CCl4处理而出现的汇管区及肝小叶间隔有大量胶原纤维沉积的情况在A1给药治疗后有显著的减轻。
4)图22为给药3周之后各组小鼠的α-SMA蛋白免疫组织化学染色结果，图23为利用Image J 1.50i软件对图22分析得到的染色面积比例；
图24为给药3周之后各组小鼠的Col1α1(Collagen1α1)蛋白免疫组织化学染色结果，图25为利用Image J 1.50i软件对图24分析得到的染色面积比例；
图22–图25表明CCl4组小鼠α-SMA及Col1α1蛋白免疫组织化学染色阳性表达于汇管区纤维间隔及靠近纤维间隔的肝窦成纤维细胞胞浆，而双激动剂肽A1对α-SMA及Col1α1抑制显著。
5)图26为给药3周之后各组小鼠的CD68免疫组化染色结果，图27为利用Image J1.50i软件对图26分析得到的染色面积比例；图26、图27表明，双激动剂肽A1治疗小鼠后能够改善CCl4诱导的炎症反应。
由以上结果可知，A1能明显改善由CCl4诱导的肝脏纤维化程度，具有很好的肝保护作用。
4、使用的实验方法为：
天狼星红染色：烘片、脱蜡；双蒸水中静置5min；暗室中天狼星红染色60–80min；0.5％冰醋酸涮洗5s；脱水透明，封片，拍照。
免疫组化：烘片、脱蜡，之后放入双蒸水中浸泡5min。抗原修复：将放片的架子放于盛有柠檬酸的缓冲液(pH＝6.0)烧杯中，放入高压锅，高温高压15min；取出烧杯，静置在室温1h左右，然后取出片子，放入3％双氧水中10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，之后用PBS洗涤3次，每次5min。封闭：擦干组织周围液体，滴加1％BSA，完全覆盖组织，37℃孵育60min。去除1％BSA，按说明书推荐比例滴加抗体于组织上，4℃过夜；取出过夜切片，室温30min，PBS洗3次，每次5min。接着加入连有辣根过氧化物酶的二抗，37℃孵育60min，然后用DAB(二氨基联苯胺)显色；双蒸水涮洗5–10次，苏木精染色25s，用自来水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化，再用自来水洗5min，脱水，风干，封片，拍照。
详细说明
如在此使用的，术语“合成肽”旨在涵盖单数“合成肽”以及复数“合成肽”，并且包含两个或更多个氨基酸的任何链或多个链。因此，如在此使用的，“肽”、“肽亚单位”、“蛋白质”、“氨基酸链”、“氨基酸序列”、或用来指代两个或更多个氨基酸的链或多个链的任何其他术语，都被包括定义“合成肽”中，尽管这些术语的每一者都可具有更具体的含义。术语“合成肽”可以用来替代任何这些术语或者与其可互换地使用。该术语进一步包括已经历翻译后或合成后修饰的合成肽，这些修饰例如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。
更具体地说，如在此使用的术语“肽”涵盖全长肽以及其片段、变体或衍生物，例如，脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽。如在此次披露的“肽”，例如，脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽，可以是包含用来增加半衰期的另外的成分(例如像Fc结构域或白蛋白结构域)的融合合成肽的一部分。如在此描述的肽还可以许多不同的途径衍生。
当提及脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽时，术语“片段”、“类似物”、“衍生物”、或“变体”包括保留至少某种期望的活性(例如，结合到脂联素受体-1和/或脂联素受体-2上)的任何肽。在此提供的肽的片段包括在表达、纯化、或给予受试者的过程中展现出所希望的特性的蛋白水解片段、缺失片段。
术语“药学上可接受的”是指这样的组合物，它们在合理的医学判断范围内适合于与人以及动物的组织接触而没有过度的毒性或其他与合理的利益/风险比相当的其他并发症。
“有效量”是在此提供的脂联素受体-1和受体2双激动剂肽的量，其以单剂量或作为一系列剂量的一部分向受试者给药对于治疗(例如治疗脂肪肝)是有效的。例如，当它的给药导致体重减轻或体重维持(例如，预防体重增加)、减少体脂肪、预防或调节脂肪性肝炎、预防或调节肝纤维化中的一者或多者时，这个量是有效的。这个量可以是对于所有被治疗的受试者而言的固定剂量，或者可以取决于被治疗的受试者的重量、健康、和身体状况、所希望的体重减轻或体重维持的程度、肽的配制、医疗状况的专业评估、以及其他相关因素而改变。
术语“受试者”意指任何受试者，尤其是需要用在此提供的脂联素受体-1和受体-2双激动剂肽进行治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括，但不限于，人类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、母牛、猿类、猴子、猩猩、和黑猩猩，等等。在一个实施例中，该受试者是人类受试者。
