CN109796518A - 一种微生物和蛋白酶协同作用生产的抗氧化活性肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗氧化活性肽及其制备方法，属于活性肽制备技术领域。本发明所述抗氧化活性肽的制备方法包括以下步骤：1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶，离心，干燥，得到抗氧化活性肽。本发明所述抗氧化活性肽分子量低(分布在1500Da以下约占78％)、苦味值低、肽段的疏水性氨基酸数量低且生物活性高，具有较高的抗氧化活性。

Description

一种微生物和蛋白酶协同作用生产的抗氧化活性肽及其制备 方法

技术领域

本发明涉及活性肽制备技术领域，具体涉及一种微生物和蛋白酶协同作用生产的高抗氧化活性肽及其制备方法。

背景技术

自由基危害作用极强，机体在正常状态下，体内自由基的产生和修复是平衡的，当人体内的自由基过剩时，会造成一系列的疾病，如心脑血管疾病、癌症和脑血栓等。自由基对如DNA、蛋白质和脂类等生物大分子也有一定的攻击作用。抗氧化剂可以有效清除机体内过多的自由基，防止机体老化。目前市场上使用较多的是化学合成的抗氧化剂，如叔丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等，这些抗氧化剂虽然抗氧化效果很好，但对人体的肝、肺等有害，同时还具有蓄积性致癌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物和蛋白酶协同作用生产的抗氧化活性肽。本发明所述抗氧化活性肽分子量低、苦味值低、肽段的疏水性氨基酸数量低且生物活性高，具有较高的抗氧化活性。

本发明提供了一种抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的制备方法包括以下步骤：

1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；

2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5；

3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6；

4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。

优选的是，步骤1)所述去淀粉处理后，还包括高温蒸煮的过程。

优选的是，所述高温蒸煮的条件包括：蒸煮压力为0.1MPa，温度为121℃，时间为25～35min。

优选的是，步骤1)所述大豆蛋白粉和去淀粉处理的玉米蛋白粉的总质量浓度为8～12％。

优选的是，步骤1)所述大豆蛋白粉和去淀粉处理的玉米蛋白粉的混合质量比为(2.5～3.5):(6.5～8)。

优选的是，步骤2)所述米曲霉种曲的接种量为玉米大豆蛋白复配物质量的8～12％。

优选的是，步骤3)所述碱性蛋白酶的添加量为所述玉米大豆蛋白第一阶段水解物质量的0.6～2.0％。

优选的是，步骤4)所述灭酶处理的条件包括：100℃加热10～20min。

优选的是，步骤4)所述离心的条件包括：3500～4500r/min离心15～20min。

本发明还提供了上述技术方案所述抗氧化活性肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；

2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5；

3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6；

4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。

本发明提供了一种微生物和蛋白酶协同作用生产的抗氧化活性肽。本发明所述抗氧化活性肽分子量低、苦味值低、肽段的疏水性氨基酸数量低且生物活性高，具有较高的抗氧化活性。试验结果表明，本发明抗氧化活性肽分子量分布在1500Da以下约占78％；抗氧化活性肽体外抗氧化试验表明，本发明抗氧化活性肽具有良好的体外抗氧化活性；利用Caco-2细胞(人结肠癌细胞)模型分析抗氧化活性肽对细胞内活性氧的清除能力和其对细胞内抗氧化活性的影响，结果显示，本发明抗氧化活性肽对细胞没有毒性，具有清除细胞内活性氧的能力，且有量效依赖关系，具有良好的细胞内抗氧化活性；氨基酸组成试验结果表明，将玉米蛋白和大豆蛋白复配后，本发明抗氧化活性肽的氨基酸组成更加均衡，更符合人体氨基酸的需求。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的时间对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物水解度和可溶性蛋白含量的影响结果图；

图2为本发明实施例4提供的时间对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物水解物·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力的影响结果图；

图3为本发明实施例4提供的温度对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物水解度和可溶性蛋白含量的影响；

图4为本发明实施例4提供的温度对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物水解物·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力的影响；

图5为本发明实施例4提供的pH对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物水解度和可溶性蛋白含量的影响；

