CN109804071A - 用于术前和术中组织定位和可视化的组织特异性标志物 - Google Patents

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Abstract

外科医生可能面临难以在术前选择进行切口的位置并在术中识别和区分靶组织以去除或识别，以使其不会与邻近或非靶组织一起去除或因此邻近或非靶组织是没有被划到、伤害或意外去除。组织特异性标志物可包括配置为结合预先选择的靶组织的适体或亲和体和与所述适体或所述亲和体偶联的一个或多个指示物元件。所述一个或多个指示物元件产生信号，从而允许以术前方式和操作方式识别所述靶组织。

Description

用于术前和术中组织定位和可视化的组织特异性标志物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年8月12日提交的美国临时专利申请62/374,213和2017年6月30日提交的美国临时专利申请62/528,006的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景
外科医生在对患者进行手术时面临的挑战之一是将手术区域内的靶组织与邻近组织区分开。如果没有经济实惠且易于使用的工具，外科医生必须仅仅依靠他们的技能和经验来在选择切口部位并分离和选择组织进行切除时做出决定。对于外科医生而言，能够容易地标记特定组织将是非常有益的，所述标记特定组织用于移除或用于清楚识别的目的，使得小的腺体、导管或难以区分的组织不会被无意地移除或损坏。
例如，当患者患有甲亢、甲状腺肿或甲状腺癌时，内分泌或头颈外科医生通常会进行甲状腺切除术。甲状腺切除术是一种手术，其切除至少部分甲状腺腺体，一个位于颈部底部的蝴蝶状腺体。甲状腺切除术最常见的并发症之一是低钙血症或甲状旁腺功能减退症。体内的钙调节由一组称为甲状旁腺的小型豆子大小的腺体管理。由于在甲状腺切除术期间意外切除甲状旁腺腺体，甲状腺切除术后发生低钙血症或甲状旁腺功能减退。这对外科医生来说是一个挑战，因为甲状旁腺是小腺体，其位置因患者而异，使得难以仅解剖受影响的甲状腺部分，而不会意外地移除紧邻的小甲状旁腺腺体。使外科医生能够轻松识别甲状旁腺相对于改变的或受影响的甲状腺组织的位置，这将使他们能够在小甲状旁腺腺体上进行更精确的仅对甲状腺的切除。
另一个例子是甲状旁腺切除术，手术切除至少一个甲状旁腺腺体，这是甲状旁腺功能亢进的最常见和最有效的治疗方法，这是一种由良性肿瘤(甲状旁腺腺瘤)或甲状旁腺组织肿大(增生)引起的病症。这些腺体的肿大导致甲状旁腺激素(PTH)的过量产生，导致血钙增加，进而导致其他严重症状，包括脆弱的骨骼、肾结石、骨质疏松症、高血压、虚弱、抑郁等。当外科医生移除受影响的腺体，PTH水平通常将恢复正常。在甲状旁腺切除术中，外科医生必须决定在哪里做切口，并且一旦做出切口，他还必须将甲状旁腺组织与邻近组织区分开来。这是具有挑战性的，因为甲状旁腺腺体很小并且难以在颈部的其他结构(例如甲状腺、淋巴结等)中定位。这些小腺体的确切位置也可能因患者而异。此外，患者主要是40至70岁的女性，可能不希望颈部出现明显的瘢痕，这是身体经常暴露的部分；因此，外科医生可能希望做出最小和最细可能的切口。在选择手术切口部位之前精确定位这些小腺体可以使外科医生能够减少切口的数量和大小，并且通过扩展，减少手术后恢复和瘢痕形成的不适。目前用于术前识别甲状旁腺(例如腺瘤)腺体位置的策略包括Sestamibi(99-Technetium)扫描、超声波和在某些情况下的计算机断层扫描(CT)扫描，但是这些是昂贵的并且不是完全可靠的。经济实惠且精确的工具和方法，允许外科医生在术前识别腺体的位置、大小和健康状况，并在术中区分组织与邻近组织，这可以帮助外科医生进行外科手术流程，同时对患者的外部和内部组织的破坏最小。因此，希望提供解决一些上述挑战的改进技术。本申请中描述的方法和组合物将满足这些目标中的部分。
背景参考文献：Scientific Articles：Smith，B.，Gambir，S.Selective uptakeof single-walled carbon nanotubes by circulating monocytes for enhanced tumordelivery.Nature Nanotech.9，481-487(2014)；Xiong，L.，Rao，J.Self-luminescingBRET-FRET near infrared dots for in vivo lymph node mapping and tumorimaging.Nat.Commun.3，1-15(2012)；Lee，J.，Rao，J.Combining SELEX Screening andRational Design to Develop Light-up Fluorophore-RNAAptamer Pairs for RNATagging.ACS Chem.Biol.19，1065-1074(2010)；Chapman，S.，Rao，J.Nanoparticles forcancer imaging：the good，the bad and the promise Nano Today.8，454-460。
赠款：Samuel Achilefu.Development of Google System for FluorescenceImage-Guided Surgery，5R01CA171651-03；Dustin Wayne Demoin.Phlip-based agentsfor pre-；intra-；and post-operative imaging and therapy of br.1F32CA186721-01A1；Robert Hitchcock.Fiber-optic confocal imaging for ID of conductiontissue during cardiac surgery.5R21HL108099-02；Aaron M Mohs.Nanotechnology forminimally invasive cancer detection and resection.5R00CA153916-05；QuyenNguyen.Testing fluorescently labelled probes for nerve imaging duringsurgery.5R01EB014929-03；Brian W.Pogue and Keith Paulsen.Molecularfluorescence-guided surgery platform.5R01CA167413-02；Marcin Ptaszek.Novelactivatable fluorophores for multicolor fluorescence-guided cancersurgery.1U01CA181628-01；Brian Straight.Intraoperative assessment of non-melanoma skin cancer margins using NIRF probes.1R43CA180296-01A1；RalphWeissleder.Novel Clickdyes for biomedical sensing.2R01EB010011-05；StevenA.Benner.Simple inexpensive assay for five common HIV resistancemutations.1R41AI116445-01；Steven A.Benner.Expanded DNA；in vitro selection；aptamers；and cancer.1R01GM111386-01；Kyung Kang.Highly specific and highlysensitive aptamer-gold nanoparticle based NIR contrast.1R1CA173693-01；MartinSchnermann.New synthetic approaches to small molecules for imaging near-IRphotorelease chemistry：discovery and applications.1ZIABC011506-02；MartinSchnermann.Near-IR photorelease chemistry：discovery andapplications.1ZIABC011564-01；Weihong Tan.Development of molecular probes forbiomedical applications.5RO1GMO79359-06。
专利/专利公开：US8,685,372、US2014/0140594、US2014/0276008、CA2,611,468、CA2,770,980和US2013/0134922。
发明内容
在一些方面，要求保护的发明涉及外科手术工具和方法，并且在一些更具体的方面涉及促进从毗连组织识别靶组织的组织特异性标志物，或者包括所述标志物的系统和使用所述一个或多个标志物的方法。
在一个方面，组织特异性标志物包含配置为结合预先选择的靶组织的适体或亲和体(affimer)，以及偶联至所述适体或所述受体的一个或多个指示物元件。所述一个或多个指示物元件可以产生包括光谱、顺磁、声学等的信号，从而允许识别所述靶组织。
在另一个方面，组织特异性标志物包括适体或亲和体，其被配置为选择性地结合非恶性靶组织和/或正常组织；并且至少第一指示物元件偶联至所述适体或所述亲和体，其中所述至少第一指示物元件产生信号，从而允许识别所述非恶性靶组织。在一些实施方案中，所述组织特异性标志物包含所述适体，其被配置为选择性地结合非恶性靶组织(和/或正常组织)，其中所述适体包含DNA、RNA、肽或其任何组合。
在一些实施方案中，所述适体包含核酸、肽、DNA、RNA或修饰的核苷酸或核苷。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体被聚乙二醇化或以其他方式改变以提高稳定性。在一些实施方案中，所述适体包含RNA或DNA、或RNA和DNA两者。在一些实施方案中，所述适体是RNA适体。在一些实施方案中，所述适体是DNA适体。在一些实施方案中，所述适体在所述适体的3′末端包含反向T，例如在核酸适体的3′末端的反向T。在一些实施方案中，所述适体具有至多100个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包含甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包含甲状旁腺。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是人组织。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是非人组织。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是腺体组织。在一些实施方案中，所述腺体组织是外分泌腺组织或内分泌腺组织。