如在此使用的，“需要治疗的受试者”指的是其希望治疗的个体，例如，脂肪性肝炎受试者或希望促进体重或体脂肪减少、体重或体脂肪维持、或在规定时间段预防体重增加或将其降低到最低限度的有肥胖症倾向的受试者。肝纤维化受试者希望减轻或预防病症恶化的。
在某些实施例中，在此提供的脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽具有可接受的溶解度、可易于配制中的一个或多个标准。在某些实施例中，脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽被披露为可溶于在宽pH范围的标准缓冲液中。
在某些实施例中，脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽可以高达0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/m1、10mg/ml、或更高的浓度溶于通用缓冲溶液中，溶于缓冲系和例如从0.25到150mM的一系列离子强度中，包括但不限于，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、谷氨酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、或组氨酸缓冲液。示例性的缓冲液包括100mM谷氨酸盐pH 4.5缓冲液、10 0mM乙酸盐pH 5缓冲液、100mM琥珀酸盐pH 5缓冲液、100mM磷酸盐pH6缓冲液、100mM组氨酸pH 6缓冲液、100mM磷酸盐pH 6.5缓冲液、100mM磷酸盐pH 7.0缓冲液、100mM组氨酸pH 7.0缓冲液、100mM磷酸盐pH 7.5缓冲液、100mM Tris pH 7.5缓冲液、和100mM Tris pH 8.0缓冲液。
在某些实施例中，脂联素受体-1和脂联素受体-2双激动剂肽被披露为可在标准药物配制品中配制。示例性配制品包括，但不限于：0.1M Tris pH 7.5，150mM甘露醇，最终配制品pH＝7.2；0.05M Tris,50mM精氨酸/精氨酸，最终配制品pH＝8.0；或磷酸钠缓冲液(pH8)/1.85％W/V丙二醇，最终配制品pH＝7.0。
以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种脂联素受体-1及脂联素受体-2的双激动剂肽，其特征在于，包含氨基酸序列：P-X2-L-Y-X5-F-X7；其中X2、X5及X7中至少一个为非天然氨基酸，P为脯氨酸，L为亮氨酸，Y为酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的双激动剂肽，其特征在于，X2为非天然氨基酸。
3.根据权利要求2所述的双激动剂肽，其特征在于，X2是正缬氨酸。
4.根据权利要求1所述的双激动剂肽，其特征在于，X5为酪氨酸或丝氨酸，
或者，X7为丙氨酸或天冬氨酸。
5.根据权利要求1所述的双激动剂肽，其特征在于，氨基酸序列中的脯氨酸由氢或乙酰基修饰。
6.根据权利要求1所述的双激动剂肽，其特征在于，氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为酪氨酸，X7为丙氨酸；
或者，氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为酪氨酸，X7为天冬氨酸；
或者，氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为丝氨酸，X7为天冬氨酸；
或者，氨基酸序列中的脯氨酸由乙酰基修饰，X2是正缬氨酸，X5为丝氨酸，X7为丙氨酸。
7.权利要求1-6所述的双激动剂肽在治疗非酒精性脂肪肝炎及其适应症或肝纤维化及其适应症中的应用。
8.权利要求1-6所述的双激动剂肽在治疗靶向为脂联素受体-1和脂联素受体-2的适应症中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1-6任一所述双激动剂肽以及与所述双激动剂肽关联的异源物质。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述异源物质为蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇、生物素、白蛋白、人血清白蛋白、人血清白蛋白重组蛋白结合部分、抗体、抗体结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非FnIII支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子中的一种或多种的组合。
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