图6为本发明实施例4提供的pH对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物水解物·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力的影响；

图7为本发明实施例5提供的时间对米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物水解度和可溶性蛋白含量的影响；

图8为本发明实施例5提供的时间对米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物水解物·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力的影响；

图9为本发明实施例5提供的温度对米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物水解度和可溶性蛋白含量的影响；

图10为本发明实施例5提供的温度对米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物水解物·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力的影响；

图11为本发明实施例5提供的pH对米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物水解度和可溶性蛋白含量的影响；

图12为本发明实施例5提供的pH对米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物水解物·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力的影响；

图13为本发明实施例8提供的碱性蛋白酶水解产物、米曲霉种曲水解产物、碱性蛋白酶和米曲霉种曲不同加酶顺序和不同加酶量协同水解玉米大豆蛋白复配物获得蛋白水解产物的分子量分布图；

图14为本发明实施例9提供的抗氧化活性肽对Caco-2细胞存活率的影响；

图15为本发明实施例10提供的抗氧化活性肽+H₂O₂对细胞存活率的影响；

图16为本发明实施例11提供的Trolox和抗氧化活性肽对荧光强度的影响；

图17为本发明实施例11提供的Trolox和抗氧化活性肽的CAA活性值。

具体实施方式

本发明提供了一种抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的制备方法包括以下步骤：

1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；

2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5；

3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6；

4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。

本发明将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物。本发明本发明对所述去淀粉处理方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规去淀粉处理方法即可。具体地，在本发明实施例中，所述去淀粉处理的过程优选包括以下步骤：使用去离子水将玉米蛋白粉配置成质量浓度为10％的悬液，并用1M的NaOH和1M的HCl调节悬液pH至6.5，待悬液温度升至65℃，加入E/S＝1％的α-淀粉酶，加酶之后开始计时2h，用1M的NaOH调节pH使其稳定在6.5，反应完成后于100℃沸水中灭酶15min，然后于4000r/min离心15min，去除上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3次。将沉淀烘干，得到去淀粉处理的玉米蛋白粉。在本发明中，所述去淀粉处理后，还包括高温蒸煮的过程。本发明优选将去淀粉处理的玉米蛋白粉与水按照1：2.5(m/V)混合后进行高温蒸煮处理。在本发明中，所述高温蒸煮的条件包括：蒸煮压力为0.1MPa，温度为121℃，时间为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述大豆蛋白粉和去淀粉处理的玉米蛋白粉在水中的总质量浓度为8～12％，更优选为10％。在本发明中，所述大豆蛋白粉和去淀粉处理的玉米蛋白粉的混合质量比为(2.5～3.5):(6.5～8)，更优选为3:7。在本发明中，所述大豆蛋白粉优选为大豆分离蛋白。本发明对所述大豆分离蛋白的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规大豆分离蛋白制备方法即可，如常规的碱提酸沉法。本发明所述玉米蛋白粉溶解性差，与大豆蛋白复配后，溶解性问题得到解决，且氨基酸组成均衡，水解后得到的小分子肽的苦味也相应地降低。玉米蛋白中含有较多的亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等疏水性氨基酸，且缺乏赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸，水溶性差，加工性能不好，人体消化利用率低，营养价值不高，与大豆分离蛋白(蛋白纯度高，蛋白含量在90％以上(以干基计)，富含赖氨酸和色氨酸等必需氨基酸)复配后，水解得到的产物蛋白含量增加，氨基酸的组成更合理。

得到玉米大豆蛋白复配物后，本发明将米曲霉种曲接种于玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5。在本发明中，所述反应温度优选为55℃，反应时间优选为22h，pH值优选为8.5。在本发明中，所述米曲霉种曲的接种量为玉米大豆蛋白复配物质量的8～12％，更优选为10％。

得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物后，本发明将碱性蛋白酶与玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6。在本发明中，所述反应温度优选为60℃，反应时间优选为3h，pH值优选为8.5。在本发明中，所述碱性蛋白酶的添加量为所述玉米大豆蛋白第一阶段水解物质量的0.6～2.0％，更优选为0.8％。米曲霉在发酵过程中，会产生复杂的蛋白酶系，它们的活力不高，能够将大分子蛋白质的空间结构破坏，使能被碱性蛋白酶作用的位点大量暴露，碱性蛋白酶水解效率得到提高。