在一些实施方案中，所述靶组织是健康组织、正常组织和/或非恶性组织。在一些实施方案中，所述非恶性组织是非脂肪的健康组织。在一些实施方案中，所述非恶性组织是不是脂肪组织的健康组织。在一些实施方案中，所述非恶性组织不是健康组织。在一些实施方案中，产生的信号可以在磁、声、可见光、近红外和红外光谱内。在一些实施方案中，所述适体以1pM至1mM的范围内的亲和力结合所述非恶性靶组织。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合所述靶组织的亲和力比所述适体结合非靶组织的亲和力高至少10倍。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合所述非恶性靶组织，其亲和力比所述适体结合非靶组织的亲和力高至少2倍。在一些实施方案中，所述非靶组织包含甲状腺。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是非人组织。在一些实施方案中，所述靶组织包含甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包含甲状旁腺。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包括神经、血管、输尿管、胆管、子宫内膜组织、肝管、淋巴结、细菌或真菌。
在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体被配置为相对于第二腺体选择性地结合第一腺体。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体被配置为相对于所述非恶性靶组织附近的组织优先地结合所述非恶性靶组织。
在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体被配置为相对于至少一种选自脂肪、胸腺、淋巴结和咽组织的组织优先地结合所述腺体组织。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体配置为选择性地结合健康的甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体配置为选择性地结合所述健康的甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体相对于甲状腺组织优先地结合所述健康甲状旁腺组织或所述甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体相对于所述甲状腺组织优先地结合所述健康甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体相对于至少一种选自脂肪、胸腺、淋巴结和咽组织的组织优先地结合所述健康的甲状旁腺组织或所述甲状旁腺腺瘤组织。
在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包括神经、血管、输尿管、胆管、子宫内膜组织、肝管、淋巴结、细菌或真菌。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包括雌性生殖组织，例如子宫内膜或子宫。
在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ IDNO：100-110中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQID NO：104具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。在一些实施方案中，所述适体包含序列，所述序列含有基序GATACTG。
所述靶组织可包括例如甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。所述靶组织还可包括器官、神经、血管、输尿管、子宫内膜、甲状腺、胆管、肝管、淋巴结、细菌、真菌或恶性组织。在一些实施方案中，所述一种或多种指示物元件或所述至少第一指示物在暴露于能量或被能量激发时产生信号，或者可通过任何其他已知方法检测。在一些实施方案中，所述产生的信号在磁、声、可见、近红外或红外光谱内。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件包含荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是近红外染料、花青染料或吲哚菁绿。
在一些实施方案中，所述一种或多种指示物元件或所述至少第一指示物元件包含荧光团、量子点、染料、纳米金刚石、酶、蛋白质、纳米晶体、金或氧化铁颗粒，一种光声转换器元件，其将光或近红外信号转换为声输出、纳米颗粒、纳米棒、珠或其组合。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件共价偶联至所述适体、所述亲和体或第二指示物元件。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件包含第一指示物元件和第二指示物元件，所述第一指示物元件为荧光团，所述第二指示物元件为纳米金刚石。
在一些实施方案中，可以使用两种或更多种组织特异性标志物，其中所述第二组织特异性标志物包含第二适体或亲和体，其配置为结合不同于所述第一预选靶组织的第二预选靶组织。在一些情况下，所述第一预选靶组织是甲状旁腺组织，以及所述第二预选靶组织是甲状腺组织。所述一个或多个指示物元件可以偶联到适体、亲和体或一个或多个其他指示物元件。在某些情况下，所述指示物元件之一将在更深的距离处被检测到。这可以允许外科医生在术前(通过皮肤)识别靶组织。当外科医生开始他的解剖时，可以使用另一种类型的指示物来更精确地区分组织。
在另一方面，用于将靶组织与毗连组织区分开的系统包括本文所述标志物的任何方面，以及用于用能量激发所述标志物的探针或装置和/或用于检测来自所述一个或多个指示物元件的光谱信号的探针或检测器。所述激发装置(或探针)和所述检测器(或探针)可以是相同的装置(或探针)，或者它们可以是不同的装置(探针)。
在一个方面，公开了一种用于将靶组织与毗连组织区分开的系统。该系统包括如本文所述的组织特异性标志物和用于用能量激发所述组织特异性标志物的装置和/或用于检测来自一个或多个指示物元件的信号的检测器。在一些实施方案中，用于用能量激发所述组织特异性标志物的装置是照明源。在一些实施例中，所述检测器包括相机。
在另一方面，公开了一种用于将靶组织与毗连组织区分开的系统。该系统可包含如本文所述的组织特异性标志物，第二组织特异性标志物，所述第二组织特异性标志物包含配置为结合第二靶组织的第二适体或第二亲和体，和与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的第二指示物元件，其中所述第二指示物元件产生信号，从而允许识别所述第二靶组织和用于用能量激发所述组织特异性标志物的第一装置或用于检测来自所述第一或第二指示物元件中的任何一个的信号，或者来自第一和第二指示物元件两者的信号的检测器。在一些实施例中，所述系统包括照明源。在一些实施例中，所述系统包括相机。
在一些实施方案中，非恶性靶组织是甲状旁腺组织，并且第一指示物元件是第一荧光团，并且其中所述第二靶组织是神经、淋巴结或甲状腺组织，并且所述第二指示物元件是与所述第一个荧光团不同的第二荧光团。
在另一个方面，用于区分组织的方法包括将与所述一个或多个指示物元件偶联的适体或亲和体递送到患者或对象的身体中，允许所述适体或所述亲和体结合靶组织、正常或非恶性靶组织，检测由所述一个或多个指示物元件产生的信号或检测所述一个或多个指示物元件，并基于检测到的信号从毗连组织识别所述靶组织或基于从所述一个或多个指示物元件检测到的信号从毗连组织区分所述正常或非恶性靶组织。在一些实施方案中，该方法包括用能量暴露或激发与所述适体或所述亲和体偶联的所述一种或多种指示物元件。
在一些实施方案中，该方法包括递送所述适体或所述亲和体或所述组织特异性标志物包括将所述适体或所述亲和体经皮递送、喷雾、满灌、口服递送或静脉内递送至所述非恶性靶组织。该方法进一步包括在所述靶组织上进行医疗流程而不损伤毗连组织。例如，该方法可以包括去除至少一部分甲状腺腺体而不损伤毗连的正常甲状旁腺组织。可选地，所述靶组织可在甲状旁腺切除术期间包含一种或多种异常(例如腺瘤、增生或恶性肿瘤)甲状旁腺腺体。
在一些实施方案中，包括递送所述适体或所述亲和体的该方法包括洗涤步骤。在一些实施例中，该方法进一步包括在毗连组织上进行医疗流程而不损伤所述非恶性靶组织，或者不显著损伤所述非恶性靶组织。在一些实施例中，该方法包括在非恶性靶组织上进行医疗流程而不损伤所述毗连组织。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是甲状旁腺腺瘤，并且该方法进一步包括去除至少一部分甲状旁腺腺瘤而不损伤毗连的甲状腺组织。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是甲状旁腺组织，并且该方法进一步包括移除至少一部分毗连甲状腺组织而不损伤或移除所述甲状旁腺组织。
在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体选择性地结合健康的甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体选择性地结合所述健康的甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织两者。在一些实施方案中，所述适体或所述亲和体相对于所述毗连甲状腺组织选择性地结合所述健康甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织两者。
在一些实施方案中，该方法包括检测所述一个或多个指示物元件的第一组和所述一个或多个指示物元件的第二组，其中在大于所述第二组的距所述组织特异性标志物的距离检测所述第一组。在一些实施例中，在对象的身体外部检测所述第一组，并在进行手术切口后检测所述第二组。
在一些实施方案中，识别所述非恶性靶组织包括使来自所述一个或多个指示物元件的信号可视化。在一些实施例中，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括用检测器检测光谱信号。在一些实施例中，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括用相机检测光谱信号。在一些实施例中，该方法进一步包括基于检测到的光谱信号形成诊断。在一些实施例中，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括术前检测信号。在一些实施例中，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括在术中检测信号。
该方法可以包括检测至少两个不同的指示物元件。在一些实施方案中，至少两种不同的指示物元件是相同类型的指示物元件例如荧光团，并且可通过颜色或发射波长区分。在一些实施例中，所述两个不同的指示物元件是不同类型的指示物元件。例如，第一指示物元件可以是吲哚菁绿(ICG)荧光团或pH敏感指示物，并且第二指示物元件可以是纳米金刚石。在一些实施例中，第一指示物元件产生当探针放置在距标记的组织第一距离时可检测的信号，并且第二指示物元件产生在大于所述第一距离的第二距离处可检测到的信号。在一些实施例中，可以在进行手术切口之后检测第一指示物元件，并且可以在身体外部(例如，通过皮肤)检测第二指示物元件。在一些实施例中，所述第一和第二指示物元件产生不同类型的信号。
在一些实施例中，该方法包括使用探针或其他设备检测来自所述一个或多个指示物元件的信号。在一个实例中，识别所述靶组织可以包括使从所述一个或多个指示物元件发射的信号可视化。检测信号可以包括用相机检测所述一个或多个指示物元件，例如互补金属氧化物半导体(CMOS)相机或电荷偶联显示器(CCD)相机。检测来自所述一个或多个指示物元件的信号可以在诊断上或非诊断上、术前、术中或在这些应用的任何组合中使用。