得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物后，本发明将玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。在本发明中，所述灭酶处理的条件包括：100℃加热10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述离心的条件包括：：3500～4500r/min离心15～20min，更优选为4000r/min离心15min。本发明对所述干燥的方式没有特殊的限定，优选为冷冻干燥法或喷雾干燥法，具体地，本发明优选采用喷雾干燥的方法。

本发明还提供了上述技术方案所述抗氧化活性肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；

2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5；

3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6；

4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。

本发明所述制备方法的具体条件同上文，在此不再赘述。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种微生物和蛋白酶协同作用生产的抗氧化活性肽及其制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

玉米蛋白粉的预处理：玉米蛋白粉做去淀粉和高温蒸煮预处理。使用去离子水将玉米蛋白粉配置成质量浓度为10％的悬液，并用1M的NaOH和1M的HCl调节悬液pH至6.5，待悬液温度升至65℃，加入E/S＝1％的α-淀粉酶，加酶之后开始计时2h，用1M的NaOH调节pH使其稳定在6.5，反应完成后于100℃沸水中灭酶15min，然后于4000r/min离心15min，去除上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3次。将沉淀烘干，待用。

将经去淀粉处理后烘干的玉米蛋白粉以料液(水)比为1：2.5(m/V)进行高温蒸煮预处理，蒸煮压力为0.1MPa，温度为121℃，时间为30min。蒸煮后将样品烘干。

将预处理后的玉米蛋白粉和大豆蛋白以7：3的比例复配，与水混合配置成底物浓度为10％的悬浮液，在米曲霉种曲的水解条件(加酶量为E/S＝10％(w/w)，反应体系温度为55℃，pH为8.5，水解时间为22h)下，加入米曲霉种曲，反应过程中滴加0.5M的NaOH保持反应体系的pH恒定。等米曲霉种曲反应结束后，不进行灭酶处理，将反应体系的温度和pH调整到碱性蛋白酶的水解反应条件(加酶量为E/S＝0.8％(w/w)，温度为60℃，pH为8.5，水解时间为3h)下，加入碱性蛋白酶，反应过程中滴加1M的NaOH保持pH恒定。反应结束后将反应体系于100℃沸水中灭酶15min，于4000r/min离心15min，将上清进行喷雾干燥，得到抗氧化活性肽。

实施例2

玉米蛋白粉的预处理：玉米蛋白粉做去淀粉和高温蒸煮预处理。使用去离子水将玉米蛋白粉配置成质量浓度为10％的悬液，并用1M的NaOH和1M的HCl调节悬液pH至6.5，待悬液温度升至65℃，加入E/S＝1％的α-淀粉酶，加酶之后开始计时2h，用1M的NaOH调节pH使其稳定在6.5，反应完成后于100℃沸水中灭酶15min，然后于4000r/min离心15min，去除上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3次。将沉淀烘干，待用。

将经去淀粉处理后烘干的玉米蛋白粉以料液(水)比为1：2.5(m/V)进行高温蒸煮预处理，蒸煮压力为0.1MPa，温度为121℃，时间为35min。蒸煮后将样品烘干。

将预处理后的玉米蛋白粉和大豆蛋白以7.5：3.5的比例复配，与水混合配置成底物浓度为11％的悬浮液，在米曲霉种曲的水解条件(加酶量为E/S＝10％(w/w)，反应体系温度为56℃，pH为7.5，水解时间为23h)下，加入米曲霉种曲，反应过程中滴加0.5M的NaOH保持反应体系的pH恒定。等米曲霉种曲反应结束后，不进行灭酶处理，将反应体系的温度和pH调整到碱性蛋白酶的水解反应条件(加酶量为E/S＝0.75％(w/w)，温度为55℃，pH为8.6，水解时间为2.5h)下，加入碱性蛋白酶，反应过程中滴加1M的NaOH保持pH恒定。反应结束后将反应体系于100℃沸水中灭酶20min，于4500r/min离心15min，将上清进行冷冻干燥，得到抗氧化活性肽。