在一个方面，本文提供了组织特异性标志物，所述标志物包含：适体或亲和体，其被配置为结合预先选择的靶组织；以及偶联到所述适体或所述亲和体的至少第一指示物元件，其中所述至少第一指示物元件产生允许识别所述靶组织的信号。在一些实施方案中，所述适体包含DNA、RNA或肽、或其任何组合。在一些实施方案中，所述适体包含修饰的核苷酸或核苷。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ ID NO：100-110中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。在一些实施方案中，所述适体包含序列，所述序列含有基序GATACTG。在一些实施方案中，所述适体具有至多50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或200个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述适体以1pM至1mM的范围内的亲和力结合所述靶组织，例如在1nM至100μM的范围内。
在一些实施方案中，所述靶组织是健康组织、正常组织和/或非恶性组织。在一些实施方案中，所述非恶性组织是非脂肪的健康组织。在一些实施方案中，所述非恶性组织是不是脂肪组织的健康组织。在一些实施方案中，所述非恶性组织不是健康组织。在一些实施方案中，产生的信号可以在磁、声、可见、近红外和红外光谱内。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合所述靶组织的亲和力比所述适体结合非靶组织的亲和力高至少10倍。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合所述非恶性靶组织的亲和力比所述适体结合非靶组织的亲和力高至少2倍。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包含甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。在一些实施方案中，所述非靶组织包含甲状腺。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是人组织。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织是非人组织。在一些实施方案中，所述靶组织包含甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。在一些实施方案中，所述非恶性靶组织包括神经、血管、输尿管、胆管、子宫内膜组织、肝管、淋巴结、细菌或真菌。
在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件包含荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是近红外染料。在一些实施方案中，所述荧光团是花青染料。在一些实施方案中，所述荧光团是吲哚菁绿。在一些实施例中，所述至少第一指示物元件包括量子点。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件包含酶或蛋白质。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件包含pH敏感指示物。在一些情况下，所述至少第一指示物元件包括纳米金刚石。在一些实施例中，所述至少第一指示物元件包括光声转换器元件。在一些情况下，所述至少第一指示物元件包括纳米颗粒或纳米棒。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件包含珠子。在一些实施方案中，所述至少第一指示物元件共价偶联至所述适体、所述亲和体、第二指示物元件或所述一个或多个指示物元件。
在另一方面，本文提供了用于区分靶组织与毗连组织的系统。该系统还包括本文所述的标志物和用于用能量激发标志物的探针或用于检测来自一个或多个指示物元件的信号的探针。在一些实施例中，该系统进一步包括照明源。在一些实施例中，该系统进一步包括相机。
在另一方面，本文提供了用于区分靶组织与毗连组织的系统。该系统进一步包括本文所述的标志物，第二组织特异性标志物，所述第二组织特异性标志物包含配置为结合第二预选靶组织的第二适体或第二亲和体，和与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的一个或多个第二指示物元件，其中所述第二指示物元件在暴露于能量或被能量激发时产生光谱信号从而允许识别所述第二靶组织，用于用能量激发所述标志物的第一探针或用于检测来自所述一个或多个指示物元件的光谱信号的探针以及用于用能量激发所述标志物的第二探针或用于检测来自所述一个或多个第二指示物元件的光谱信号的探针。在一些实施例中，该系统进一步包括照明源。在一些实施例中，该系统进一步包括相机。
在另一方面，本文提供了一种用于区分组织的方法。该方法包括将与一个或多个指示物元件偶联的适体或亲和体递送到患者体内，允许所述适体或所述亲和体与所述患者体内的靶组织结合，用能量暴露或激发所述一个或多个指示物元件，检测由所述一个或多个指示物元件产生的信号或检测所述一个或多个指示物元件，并基于从所述一个或多个指示物元件检测到的信号区分所述靶组织与毗连组织。
在另一个方面，一种方法包括将与一个或多个指示物元件偶联的第二适体或第二亲和体递送到对象体内，允许所述第二适体或所述第二亲和体与第二靶组织结合，其中所述第二靶组织与靶组织不同，用能量暴露或激发与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件，检测由与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件产生的光谱信号或检测与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件，并基于从与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件检测到的信号从所述靶组织识别所述第二靶组织。
在一些实施方案中，递送适体或亲和体包括经皮递送、喷雾、满灌、口服递送或静脉内递送所述适体或所述亲和体至靶组织。在一些情况下，递送所述适体或所述亲和体包括洗涤步骤。在一些情况下，该方法还包括对所述非恶性靶组织进行医疗流程而不损伤毗连组织。在一些情况下，所述靶组织是甲状腺腺体，并且该方法进一步包括去除至少一部分甲状腺腺体而不损伤毗连的甲状旁腺组织。在一些情况下，所述靶组织是甲状旁腺腺体，并且该方法进一步包括去除一个或多个甲状旁腺腺体而不损伤或移除毗连的甲状腺。
在一些实施方案中，该方法进一步包括检测所述一个或多个指示物元件的第一组和所述一个或多个指示物元件的第二组，其中在大于所述第二组的距所述组织特异性标志物的距离上检测所述第一组。在一些情况下，在身体外检测所述第一组，并在手术切口后检测所述第二组。
在一些实施例中，识别所述靶组织包括使来自所述一个或多个指示物元件的信号可视化。在一些情况下，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括用探针检测信号。在一些情况下，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括用相机检测所述光谱信号。在一些情况下，该方法进一步包括基于检测到的信号形成诊断。在一些情况下，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括术前检测所述信号。在一些情况下，检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括在术中检测所述信号。
在一些实施方案中，该方法进一步包括将与一种或多种指示物元件偶联的第二适体或第二亲和体递送到患者或对象体内；允许所述第二适体或所述第二亲和体结合第二靶组织，其中所述第二靶组织与正常或非恶性靶组织不同；暴露或激发与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一种或多种指示物元件；检测由所述一个或多个指示物元件产生的信号，所述指示物元件与所述第二适体或所述第二亲和体偶联或检测与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件；以及基于从与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的一个或多个指示物元件检测到的信号，从所述正常或非恶性靶组织中识别所述第二靶组织。
在一个方面，本文提供了选择性地结合甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤的适体。在一些实施方案中，所述适体相对于甲状腺腺体选择性地结合所述甲状旁腺腺体或所述甲状旁腺。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合所述甲状旁腺腺体或所述甲状旁腺腺瘤，所述结合以比所述适体结合甲状腺腺体的亲和力高至少10倍的亲和力。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合所述甲状旁腺腺体或所述甲状旁腺腺瘤，以比所述适体结合甲状腺腺体的亲和力高至少5倍、10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍的亲和力。在一些实施方案中，所述适体包含DNA。在一些实施方案中，所述适体包含RNA。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合正常、健康和/或非恶性甲状旁腺腺体。在一些实施方案中，所述适体配置为选择性地结合健康的甲状旁腺组织和甲状旁腺腺瘤组织两者。在一些实施方案中，所述适体相对于甲状腺组织优先地结合健康甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体相对于甲状腺组织优先地结合健康甲状旁腺组织和甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体相对于至少一种选自脂肪、胸腺、淋巴结和咽组织的组织优先地结合健康甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。在一些实施方案中，所述适体选择性地结合人组织。在一些实施方案中，所述适体被配置为相对于不同类型的腺体组织选择性地结合甲状旁腺组织。在一些实施方案中，所述适体被配置为相对于所述正常、健康或非恶性靶组织附近的组织优先地结合正常、健康或非恶性靶组织。
在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ ID NO：100-110中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些情况下，所述适体包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。在一些情况下，所述适体包含序列GATACTG。
在一个方面，本文提供了包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列的多核苷酸。在一个方面，包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％序列相同性的序列的多核苷酸，其中所述序列包含至少十个连续核苷酸的非天然序列或所述序列包含至少一个修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ ID NO：100-110中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ IDNO：104具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性的序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含序列GATACTG。