实施例3

玉米蛋白粉的预处理：玉米蛋白粉做去淀粉和高温蒸煮预处理。使用去离子水将玉米蛋白粉配置成质量浓度为10％的悬液，并用1M的NaOH和1M的HCl调节悬液pH至6.5，待悬液温度升至65℃，加入E/S＝1％的α-淀粉酶，加酶之后开始计时2h，用1M的NaOH调节pH使其稳定在6.5，反应完成后于100℃沸水中灭酶15min，然后于4000r/min离心15min，去除上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3次。将沉淀烘干，待用。

将经去淀粉处理后烘干的玉米蛋白粉以料液(水)比为1：2.5(m/V)进行高温蒸煮预处理，蒸煮压力为0.1MPa，温度为121℃，时间为28min。蒸煮后将样品烘干。

将预处理后的玉米蛋白粉和大豆蛋白以7：2.5的比例复配，与水混合配置成底物浓度为12％的悬浮液，在米曲霉种曲的水解条件(加酶量为E/S＝11％(w/w)，反应体系温度为58℃，pH为9.0，水解时间为24h)下，加入米曲霉种曲，反应过程中滴加0.5M的NaOH保持反应体系的pH恒定。等米曲霉种曲反应结束后，不进行灭酶处理，将反应体系的温度和pH调整到碱性蛋白酶的水解反应条件(加酶量为E/S＝0.85％(w/w)，温度为56℃，pH为8.5，水解时间为2.5h)下，加入碱性蛋白酶，反应过程中滴加1M的NaOH保持pH恒定。反应结束后将反应体系于100℃沸水中灭酶15min，于4000r/min离心20min，将上清进行喷雾干燥，得到抗氧化活性肽。

实施例4

碱性蛋白酶水解玉米大豆复配物

将预处理的玉米蛋白粉和大豆分离蛋白按质量比为7：3的比例进行复配，使用去离子水将复配物配成质量浓度为10％的溶液，加入碱性蛋白酶，在磁力搅拌器中进行水解。反应过程中使用1M的NaOH调节pH，使其保持稳定。反应结束后，于沸水浴中灭酶15min，冷却至室温后，4000r/min离心10min。测定上清液中的可溶性蛋白含量和抗氧化活性，并将上清冷冻干燥后待用。

①不同时间条件下碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物

在底物浓度10％(玉米蛋白粉：大豆分离蛋白＝7:3)、温度为60℃、E/S＝2％、pH为8.5，碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物。不同水解时间对应的水解液DH及可溶性蛋白含量如图1所示，·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力如图2所示。由图1可知，玉米大豆蛋白复配物的水解度在120min以后基本维持稳定，此时水解度为24.06％，可溶性蛋白含量为46.66mg/mL。随着时间的延长，水解度增长缓慢，可溶性蛋白含量在160min时还略有下降。由图2可知，随着反应时间增长，水解物的·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力呈现不规则变化，但总体来说水解物的抗氧化活性较高，反应结束后DPPH自由基清除率提高了30％；而Fe²⁺螯合能力提高了10％左右。综合图1和图2，在本申请保护的水解时间范围(2～3h)内，水解效率高。

②不同温度条件下，碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物

在底物浓度10％(玉米蛋白粉：大豆分离蛋白＝7:3)、pH为8.5、E/S＝2％、反应时间为3h，碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物，设置温度梯度为50、55、60、65和70℃。不同水解温度对应的水解液DH及可溶性蛋白含量如图3所示，·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力如图4所示。由图3可知，温度对碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物有着显著的影响。当水解温度为55～60℃时，碱性蛋白酶水解效果最好，尤其是60℃时，此时的DH为25.09％，可溶性蛋白为62.39mg/mL，均为最高值。当温度不在55～60℃范围内时，水解速率明显降低。由图4可以看出水解物的·DPPH清除率在水解温度为60℃时达到了最高值77.65％，亚铁离子螯合能力在水解温度为50℃时达到了最高值60％。水解温度为55～60℃时，DH、可溶性蛋白含量、·DPPH清除率和亚铁离子螯合的综合能力最佳。