在以下与附图有关的描述中更详细地描述了这些和其他实施例。
以引用方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
附图简述
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下详细描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了利用本发明原理的说明性实施例，以及以下附图：
图1示出甲状腺和甲状旁腺组织的前视图以及相关的解剖结构。
图2示出肝脏、胆囊和毗连的脉管系统。
图3示出肾系统和毗连的神经组织。
图4示出外周神经系统。
图5示出标志物用于识别淋巴结的用途。
图6示出了鼻窦和靶向细菌的标志物的应用。
图7示出探针在识别癌症或任何恶性组织中的用途。
图8A-8C示出组织特异性标志物的示例性配置。
图9示出术中使用组织特异性标志物的流程图。
图10A-10F示出组织特异性标志物在甲状旁腺切除术和甲状腺切除术中的用途。
图11示出组织特异性标志物的术前和术中使用的可能组合的流程图。
图12A-12B示出探针用于诊断或术前检测组织特异性标志物的用途。
图13示出用于选择甲状旁腺特异性标志物的示例性策略。
图14示出针对选择轮绘制的10个序列的拷贝数。
图15示出适体SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104的序列比对。
图16显示适体结合组织芯片的方案。
图17A-17G示出适体SEQ ID NO：3与正常甲状旁腺组织的结合。
图18A-18G示出适体SEQ ID NO：4与正常甲状旁腺组织的结合。
图19A-19B示出适体SEQ ID NO：3与正常甲状腺组织的结合结果和SEQ ID NO：4与正常甲状腺组织的结合。
图20A和20B分别示出适体SEQ ID NO：3和适体SEQ ID NO：4在甲状旁腺腺瘤上的结合结果。
图21A和21B分别示出适体SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4在额外的正常甲状旁腺组织上的结合结果。
图22A和22B分别示出适体SEQ ID NO：3和适体SEQ ID NO：4与脂肪组织的结合结果。
图23A和23B分别示出适体SEQ ID NO：3和适体SEQ ID NO：4与淋巴结的结合结果。
图24A和24B分别示出适体SEQ ID NO：3和适体SEQ ID NO：4与口咽组织的结合结果。
图25A和25B分别示出适体SEQ ID NO：3和适体SEQ ID NO：4与胸腺组织的结合结果。
图26A和26B显示组织微阵列芯片上的不同组织的图谱。图26A显示了组织定位的示意图；图26B显示了实际微阵列芯片的图片。
图27A-27AH示出适体SEQ ID NO：3对额外的健康人组织(组织微阵列)的结合结果。
图28A-28AG示出适体SEQ ID NO：4对额外的健康人组织(组织微阵列)的结合结果。
发明详述
现在将参考附图有时描述组织特异性标志物和使用方法的具体实施方案。该详细描述中的任何内容都不旨在暗示任何特定组件、特征或步骤对于本发明是必不可少的。
本公开内容提供了组织特异性标志物组合物，其可用于在术前和术中外科手术流程中识别或标记特定组织(例如，健康的甲状旁腺组织)。在外科手术流程中识别特定组织类型可能特别有助于减轻健康组织和器官的损伤或丧失。在一些优选的实施方案中，所述组织特异性标志物用于标记特定的健康组织(例如，甲状旁腺组织)，以便将其与不同的组织类型(例如，甲状腺组织，脂肪组织)或患病组织(例如，腺瘤、增生或甲状腺恶性肿瘤)区分开。在一些情况下，所述组织特异性标志物组合物用于标记在手术期间要避免或保留的健康组织。在其他情况下，所述组织特异性标志物组合物用于标记患病组织或其他靶组织以进行手术切除。在一些情况下，可以使用多种组织特异性标志物。例如，第一组织特异性标志物可用于标记一种组织类型(例如，健康组织)，而第二组织特异性标志物用于标记不同组织类型(例如，患病组织，来自不同器官的组织)。在一些情况下，单个组织特异性标志物可含有与第二靶向元件连接的第一靶向元件，其中所述第一和第二靶向元件设计成标记不同类型的组织，使得紧邻靶组织的两个组织可以突出显示。
虽然示例性实施方案主要针对甲状腺、甲状旁腺或毗连组织的组织区分，但这不是限制性的，并且本领域技术人员将理解本文描述的标志物、方法和系统可以用于区分任何靶组织。识别的或靶向的组织可以是器官组织，特别是来自实体器官或腺体的组织。在一些优选的实施方案中，所述靶组织是甲状旁腺组织、神经组织或生殖组织(例如，源自子宫颈、卵巢、子宫内膜或其他雌性生殖器官的组织)。在进一步优选的实施方案中，所述靶组织是健康的甲状旁腺组织、非恶性甲状旁腺组织、正常甲状旁腺组织或患病的甲状旁腺组织，例如甲状旁腺腺瘤组织、甲状旁腺增生组织或甲状旁腺恶性肿瘤组织的组织。
本文提供的许多组织特异性标志物组合物可用于涉及完全或部分除去甲状腺或甲状旁腺的外科手术流程。图1是从前视图看甲状腺120和甲状旁腺腺体125的位置的示意图，其中患者的头部110和身体145被描绘为透视。相对于喉115、甲状腺120、甲状软骨135和气管140显示健康的甲状旁腺腺体125和患病的腺瘤组织130。甲状旁腺腺体125相对于毗连的甲状腺组织120较小，并且甲状旁腺腺体的确切位置在患者之间有显著的可变性。这些特征对进行甲状旁腺切除术和甲状腺切除术的外科医生提出了术前和术中的挑战。目前用于定位健康的甲状旁腺腺体125或甲状旁腺组织腺瘤130的方法包括Sestamibi(99-Technetium)扫描和超声，其成本高且不完全可靠。在术中，小尺寸的甲状旁腺腺体125使得它们相对于甲状腺腺体120难以定位；结果，在甲状腺切除术期间，健康的甲状旁腺组织可能被不被需要地切除或以其他方式受损，并且在甲状旁腺切除术期间可能不被需要地切除或损伤健康的甲状腺组织。
本文提供的组织特异性标志物组合物可用于在甲状腺切除术期间标记或识别甲状旁腺组织，从而防止在流程期间不必要的切除或损伤甲状旁腺组织。在一些情况下，所述组织特异性标志物组合物可能能够识别患病和健康组织两者。例如，组织特异性标志物可以特异性结合健康和患病的甲状旁腺组织两者(例如，甲状旁腺腺瘤组织)。这种组织特异性标志物在甲状旁腺切除术中也可以是有用的，以便标记患病的甲状旁腺组织(例如，甲状旁腺腺瘤组织)和健康的甲状旁腺组织两者，以避免不必要的去除或损伤甲状腺组织。在这种情况下，可以使用标准流程(例如计算机断层扫描(CT)扫描)在术前定位患病的甲状旁腺组织，所述标准流程可以识别甲状旁腺腺瘤或其他患病组织所在的象限。然后，外科医生可以在预期腺瘤或患病组织所在的一般区域中切口，并然后使用所述组织特异性标志物更特异性地识别所述腺瘤组织的精确位置。在该流程之后，可以进行血液测试以检测甲状旁腺功能，例如甲状旁腺激素(PTH)测试，以进一步确保所述腺瘤组织被去除。在更进一步的实施方案中，患者可以接受具有第一指示物元件和第二指示物元件的组织特异性标志物的全身施用。然后可以使用检测来自皮肤上方的所述第一指示物元件的信号的装置或探针在术前识别和定位甲状旁腺组织(患病的或健康的)，因此避免使用MRI或Sestamibi扫描。该方法可以使外科医生更准确地指示甲状旁腺组织的位置，使得初始切口可以更加有针对性或精确。在切口之后，可以使用所述第二指示物元件使所述甲状旁腺可视化。在一些情况下，所述组织特异性标志物包含在手术前和/或手术期间检测到的单个指示物元件。在一些情况下，所述甲状旁腺特异性标志物可以与甲状腺特异性标志物一起使用，以进一步帮助甲状旁腺和甲状腺组织之间的区分。在更进一步的情况下，甲状腺特异性标志物可以单独使用或与甲状旁腺特异性标志物联合使用。
本文提供的组织特异性标志物组合物可用于标记或识别甲状旁腺组织(健康的和/或患病的)，从而防止在甲状腺切除术流程中不必要的切除或损伤甲状旁腺腺体。在这种情况下，外科医生可能会专注于去除未标记的甲状腺组织，而不是标记的甲状旁腺组织。在某些情况下，所述甲状旁腺特异性标志物可以与甲状腺特异性标志物一起使用，以便在甲状腺切除术期间进一步帮助在甲状旁腺和甲状腺组织之间的区分。在更进一步的情况下，甲状腺特异性标志物可以单独使用或与甲状旁腺特异性标志物联合使用。
本文提供的组合物和方法可以用于涉及难以与毗连或邻近组织区分的靶组织的任何其他外科手术流程中。图2-7示出了可以在其上操作并且可以受益于本文公开的组织特异性标志物和使用方法的身体或组织的其他区域的实例。
图2是示出相对于毗连脉管系统210、主动脉215、下腔静脉220、小肝动脉225、胆囊230、门静脉240和肝脏255的肝管245和胆管235示意图。组织特异性标志物可以应用于与肝管和胆管相关的诊断、术前或术中外科手术流程以及包括在患者身体的所描绘区域中或所描绘区域周围的脉管系统的脉管系统。组织特异性标志物对于灌流研究可能是有价值的，并且可以帮助外科医生在手术期间避免切到血管。
图3是示出输尿管320相对于脊柱310、源自脊柱310的示例性毗连神经组织315、膀胱325、骨盆330、肾脏335和脊髓340的位置的示意图。所述组织特异性标志物可以应用于与输尿管相关的诊断、术前或术中外科手术流程以及包括在患者身体的所描绘区域中或所描绘区域周围的神经组织的神经组织。还可以选择组织特异性标志物以结合非实体靶标，例如穿过诸如尿液的解剖学管腔的靶标，并且这可以是输尿管识别和保存的另一种方式。
图4是更详细地示出连接到脊柱310的外周神经315的示意图，并且组织特异性标志物可用于使CNS组织或外周神经或两者可视化。在外科手术流程(例如前列腺切除术)中，组织特异性标志物可用于识别神经。使用这些组织特异性标志物可允许外科医生在手术期间看到一个或多个神经的位置，从而允许更好的引导并因此为成功结果提供更高的安全系数，例如通过防止意外切到神经。
图5是显示这些组织特异性标志物用于区分前哨淋巴结350或辅助淋巴结345与毗连组织的另一种潜在应用的示意图；显示患者的乳房355的透视图。在该实例中，标志物可用于在手术切除癌性乳房组织期间识别前哨淋巴结。可视化前哨淋巴结减少了对解剖结构其余部分的伤害。
图6是示出相对于上部360、中部370和下部375鼻甲骨的额窦365和上颌窦380的示意图。在鼻窦感染期间，细菌可能在窦385中积聚，并引起窦感染。组织特异性标志物也可以由可以与细菌或真菌结合并检测感染部位的适体组成。这些致病因子特异性标志物可用于慢性鼻窦炎或伤口护理，并且它们可使医生或外科医生能够对感染区域成像并促进患者特异性治疗。
图7是显示组织特异性标志物如何能靶向并结合肿瘤390的示意图。可以检测结合的组织特异性标志物并将其用于区分肿瘤与健康的邻近组织395。
组织特异性标志物
本文提供的组织特异性标志物通常含有与至少一种指示物元件连接的靶向元件。所述组织特异性标志物也可含有其他元件，以及例如额外的靶向元件、额外的指示物元件、一种或多种PEG化元件、一种或多种接头、和/或一种或多种经修饰的残基，所述经修饰的残基设计用于减少在血液或体温中标志物的降解。通常，这些特征可以使所述组织特异性标志物具有一种或多种以下特性：(a)与至少一种其他类型的组织相比，以相对高的亲和力选择性地结合特定组织类型的能力；(b)能够被检测到的能力，特别是在外科手术流程期间或之前；和/或(c)足够持续时间的半衰期，所述持续时间允许所述组织特异性标志物结合并定位于靶组织。
所述组织特异性标志物可具有若干变体，这取决于其预期用途的具体情况。在优选的实施方案中，所述组织特异性标志物至少含有靶向元件和指示物元件。所述组织特异性标志物的一个实例在图8A中示出，其包括靶向元件(例如，适体或亲和体组分)415和指示物元件410。通常，所述靶向元件直接或通过接头分子与所述指示物元件连接。
a.靶向组织特异性标志物的元件
本文提供的组织特异性标志物通常包括靶向元件，例如适体或亲和体。这种适体或亲和体组分通常以相对高的亲和力结合靶组织，特别是当与其他组织如邻近组织或其他不期望的组织相比时。通常，所述亲和体或适体相对于至少一种其他组织选择性地结合所述靶组织。在一些情况下，组织特异性标志物的所述适体或亲和体可能对多于一种靶标具有亲和力。例如，所述适体或亲和体可以对靶组织具有相对高的亲和力以及对不同组织的相对高的亲和力。在一些情况下，所述适体以1pM至1mM的范围内的亲和力或结合亲和力(Kd或解离常数)与所述非恶性靶组织结合。
在优选的实施方案中，本文提供的组织特异性标志物的所述适体或亲和体组分对甲状旁腺组织，特别是健康或正常的甲状旁腺组织具有高亲和力。在一些情况下，所述靶向元件对一种或多种异常(例如，腺瘤、增生或恶性肿瘤)甲状旁腺组织具有高亲和力。在某些情况下，适体或亲和体组分可能特异性结合下列组织之一：甲状旁腺、神经、生殖器官、宫颈、卵巢、子宫内膜、乳房、结肠、输卵管、胆囊、空肠、肝、肺、食道、胰腺、垂体、胎盘、前列腺、皮肤、脊柱、胃、睾丸、扁桃体、输尿管、肾、肌肉、脾、膀胱、小脑、大脑皮层或其他组织。在一些优选的实施方案中，结合的组织是甲状旁腺组织、神经组织和/或生殖组织(例如，源自宫颈、卵巢、子宫内膜或其他雌性生殖器官的组织)。在一些情况下，所述适体或亲和体组分可以特异性结合源自内胚层、外胚层或中胚层胚层的组织。优选地，所述靶向元件结合器官组织，特别是实体器官或腺体。
本文提供的靶向元件通常可以相对于不期望的组织选择性地结合特定组织。这种不期望的组织可以是与靶组织邻近或毗连的组织。在一些进一步优选的实施方案中，所述靶向元件以比对甲状腺组织更高的亲和力选择性地结合甲状旁腺组织(健康的、异常的或两者)。在一些情况下，为了区分邻近组织与所述靶组织，所述组织特异性标志物以相对高的亲和力结合所述靶组织，所述结合具有最小的脱靶结合。在一些优选的实施方案中，所述适体选择性地结合甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤，所述结合的亲和力比所述适体对甲状腺腺体的亲和力高至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。
如本文所用，术语“适体”通常是指特异性或选择性地结合靶标(例如靶组、靶分子、靶细胞)的寡核苷酸或肽。通常，寡核苷酸适体可以以任何组合含有DNA、RNA和/或修饰的核酸。例如，在某些情况下，寡核苷酸适体可以完全或部分由DNA或RNA组成；而在其他情况下，它们可以包含DNA和RNA两者。理论上，本文提供的寡核苷酸适体可能通过非沃森/克里克相互作用与靶分子或组织结合。在一些情况下，本文提供的适体和/或亲和体不是天然存在的。例如，所述适体和/或亲和体可以包含在自然界中不存在的序列或可以具有在自然界中不存在的一种或多种修饰。亲和体可以是小肽或蛋白质，通常分子量小于12kDa。适体或亲和体可以具有识别特定表位或抗原的能力，并且具有可以接近那些抗体的结合亲和力(例如，在低纳摩尔至皮摩尔范围内)；然而，如本文所用，术语“适体”或“亲和体”不包括抗体、免疫球蛋白、抗体的Fab区或抗体的Fc区。适体可以具有与抗体相同的特异性优势，但可以是更小的，可以是化学合成的或化学修饰的，并且具有不含细胞培养污染物的优点。
本文提供的适体和亲和体可以是非免疫原性的或表现出引发免疫应答的有限能力。在一些情况下，本文提供的适体和亲和体能够结合细胞外靶标，这是设计组织特异性标志物的重要特征。一旦设计和选择，适体通常稳定、易于处理并且制造成本低廉。它们的化学组合物还允许整合广泛的指示物元件。
本文提供的适体可以是任何长度或大小。在一些情况下，本文提供的适体的长度范围为80-100个核苷酸。在某些情况下，所述适体的长度多达100个核苷酸。
可根据其所需功能选择和设计适体。当应用于适体时，SELEX流程可包括多个步骤。步骤包括合成由独特的随机产生的序列组成的非常大的寡核苷酸文库。序列可以是固定长度的，并且可以包含在文库的部分或整个文库之间共享的5′和3′末端。5′和3′末端可以配置为用作扩增文库中序列的引物识别序列。文库中的序列可以暴露于靶配体(例如，蛋白质、小有机分子、组织等)，并且可以去除那些不与靶配体结合的序列(例如，通过洗涤、通过亲和力色谱法或其他方法)。可以洗脱和通过PCR扩增结合的序列以准备随后的选择轮次。在随后的几轮选择中，可以增加结合条件的严格性以识别和选择对靶配体具有高亲和力或选择性的适体序列。SELEX方法的许多变体已经用于适体选择，包括计数器选择，在所述选择中以它们结合不同靶标的性质选择适体，并然后丢弃。
本文提供的组织特异性标志物的适体组分可含有与SEQ ID NO：1-200中任一个相同或相似的序列。在一些情况下，所述适体包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％序列相同性的序列、与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少80％的序列相同性的序列、与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少85％序列相同性的序列、与SEQ ID NO：1-200中的任一个至少90％的序列相同性的序列、或与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少95％的序列相同性的序列。本文提供的组织特异性标志物的适体组分可含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105中的任一个相同或相似的序列。在一些情况下，所述适体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105中的任一个具有至少70％序列相同性的序列，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105中的任一个具有至少80％的序列相同性的序列，与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105中的任一个具有至少85％的序列相同性的序列，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105中的任一个具有至少90％的序列相同性的序列，或与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、或SEQ IDNO：105中的任一个具有至少95％序列相同性的序列。在一些情况下，所述适体包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105的序列。在一些情况下，所述适体包含与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％序列相同性的序列。在一些情况下，所述适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少80％序列相同性的序列。在一些情况下，所述适体包含与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少90％序列相同性的序列。在一些情况下，所述适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少95％序列相同性的序列。
在一些情况下，所述适体可包含以下序列，所述序列包括基序GATACTG。在一些情况下，所述适体可包含具有1、2、3、4或更多个核苷酸取代、插入、转座或缺失的基序GATACTG。例如，所述适体可包含以下序列，所述序列包括GANACTG基序，其中N为dG、dC、dT或dA。在一些情况下，所述适体在所述适体的3′末端包含反向的T。
b.组织特异性标志物的指示物元件
所述适体或亲和体可以将所述标志物定位到所述靶组织，但是为了检测这样的靶向元件，它优选地偶联到一个或多个指示物元件410，所述指示物元件410产生可以由外科医生检测到的信号或者另外可以通过探针或检测器仪器检测到的信号。通常，所述指示物元件可以由外科医生在手术部位内用于术前应用通过皮肤或在手术中检测到。所述指示物元件可以是任何类型的可检测标记，包括荧光团、染料、纳米金刚石、量子点、金纳米颗粒、纳米棒(例如，金纳米棒)、磁珠、氧化铁或金颗粒、聚集诱导的发射点、或纳米晶体。在一些情况下，所述指示物元件在暴露于能量或被能量激发时可发射可见光或近红外。通过顺磁性、光声学或光学在可见光谱内或在可见光区域外(例如在近红外)，使用探针或检测器仪器(例如，互补的金属氧化物半导体(CMOS)相机，电荷偶联显示(CCD)相机)，可以容易地直接检测所述标志物。
在所述组织特异性标志物的术前应用中，可以在皮肤上方检测来自指示物元件的信号，以便识别已经引入患者的组织特异性标志物的位置。以这种方式检测组织特异性标志物可以帮助外科医生决定例如在何处进行切口或者是否需要发生外科手术流程。在一些情况下，可以在手术开始之后检测指示物元件，以在去除所述靶组织时或当去除与所述靶组织毗连的组织时将所述靶组织与邻近组织区分开。
任选地，如图8C中所见的组织特异性标志物可以含有第二指示物元件425，所述第二指示物元件425也可以与所述适体或亲和体或包括所述第一指示物元件410的所述组织特异性标志物的任何其他部分偶联。任选地，如聚乙二醇部分(moiety)420所示，所述标志物可以是PEG化的。在其他实例中，所述标志物可以不是PEG化的。如图8C所见的组织特异性标志物可用于术前和/或在外科手术流程中识别所述靶组织。例如，如本文所述，所述第一指示物元件可以在外科手术流程中用于定位所述靶组织或不期望的组织，和/或所述第二指示物元件可以在术前使用。在外科手术流程中使用所述第一指示物元件的情况下，所述第一指示物元件可以是任何指示物元件，并且不需要是可通过皮肤检测的指示物元件。在外科医生进行切口之前，所述第二指示物元件可以允许所述组织特异性标志物和通过延伸靶组织在术前定位。由所述第二指示物元件发射的信号通常可通过皮肤检测到。因此，在某些情况下，所述第二指示物元件可包含纳米金刚石、氧化铁颗粒等。如本文所述，所述组织特异性标志物的术前识别可以例如使得外科医生能够在决定手术是否必要时或在选择切口部位时做出更明智的决定。在一些特定的实例中，所述组织特异性标志物含有：(a)甲状旁腺特异性适体或亲和体；(b)为荧光团的第一指示物元件；以及(c)可通过皮肤检测的第二指示物元件，例如纳米金刚石或顺磁珠。
所述第一和第二指示物元件通常是可区分的。所述指示物元件中的一个或两个可以是光声的或磁的。一个或两个指示物元件可包括珠子、荧光团、纳米颗粒(例如金纳米颗粒)、纳米棒(例如金纳米棒)、量子点、纳米晶体或其组合。在一些情况下，所述第一和第二指示物元件是相同类型的指示物元件(例如荧光蛋白)，并且可通过颜色或发射波长区分。在一些情况下，所述第一和第二指示物元件是不同类型的指示物元件(例如，纳米金刚石和吲哚菁绿(ICG)荧光团)。在一些情况下，所述指示物元件可包含pH敏感分子。
可以将任何数量的指示物元件偶联到所述适体或亲和体，以允许通过任何数量的手段(包括外科医生的可视化，或者通过使用可以检测所述指示物元件的探针或其他装置)进行检测。例如，可以在5′末端用胺基合成适体，指示物元件(例如荧光团)可以与所述胺基缀合。荧光团可以包括在可见光或近红外范围内发射的荧光团。在一些情况下，所述第一指示物元件是荧光团，并且所述第二指示物元件是不同的荧光团。所述指示物元件可以附着于相同的适体或亲和体或不同的适体或亲和体。在一些情况下，使用附着于不同适体或亲和体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个指示物元件。在一些情况下，使用附着于相同适体或亲和体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个指示物元件。