③不同pH碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物

在底物浓度10％(玉米蛋白粉：大豆分离蛋白＝7:3)、温度为60℃、E/S＝2％、反应时间为3h，碱性蛋白酶水解玉米大豆蛋白复配物，设置pH梯度为8.0、8.5和9.0。不同pH条件对应的水解液DH及可溶性蛋白含量如图5所示，·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力如图6所示。由图可知，碱性蛋白酶在pH为8.5时水解效果最好，此时的DH、可溶性蛋白含量和抗氧化活性均达到最好的效果，在pH为9.0时DH、可溶性蛋白含量和抗氧化活性均明显下降，碱性蛋白酶酶活严重损失。

实施例5

米曲霉种曲水解玉米大豆复配物

①不同时间条件下米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物

在底物浓度10％(玉米蛋白粉：大豆分离蛋白＝7:3)、温度为55℃、E/S＝10％、pH为8.5，米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物。不同水解时间对应的水解液DH及可溶性蛋白含量如图7所示，·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力如图8所示。由图7可知DH在前5小时以内基本不变，DH大概为2.1％左右，但从5h到10h之间，水解度呈指数型增长，在10h以后又趋于稳定，增长缓慢。出现这种情况的原因，可能是，在前5h时米曲霉还在继续生长，并不断产生蛋白酶，5h到10h之间米曲霉产蛋白酶到达顶峰，DH急剧增加，而10h以后反应体系中的蛋白酶将能切割的位点基本切割完全，DH呈现缓慢增长的趋势。由图8可知，水解物的·DPPH清除率随着反应时间的延长变化不规律，但在22h时，·DPPH清除率达到了20.23％，对比DPPH清除率在8h的最高值23.69％相差不大，亚铁离子螯合能力呈现的趋势可·DPPH清除率相一致，在22h时也能达到43.23％。22～24h为最佳水解时间。

②不同温度下米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物

在底物浓度10％(玉米蛋白粉：大豆分离蛋白＝7:3)、E/S＝10％、pH为8.5、水解时间为22h，米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物，设置温度梯度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃。不同水解温度对应的水解液DH及可溶性蛋白含量如图9所示，·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力如图10所示。由图9可知，温度为55～60℃时，尤其是55℃时，水解效果最佳，此时的DH为8.53％，可溶性蛋白含量为27.34mg/mL。其他温度下，DH和可溶性蛋白含量明显较低。由图10可以看出，在不同的水解温度下，·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力变化趋势不明显，有高有低，与水解度和可溶性蛋白含量没有太大关联，在55～60℃时·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力较好，抗氧化活性高。

③不同pH条件下米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物

在底物浓度10％(玉米蛋白粉：大豆分离蛋白＝7:3)、E/S＝10％、温度为55℃、水解时间为22h，米曲霉种曲水解玉米大豆蛋白复配物，设置pH梯度为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。不同pH条件对应的水解液DH及可溶性蛋白含量如图11所示，·DPPH清除率和Fe²⁺螯合能力如图12所示。由图11可知米曲霉种曲pH为7～9.5时，水解效果均很好，尤其是8.5，此时的DH和可溶性蛋白含量分别为8.53％和27.34mg/mL。

实施例6

米曲霉种曲(米)和碱性蛋白酶(A)不同加入顺序对水解效果的影响

在玉米大豆蛋白复配物的底物浓度为10％的条件下，考察碱性蛋白酶和米曲霉种曲在不同的加酶顺序和不同的加酶量的条件下(将预处理后的玉米蛋白粉和大豆蛋白以7：3的比例复配，配置成底物浓度为10％的悬浮液，在第一种酶合适的水解条件下，加入第一种酶，反应过程中滴加0.5M的NaOH保持反应体系的pH恒定。等第一种酶反应结束后，不进行灭酶处理，将反应体系的温度和pH调整到第二种酶的合适条件下，加入第二种酶，反应过程中滴加0.5M的NaOH保持pH恒定。反应结束后将反应体系于沸水中灭酶15min，于4000r/min离心15min，取上清)，协同水解玉米大豆蛋白复配物获得蛋白水解物的DH、可溶性蛋白含量、·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力的结果如表1所示：