本文提供的适体或亲和体可以与指示物元件缀合，所述指示元件包括近红外染料或花青染料(例如吲哚菁绿(ICG))。可以在本公开中使用的近红外指示物元件的非限制性列表包括：ICG、IRDye800CW、非磺化花青染料、缀合共聚物、量子点、聚集诱导发射点、金属纳米团簇、单壁碳纳米管、IR-PEG纳米颗粒和/或红外荧光蛋白。
所述指示物元件可以直接与所述适体的多个部分缀合，或者可以使用接头或其他共价连接染料的方式连接。例如，可以在5′末端用胺基合成适体，指示物元件(例如荧光团或染料)可以与所述胺基缀合。
c.对组织特异性标志物的修饰
一旦施用于患者，所述组织特异性标志物可能需要在足够长的时间段内保持完整，以使其能够定位并结合靶组织并在从身体降解或清除(排泄)之前呈现信号。为了防止所述组织特异性标志物在其特异性结合所述靶组织之前或特异性结合所述靶组织时被降解，可以使用修饰的核苷酸或核苷合成所述组织特异性标志物，所述修饰的核苷酸或核苷可以减少或防止降解。另外，如图8B所示，所述组织特异性标志物可任选地进行化学修饰。例如，所述组织特异性标志物可以被PEG化，或被修饰以包含至少一个庞大的聚乙二醇部分420，以减少经由血流的所述组织特异性标志物的清除。
所述适体或亲和体可含有旨在增加稳定性和防止降解的修饰。在一些情况下，所述组织特异性标志物可以被修饰或化学改变以对血液中的DNase更具抗性。在一些情况下，本文提供的组织特异性标志物可具有约或至少约2、3、4、5、10或20分钟的清除时间或半衰期。
适体修饰的实例可包括但不限于聚乙二醇化、使用核苷酸类似物对核酸主链进行化学修饰、在适体的3′末端添加反向T、并入含有亚甲基桥的锁核酸(LNA分子)，并与其他官能团(如PEG和胆固醇)缀合。可以在体外测试适体稳定性。实验可以证明，向所述适体引入修饰(例如，在所述适体的3′末端添加反向的T、或所述适体的PEG化)可以减少适体降解并使所述适体在一定范围的温度和条件下表现出更好的性能。例如，可以通过将适体与血液一起孵育并随时间去除等分试样来测试适体稳定性。可以分离DNA，并且可以进行qPCR反应以定量作为孵育时间的函数保持完整的适体的量。
手术用途
本公开包括将组织特异性标志物用于手术目的的方法。组织特异性标志物可以在术中和/或术前使用。图9中显示了使用所述组织特异性标志物的术中方法的实例。首先，将所述标志物施用于患者510；该施用可以是透皮、口服、静脉内、通过喷雾或通过满灌。施用可包括洗涤步骤或多个洗涤步骤。一旦施用，所述组织特异性标志物的所述适体或亲和体组分以高特异性结合所述靶组织515。在制造者的设计仅具有一个指示物的情况下，进行切口以露出手术部位。然后暴露手术部位并且可以通过能量(例如近红外)激发，并且所述指示物元件将产生可检测的光谱信号520。在一些情况下，所述手术部位不被激发。由于包含所述指示物元件的所述组织特异性标志物唯一地定位于所述靶组织而非邻近组织，因此仅所述靶组织将产生光谱信号，允许外科医生清楚地将一个组织与另一个组织区分开。在甲状腺切除术或甲状旁腺切除术流程中术中使用所述组织特异性标志物(图10)，外科医生可在颈部615的前面中间进行切口630，患者的下巴610在图10A-F中示出以用于透视。所述组织特异性标志物如图10A所见可以用于标记所述甲状旁腺组织625，并且在图10B中所示的激发时，特异性定位于所述甲状旁腺组织中的所述组织特异性标志物可以产生外科医生可以检测并用于引导流程或可以能够去除的信号635，所述流程能够去除所述甲状腺组织620，同时留下产生甲状旁腺组织635完整的信号，所述去除为以对邻近的甲状腺组织620的最小破坏，来去除受影响的甲状旁腺腺体或腺体。任选地，所述组织特异性标志物也可以在术中使用如图10C所示，以特异性地标记包括腺瘤组织640的甲状旁腺组织。这里，所述适体或亲和体组分定位于腺瘤组织640，其在激发时如图10D所示产生信号645，外科医生可以使用所述信号645容易地识别所述腺瘤组织和从邻近组织中去除所述腺瘤组织。所述适体可以特异于甲状旁腺腺瘤，也可以不是正常的甲状旁腺，或者可以设计为识别两者。
任选地，医生或外科医生可以选择同时施用两种或更多种标志物，例如一种特异性靶向异常组织(例如腺瘤640)，以及另一种特异性靶向例如健康甲状腺组织620，并且医生或外科医生可以使用来自所述靶组织的信号的存在或不存在来提取受影响的甲状旁腺，同时避免所述健康的甲状旁腺腺体以及甲状腺组织。通过使用两个或更多个组织特异性标志物，外科医生可以构建手术路线图，其中突出显示多个关键组织。例如，在去除癌性乳房组织期间区分前哨淋巴结与正常淋巴结。任选地，所述组织特异性标志物也可以在术前用作诊断以指导医生或外科医生决定外科手术流程是否必要，或者一旦诊断已经做出，它也可以任选地用于指导切口部位的选择。在诊断或术前应用中，所述组织特异性标志物可以定位于所述靶组织，例如图10E中所示的腺瘤640，并且如图10F所述医生或外科医生可以使用检测器检测来自所述组织特异性标志物的信号645。任选地，医生或外科医生可以检测来自所述组织特异性标志物的信号，并且可以进一步使用该信号来指导在切口之前选择切口部位。该组织特异性标志物可以在术前和术中使用，直到可见可选的第二标志物的信号(例如，荧光)。
图11示出了可用于组合所述组织特异性标志物的术前和术中使用的选项。可以将所述组织特异性标志物施用于患者710，并且然后所述适体或者亲和体可以结合所述靶组织715。医生或外科医生可以使用检测器通过所述组织特异性标志物720的所述一个或多个指示物元件识别所述靶组织的位置。医生或外科医生可以将所述组织特异性标志物施用于靶组织，并且所述组织特异性标志物的所述指示物元件可以在手术之前通过患者的皮肤由探针或检测器650检测，如图10F所示，或者可以由医生或外科医生目视观察。
图12A-12B示出了使用探针检测所述组织特异性标志物用于诊断或术前目的。在施用所述组织特异性标志物之后，医生740或外科医生可以使用探针735来检测来自患者730的信号的存在或不存在以帮助进行诊断。任选地，医生740或外科医生可以使用探针735来检测所述组织特异性标志物，以便对所述靶组织的位置做出更明智的决定，从而允许使用本文所述的任何技术精确选择切口部位。此外，外科医生可以用能量暴露或激发手术部位并使用所述组织特异性标志物来区分所述靶组织725与邻近组织。
系统
本公开包括用于区分靶组织与毗连组织的系统。在一些情况下，所述系统包括本文所述的组织特异性标志物和用于用能量激发一种或多种指示物元件的探针。在一些情况下，所述系统包括用于检测来自所述一个或多个指示物元件的信号的探针。激发探针可以附接到检测器探针或与检测器探针分离。
在一些情况下，所述系统包括：本文所述的组织特异性标志物；第二组织特异性标志物，其包含其配置为结合第二预选靶组织的第二适体或第二受体。所述第二组织特异性标志物可包含与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的一个或多个第二指示物元件，其中所述第二指示物元件在暴露于能量或被能量激发时产生信号，从而允许识别所述第二靶组织。这种系统可包括用于用能量激发所述第一和/或第二组织特异性标志物的第一探针。这种系统可以包括用于检测来自所述一个或多个指示物元件的信号的探针。在一些情况下，这种系统可包括用于用能量激发所述第二组织特异性标志物的第二探针。这种系统还可以包含用于检测来自所述一个或多个第二指示物元件的信号的第二探针。
在一些情况下，本文描述的系统进一步包括照明源。在一些情况下，本文描述的系统进一步包括相机。例如，所述系统可以包括互补金属氧化物半导体(CMOS)相机或电荷偶联显示(CCD)相机。
实施例
实施例1：选择选择性地结合甲状旁腺组织的适体
图13示出了SELEX流程的设计，其导致以高亲和力结合甲状旁腺并且不结合正常甲状腺组织的适体的分离。简而言之，可以使用本领域已知的SELEX流程选择特异性结合或以高亲和力结合甲状旁腺组织的单链DNA适体。在该特定情况下，所述选择文库包括长度为84个核苷酸的寡核苷酸序列，其中40个核苷酸被随机化，前23个核苷酸(5′-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-3′)被保留并用作正向引物识别序列，并且最后21个核苷酸(5′-TTGACTAGTACATGACCACTT-3′)被保留并用作反向引物识别序列。对于阳性选择，允许适体文库在室温下在芯片上与正常人甲状旁腺组织结合。15分钟后，洗涤芯片，并且洗脱并丢弃所有未紧密结合的适体；通过PCR扩增得到的文库。选择策略还包括与正常人甲状腺组织交替进行阴性选择。对于阴性选择，允许通过特异性结合甲状旁腺并扩增而选择的序列文库与正常甲状腺组织芯片结合。孵育后，弃去结合的适体，并选择不结合甲状腺的适体并用PCR扩增。以这种方式，可选地使用正常的人甲状旁腺和甲状腺组织芯片来选择以高于对甲状腺的亲和力与甲状旁腺结合的适体。阴性选择允许识别和去除那些适体，即使它们可能表现出对甲状旁腺的高亲和力，也与甲状腺紧密结合，并因此被丢弃。
通过下一代测序分析对甲状旁腺具有最高亲和力和对甲状腺具有低得多的亲和力的100个序列，并在表1中列出带引物识别序列的这些序列，并在表2中列出不带引物识别序列的这些序列。一旦通过该方法识别，可以通过PCR或从头DNA合成容易且廉价地产生适体。
表1：按序列丰度的顺序包括引物识别序列的全长序列
表2：没有引物识别序列的序列
图14示出了选择用于交替甲状旁腺和甲状腺组织的十二轮选择的第9-14轮选择中的10个不同序列的拷贝数的图，以及针对甲状腺组织的两个随后的选择阴性选择轮次，针对选择轮次绘制。在图14中可以看出，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4都在阳性选择条件下(第12轮选择)拷贝数(频率)增加和在针对甲状腺组织的两轮选择(第13和14轮选择)之后拷贝数(频率)减少。鉴于这些序列在阴性选择条件下具有最低拷贝数，为了找到一级序列或二级/三级共同元件，进一步检查它们。
图15示出了SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104的序列比对。SEQ ID NO：103和SEQID NO：104分别是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的可变区，没有共同的引物识别序列。使用EMBOSS Needle成对核苷酸序列比对来比对两个序列。该比对如图15所示显示了两个序列中共同的5′-GATACTG-3′基序，其在表1中的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列中以及在表2中SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104的序列中加下划线。SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4显示相对于人甲状腺组织对人甲状旁腺组织的高结合选择性。基于阳性选择对阴性靶标的影响的分析，确定了适体序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对于与甲状旁腺组织的结合表现出特别有希望的特异性。在相同的健康人甲状旁腺载玻片上测试SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，以证实它们实际上对用于阳性选择的甲状旁腺组织具有高亲和力。结果表明适体SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4都与健康人甲状旁腺良好结合。