表1酶底比与碱性蛋白酶+米曲霉种曲协同水解玉米大豆蛋白复配物的影响

由表1可知，先加入米曲霉，后加入碱性蛋白酶，水解产物的DH和可溶性蛋白含量高，能够得到小于1500KDa的小分子肽。碱性蛋白酶加酶量为0.8％时，它的水解度和可溶性蛋白含量均比加酶量为0.5％的要高。在先加碱性蛋白酶后加米曲霉种曲时，碱性蛋白酶加酶量为0.8％时，它的水解度要比加酶量为0.5％的要低，但是可溶性蛋白含量比加酶量为0.5％的要高，这可能是因为，碱性蛋白酶将大分子量的蛋白质水解成小分子的肽，导致米曲霉种曲产生的蛋白酶没有了作用位点，在反应时反应体系pH变化不大，添加的NaOH量少，水解度低。由表中的·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力可知，用米曲霉种曲+碱性蛋白酶水解，碱性蛋白酶的加酶量为0.8％时，抗氧化活性最高，能分别达到41.26％和50.23％。

实施例7

碱性蛋白酶和米曲霉种曲协同水解产物的氨基酸分析

根据表2中的六种样品中蛋白质的含量(将称量的实际重量乘以样品粗蛋白含量即为蛋白质的含量)，精确称量样品(样品重量不能低于0.050g)。将称量好的样品加入到20mL的安瓿管中，再在每个安瓿管中加入6.67M HCl9mL，使用氮吹仪氮吹5min，将安瓿管中的空气排尽，再使用酒精喷灯封口。将封口的安瓿管放在110℃的烘箱中进行酸水解，酸水解24h。酸水解完成后，将安瓿管中的水解液转移到烧杯中，先加入适量6MNaOH将水解液pH调至2.2(精密试纸(0.5-5.0)出现黄色带绿圈即可)。将调好pH的水解液过滤，然后定容至100mL，使用0.067MpH为2.2的柠檬酸钠缓冲溶液定容。所有的上机样品都使用0.22μm的针头过滤器过滤至样品瓶中，然后上机分析。

以玉米蛋白粉、去淀粉后玉米蛋白粉为原料进行水解，碱性蛋白酶和米曲霉种曲不同加酶顺序和不同加酶量协同水解玉米大豆蛋白复配物获得蛋白水解产物的氨基酸结果如表2所示。从表2可以看出，玉米蛋白粉经过去淀粉预处理后，各种氨基酸含量和总氨基酸含量均有不同程度的提高，说明去淀粉预处理可以有效提高玉米蛋白粉中的各种氨基酸成分。半胱氨酸有治疗脂肪肝和解毒的效果，还可以治疗皮肤的损伤等效果，根据表2发现，先用碱性蛋白酶水解后后再用米曲霉种曲水解得到的水解产物，发现其中半胱氨酸的含量为0，而先用米曲霉种曲水解后用碱性蛋白酶水解的水解产物，均含有半胱氨酸，在小分子肽中保留了半胱氨酸的生物学功能。缬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸等都有促酒精代谢和保肝护肝的作用，对比玉米蛋白粉和其不同策略的水解产物，本发明抗氧化活性肽的制备方法可以有效的提高缬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸等的含量，或保留这四种氨基酸在水解产物中的占比，使玉米蛋白粉中具有生物活性功能区完美释放出来。综合来看，本发明抗氧化活性肽的制备方法可以有效改良玉米蛋白粉的功能活性，不产生副产物，且保留了玉米蛋白粉的生物学功能。

表2不同样品的氨基酸组分表

注：米为米曲霉种曲(10％)

实施例8

碱性蛋白酶和米曲霉种曲协同水解产物的分子量分布

碱性蛋白酶水解产物、米曲霉种曲水解产物、碱性蛋白酶和米曲霉种曲不同加酶顺序和不同加酶量协同水解玉米大豆蛋白复配物获得蛋白水解产物的分子量分布图如图13所示，其中，13-a.为碱性蛋白酶水解玉米大豆复配物水解产物中肽的分子量分布洗脱图谱；13-b.为米曲霉种曲水解玉米大豆复配物水解产物中肽的分子量分布洗脱图谱；13-c.为碱性蛋白酶(0.5％)和米曲霉种曲(10％)顺次水解玉米大豆复配物水解产物中肽的分子量分布洗脱图谱；13-d.为碱性蛋白酶(0.8％)和米曲霉种曲(10％)顺次水解玉米大豆复配物水解产物中肽的分子量分布洗脱图谱；13-e.为米曲霉种曲(10％)和碱性蛋白酶(0.5％)顺次水解玉米大豆复配物水解产物中肽的分子量分布洗脱图谱；13-f.为米曲霉种曲(10％)和碱性蛋白酶(0.8％)顺次水解玉米大豆复配物水解产物中肽的分子量分布洗脱图谱。

由图13可知米曲霉种曲单独水解玉米大豆蛋白复配物时，只能将大分子量的蛋白质作简单切割，水解产物的分子量依然很大，而碱性蛋白酶单独水解玉米大豆蛋白复配物时，可以将蛋白质水解成小分子肽，其中分子量小于1500Da的约占70％左右。碱性蛋白酶和米曲霉种曲与米曲霉种曲和碱性蛋白酶顺次水解玉米大豆蛋白复配物时，水解效果相近，分子量小于1500Da的都在75％左右。结合前面实施例对水解产物活性的研究和本实施例关于分子量的结果进行分析，综合考虑水解度、可溶性蛋白含量、·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力，先使用米曲霉种曲再添加碱性蛋白酶(加酶量为0.8％)的效果最好，此时的水解度、可溶性蛋白含量分别为46.10％和(73.04±1.68)mg/mL，·DPPH清除率和亚铁离子螯合能力分别为(41.26±0.69)％和(50.23±3.15)％，分子量小于1500Da的约占78％左右。

实施例9

抗氧化活性肽对Caco-2细胞存活率的影响

将对数期Caco-2细胞以密度为1×10⁵cells/mL接种至96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，细胞培养48h后，吸弃孔内液体，每孔加入100μL终浓度为：0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5mg/mL的实施例1制备得到的抗氧化活性肽(DMEM配制)的培养液，继续培养细胞24h，每孔加入终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，4h后吸弃孔内液体，每孔加入150μLDMSO，在37℃500rpm微孔板振荡仪振荡10min，使蓝紫色甲臜晶体充分溶解，在570nm波长下用酶标仪进行检测。试验结果如图14所示。

由图14可知，不同浓度的抗氧化活性肽对细胞存活率存在显著性差异，与对照组相比，抗氧化活性肽在0.005～2.5mg/mL浓度范围内，细胞存活率均大于90％，即玉米大豆蛋白复配物对Caco-2细胞无生殖毒性。

实施例10

氧化应激条件下抗氧化活性肽对细胞存活率的影响

将Caco-2细胞以1×10⁵cells/mL接至96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，细胞培养24h后。将实验细胞分为组：对照Ⅰ(0mmol/LH₂O₂)；对照Ⅱ(1mmol/LH₂O₂)；实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ(0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5mg/mL+1mmol/LH₂O₂)，根据MTT法测定细胞存活率。试验结果如图15所示。

不同浓度的抗氧化活性肽对氧化损伤的Caco-2细胞保护效果如图15所示，细胞经1mmol/LH₂O₂作用6h后成功构建氧化损伤模型。当抗氧化活性肽浓度在0.005～5mg/mL范围内，预培养细胞2h后再经1mmol/LH₂O₂处理细胞6h，细胞存活率均有所增加。其中0.005mg/mL的抗氧化活性肽保护细胞效果最好，此时细胞存活率可达到(95.13±7.90)％，与H₂O₂氧化损伤组相比细胞存活率提高了30％左右。