图16显示了用于测试适体与组织载玻片的特异性结合的通用方案。使浓度为1μM的6-FAM荧光素标记的适体与载玻片上的组织结合半小时，并然后用PBS洗涤两次。该方案可以通过使用单个组织载玻片作为靶标，或通过使用组织微阵列来测试，其中表示许多不同的组织，例如一式三份。如果标记的适体具有与任何组织结合的自由度，则这允许竞争性测定。严格洗涤后，只有适体以高亲和力结合的组织将显示阳性荧光信号。
实施例2：确认甲状旁腺特异性
图17A-G证实了SEQ ID NO：3与正常人甲状旁腺组织载玻片(用于其选择的相同确切组织)的结合。图18A-G证实了SEQ ID NO：4与正常人甲状旁腺组织载玻片(与用于其阳性选择的芯片相同)的结合。图19显示缺乏与正常甲状腺组织载玻片的结合，类似于用于适体的阴性选择的芯片。图19A显示SEQ ID NO：3与甲状腺的结合；图19B显示SED ID NO：4与正常甲状腺的结合。为了测试这些适体是否不仅结合正常的甲状旁腺组织而且还结合受影响的甲状旁腺腺瘤组织，还进行了这些两种适体与甲状旁腺腺瘤组织载玻片的结合。图20A和图20B分别显示了与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的甲状旁腺腺瘤结合的结果。
实施例3：确认整体甲状旁腺特异性
进行额外的测试以确认适体表现出的甲状旁腺特异性不是供体特异性决定簇的结果。因此，在额外的甲状旁腺载玻片上测试适体，所述载玻片源自完全不同的供体。图21A和21B分别显示了SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4在两个额外的和不相关的甲状旁腺样品上结合的结果，证明适体特异性靶向甲状旁腺而不是供体特异性决定簇。
实施例4：适体与脂肪、淋巴结、口咽和胸腺样品结合的分析
例如，对于选择的适体在外科甲状腺切除术环境中工作，需要适体不仅与其同类靶标特异性结合，而且与邻近组织的结合也很少(如果有的话)。在这种情况下，需要适体对脂肪、淋巴结或胸腺(儿童中)表现出最小的或没有特异性结合特性。在结合和严格洗涤后，使用FITC设置在显微镜上可视化组织样品。控制每个组织的背景荧光，以准确地确定特异性结合与无结合。图22A和22B分别显示SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4与脂肪组织的结合。同样地，图23A和23B分别显示SEQ ID NO：3和SEQ ID NO4与淋巴结组织的结合。图24A和24B分别说明了SEQ ID NO：3和SEQ ID NO4与口咽组织的结合。最后，图25A和25B分别说明了SEQID NO：3和SEQ ID NO4与儿童正常胸腺组织的结合。适体与所有测试的甲状旁腺样本结合，但始终不与甲状腺、脂肪、胸腺或口咽组织结合。
实施例5：生物分布：适体与多种正常人组织样品结合的分析
使用正常组织人样品微阵列测试基于荧光适体的人组织结合和区分。在适体结合和严格洗涤后，使用FITC设置在显微镜上可视化组织样品。控制每个组织的背景荧光，以准确地确定特异性结合与无结合。
图26A绘制了组织微阵列载玻片上的多种正常人组织的分布和一式三份位置。从这些结合测定获得的数据可以在一旦施用该标志物给出适体在患者体内分布的指示。此外，组织微阵列可用于测试适体、指示物元件和具有结合的指示物元件的适体的体外生物分布。这些研究的结果可包括缺乏自发荧光的测量。例如，如前所述的人组织微阵列可以用作快速和有效的方式，以确保组织特异性标志物或适体选择性地结合感兴趣的期望的靶组织而基本上不与任何邻近的非靶组织结合。它额外地可以用于评估标记的适体对所代表的每种组织的相对亲和力。
本文所述的示例性微阵列(图26A-B)包含34种不同的正常人组织(每种一式三份)，包括甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、膀胱、小脑、大脑皮层、乳房、宫颈、结肠、子宫内膜、输卵管、胆囊、心脏、空肠、肾、肝、肺、淋巴、肌肉、神经、食管、卵巢、胰腺、腮腺、垂体、胎盘、前列腺、皮肤、脊柱、脾、胃、睾丸、扁桃体和输尿管组织。在微阵列载玻片上测试三种不同的荧光标记的适体中的每一种。
图27和图28分别显示了适体SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4与微阵列上表示的组织的结合。适体在5′末端用6-FAM荧光素标记，并在PBS中以1uM的浓度稀释，并使其与微阵列结合30分钟，之后将载玻片洗涤多次并用荧光敏感显微镜成像。如图27中针对SEQ ID NO：3和图28中针对SEQ ID NO：4所示，微阵列研究证实选择的适体以高亲和力结合微阵列中代表的甲状旁腺组织，但不与甲状腺样品结合(见表3)。适体不与大多数组织结合，包括：肌肉、皮肤、脑、结肠、肝、淋巴结等(见表3)。令人惊讶的是，测试的适体与胎盘结合，以及一些与其他雌性生殖器官如子宫颈、卵巢、子宫内膜等结合(见表3)。
当与组织例如神经结合时，所选择的适体表现不同，其中SEQ ID NO：4比SEQ IDNO：3似乎更好地结合微阵列上代表的神经组织。有可能来自神经周围组织的背景信号的差异可能有助于结合检测的差异。鉴于不仅在一级序列中而且在三级结构中存在差异，适体也可能具有与其他器官不同的结合特异性。
表3.微阵列的组织学结果
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (99)

1.组织特异性标志物，所述组织特异性标志物包括：
适体或亲和体，其被配置为选择性地结合非恶性靶组织；和
偶联至所述适体或所述亲和体的至少第一指示物元件，其中所述至少第一指示物元件产生信号，从而允许识别所述非恶性靶组织。
2.权利要求1的组织特异性标志物，其中所述组织特异性标志物包含被配置为选择性地结合所述非恶性靶组织的所述适体，并且其中所述适体包含DNA、RNA、肽或其任何组合。
3.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含核酸。
4.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含修饰的核苷酸或核苷。
5.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体是PEG化的。
6.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体在所述适体的3′末端包含反向的T。
7.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体具有至多100个核苷酸的长度。
8.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含RNA或DNA，或RNA和DNA两者。
9.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体以1pM至1mM范围的亲和力结合所述非恶性靶组织。
10.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性组织是非脂肪的健康组织。
11.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性组织不是健康组织。
12.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体以比所述适体结合非靶组织的亲和力高至少2倍的亲和力选择性地结合所述非恶性靶组织。
13.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织包括甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。
14.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织包括甲状旁腺。
15.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织是人组织。
16.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织是非人组织。
17.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织是腺体组织。
18.权利要求17的组织特异性标志物，其中所述腺体组织是外分泌腺组织或内分泌腺组织。
19.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体被配置为相对于第二腺体选择性地结合第一腺体。
20.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体被配置为相对于所述非恶性靶组织附近的组织优先地结合所述非恶性靶组织。
21.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体被配置为相对于至少一种选自脂肪、胸腺、淋巴结和咽组织的组织优先地结合所述腺体组织。
22.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体被配置为选择性地结合健康的甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。
23.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体被配置为选择性地结合所述健康的甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织两者。
24.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体相对于甲状腺组织优先地结合所述健康的甲状旁腺组织或所述甲状旁腺腺瘤组织。
25.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体相对于所述甲状腺组织优先地结合所述健康的甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织。
26.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体或所述亲和体相对于至少一种选自脂肪、胸腺、淋巴结和咽组织的组织优先地结合所述健康的甲状旁腺组织或所述甲状旁腺腺瘤组织。
27.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织包括神经、血管、输尿管、胆管、子宫内膜组织、肝管、淋巴结、细菌或真菌。
28.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述非恶性靶组织包括雌性生殖组织，例如子宫内膜或子宫。
29.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％序列相同性的序列。
30.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ ID NO：100-110中的任一个具有至少70％序列相同性的序列。
31.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％序列相同性的序列。
32.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104具有至少70％序列相同性的序列。
33.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。
34.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述适体包含序列，所述序列包括基序GATACTG。
35.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件在暴露于能量或被能量激发时产生所述信号。
36.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所产生的信号在磁、声、可见、近红外或红外光谱内。
37.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包含荧光团。
38.权利要求37的组织特异性标志物，其中所述荧光团是近红外染料。
39.权利要求37的组织特异性标志物，其中所述荧光团是花青染料。
40.权利要求37的组织特异性标志物，其中所述荧光团是吲哚菁绿。
41.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包括量子点。
42.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包含酶或蛋白质。
43.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包含纳米金刚石。
44.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包括光声转换器元件。
45.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包含纳米颗粒或纳米棒。
46.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包含珠或纳米晶体。
47.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件与所述适体、所述亲和体或第二指示物元件共价偶联。
48.前述权利要求中任一项的组织特异性标志物，其中所述至少第一指示物元件包含第一指示物元件和第二指示物元件，所述第一指示物元件为荧光团，所述第二指示物元件为纳米金刚石。
49.一种用于区分靶组织与毗连组织的系统，所述系统包括：
前述权利要求中任一项的组织特异性标志物；和
用于用能量激发所述组织特异性标志物的装置和/或用于检测来自所述一个或多个指示物元件的所述信号的检测器。
50.权利要求49的系统，其中用于用能量激发所述组织特异性标志物的装置是照明源。
51.前述权利要求中任一项的系统，其中所述检测器包括相机。
52.一种用于区分靶组织与毗连组织的系统，所述系统包括：
前述权利要求中任一项的组织特异性标志物；
第二组织特异性标志物，其包含第二适体或第二亲和体，所述第二适体或第二亲和体被配置为结合第二靶组织；和与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的第二指示物元件，其中所述第二指示物元件产生信号，从而允许识别所述第二靶组织；和
用于用能量激发所述组织特异性标志物的第一装置或用于检测来自所述第一或第二指示物元件中的任何一个或来自所述第一和第二指示物元件两者的所述信号的检测器。
53.权利要求52的系统，所述系统包括照明源。
54.前述权利要求中任一项的系统，所述系统包括相机。
55.前述权利要求中任一项的系统，其中非恶性靶组织是甲状旁腺组织，并且所述第一指示物元件是第一荧光团，并且其中所述第二靶组织是神经、淋巴结或甲状腺组织，并且所述第二指示物元件是不同于所述第一荧光团的第二荧光团。
56.一种区分组织的方法，所述方法包括：
将与一种或多种指示物元件偶联的适体或亲和体递送到对象体内；
允许所述适体或所述亲和体与所述对象体内的正常或非恶性靶组织结合；
检测由所述一个或多个指示物元件产生的信号或检测所述一个或多个指示物元件；和
基于来自所述一个或多个指示物元件检测到的所述信号将所述正常或非恶性靶组织与毗连组织区分开。
57.权利要求56的方法，进一步包括用能量暴露或激发与所述适体或所述亲和体偶联的所述一种或多种指示物元件。
58.权利要求56的方法，其中递送所述适体或所述亲和体包括将所述适体或所述亲和体经皮递送、喷雾、满灌、口服递送或静脉内递送至所述非恶性靶组织。
59.权利要求56的方法，其中递送所述适体或所述亲和体包括洗涤步骤。
60.权利要求56的方法，进一步包括在所述毗连组织上进行医疗流程而不损伤所述非恶性靶组织。
61.权利要求56的方法，进一步包括在所述非恶性靶组织上进行医疗流程而不损伤所述毗连组织。
62.权利要求56的方法，其中所述非恶性靶组织是甲状旁腺腺瘤，并且所述方法进一步包括去除至少一部分所述甲状旁腺腺瘤而不损伤毗连的甲状腺组织。
63.权利要求56的方法，其中所述非恶性靶组织是甲状旁腺组织，并且所述方法进一步包括去除毗连甲状腺组织的至少一部分而不损伤或去除所述甲状旁腺组织。
64.权利要求56的方法，其中所述适体或所述亲和体选择性地结合健康的甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。
65.权利要求56的方法，其中所述适体或所述亲和体选择性地结合健康的甲状旁腺组织和所述甲状旁腺腺瘤组织两者。
66.权利要求56的方法，其中所述适体或所述亲和体相对于毗连甲状腺组织选择性地结合健康甲状旁腺组织和甲状旁腺腺瘤组织两者。
67.权利要求56的方法，进一步包括检测所述一个或多个指示物元件的第一组和所述一个或多个指示物元件的第二组，其中所述第一组在大于所述第二组的距所述组织特异性标志物的距离被检测到。
68.权利要求67的方法，其中在所述对象体外检测所述第一组，并在进行手术切口后检测所述第二组。
69.权利要求56的方法，其中识别所述非恶性靶组织包括使来自所述一个或多个指示物元件的所述信号可视化。
70.权利要求56的方法，其中检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括用检测器检测光谱信号。
71.权利要求56的方法，其中检测来自所述一个或多个指示物元件的信号包括用相机检测光谱信号。
72.权利要求56的方法，进一步包括基于检测到的光谱信号形成诊断。
73.权利要求56的方法，其中检测来自所述一个或多个指示物元件的所述信号包括术前检测所述信号。
74.权利要求56的方法，其中检测来自所述一个或多个指示物元件的所述信号包括在术中检测所述信号。
75.权利要求56的方法，其进一步包括：
将与所述一种或多种指示物元件偶联的第二适体或第二亲和体递送到所述对象体内；
允许所述第二适体或所述第二亲和体与第二靶组织结合，其中所述第二靶组织与所述正常或非恶性靶组织不同；
用能量暴露或激发与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件；
检测由与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件产生的光谱信号，或检测与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件；和
基于与所述第二适体或所述第二亲和体偶联的所述一个或多个指示物元件检测到的所述光谱信号，从所述正常或非恶性靶组织识别所述第二靶组织。
76.一种适体，其选择性地结合甲状旁腺腺体或甲状旁腺腺瘤。
77.权利要求76的适体，其中所述适体包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％序列相同性的序列。
78.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ IDNO：100-110中的任一个具有至少70％序列相同性的序列。
79.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％序列相同性的序列。
80.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104具有至少70％序列相同性的序列。
81.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。
82.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含序列GATACTG。
83.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体以比所述适体结合甲状腺腺体的亲和力高至少10倍的亲和力选择性地结合所述甲状旁腺腺体或所述甲状旁腺腺瘤。
84.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含DNA。
85.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体包含RNA。
86.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体结合正常、健康或非恶性甲状旁腺腺体。
87.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体被配置为选择性地结合健康的甲状旁腺组织和甲状旁腺腺瘤组织两者。
88.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体相对于甲状腺组织优先地结合健康甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。
89.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体相对于甲状腺组织优先地结合健康甲状旁腺组织和甲状旁腺腺瘤组织。
90.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体相对于至少一种选自脂肪、胸腺、淋巴结和口咽组织的组织优先地结合健康甲状旁腺组织或甲状旁腺腺瘤组织。
91.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体选择性地结合人组织。
92.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体被配置为相对于不同类型的腺体组织选择性地结合甲状旁腺组织。
93.前述权利要求中任一项的适体，其中所述适体被配置为相对于正常、健康或非恶性靶组织附近的组织优先地结合所述正常、健康或非恶性靶组织。
94.一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1-200中的任一个具有至少70％序列相同性的序列，其中所述序列包含至少10个连续核苷酸的非天然序列或所述序列包含至少一个修饰的核苷酸。
95.权利要求94的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1-10和SEQ ID NO：100-110中的任一个具有至少70％序列相同性的序列。
96.权利要求94的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQID NO：104或SEQ ID NO：105具有至少70％序列相同性的序列。
97.权利要求94的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：103或SEQ ID NO：104具有至少70％序列相同性的序列。
98.权利要求94的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：103或SEQ ID NO：104的序列。
99.权利要求94的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列GATACTG。
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