实施例11

抗氧化活性肽对Caco-2细胞内抗氧化活性影响

将Caco-2细胞以1×10⁵cells/mL接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，细胞培养24h去除培养液，PBS清洗细胞一次，实验组每孔加入不同浓度抗氧化活性肽的DMEM培养液，其中含25μM的DCFH-DA的DMEM，作用Caco-2细胞2h后，用100μLPBS清洗细胞一遍，每孔加入100μL600μM的AAPH溶液，将96孔板放入酶标仪中，在发射波长530nm，激发波长485nm条件下，每5min检测一次,连续测定1h。设定空白组和对照组，空白组仅采用DCFH-DA处理，但不加入AAPH；对照组采用DCFH-DA和AAPH自由基处理，但不加入样品。阳性对照为Trolox，试验结果如图16和图17所示。

CAA是采用荧光探针(DCFH-DA)进行检测，DCFH-DA可被细胞膜上的酯酶脱乙酰基水解成DCFH。在AAPH自由基经激发后形成的过氧自由基可使DCFH氧化成具有绿色荧光的DCF，并且荧光强度与受氧化的程度成正比。若有抗氧化物质存在，其可通过减少过氧自由基的产生从而降低荧光强度。

从图16中可以看出，无论是Trolox还是抗氧化活性肽都可以抑制DCF荧光的增加，且呈现剂量依赖关系。根据公式算出CAA活性值，以浓度为横坐标，CAA活性值为纵坐标，绘制剂量效应曲线如图17所示。根据图17计算出Trolox和抗氧化活性肽的EC₅₀值分别为0.733mg/mL和8.968mg/mL，此时，抗氧化活性肽的CAA值为(48.08±2.05)μmolTE/100g。在CAA实验中，Caco-2可以吸收抗氧化活性肽来清除有AAPH产生的过氧自由基，减少DCF的形成，降低细胞内荧光产生。本发明抗氧化活性肽的CAA活性值与已报道的玉米蛋白组分在HepG2中CAA值低，Trolox的EC50值接近。相反的，要比蓝莓、蔓越莓、苹果和红葡萄等在HepG2细胞中CAA活性值高，但略低于绿葡萄CAA活性值，结果表明，本发明抗氧化活性肽对人体细胞没有毒性，借助人结肠癌Caco-2细胞模型，证明了抗氧化活性肽在细胞内具有抗氧化活性，可以用作功能食品的生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗氧化活性肽，其特征在于，所述抗氧化活性肽的制备方法包括以下步骤：

1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；

2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5；

3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6；

4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。

2.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤1)所述去淀粉处理后，还包括高温蒸煮的过程。

3.根据权利要求2所述的抗氧化活性肽，其特征在于，所述高温蒸煮的条件包括：蒸煮压力为0.1MPa，温度为121℃，时间为25～35min。

4.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤1)所述大豆蛋白粉和去淀粉处理的玉米蛋白粉的总质量浓度为8～12％。

5.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤1)所述大豆蛋白粉和去淀粉处理的玉米蛋白粉的混合质量比为(2.5～3.5):(6.5～8)。

6.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤2)所述米曲霉种曲的接种量为玉米大豆蛋白复配物质量的8～12％。

7.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤3)所述碱性蛋白酶的添加量为所述玉米大豆蛋白第一阶段水解物质量的0.6～2.0％。

8.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤4)所述灭酶处理的条件包括：100℃加热10～20min。

9.根据权利要求1所述的抗氧化活性肽，其特征在于，步骤4)所述离心的条件包括：3500～4500r/min离心15～20min。

10.权利要求1～9任一项所述抗氧化活性肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将大豆蛋白粉、去淀粉处理的玉米蛋白粉与水混合，得到玉米大豆蛋白复配物；

2)将米曲霉种曲接种于步骤1)得到的玉米大豆蛋白复配物中，进行第一水解反应，得到玉米大豆蛋白第一阶段水解物；所述第一水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间22～24h，pH值7～9.5；

3)将碱性蛋白酶与步骤2)得到的玉米大豆蛋白第一阶段水解物混合，进行第二水解反应，得到玉米大豆蛋白第二阶段水解物；所述第二水解反应的条件包括：反应温度55～60℃，反应时间2～3h，pH值8.4～8.6；

4)将步骤3)得到的玉米大豆蛋白第二阶段水解物进行灭酶处理，离心得到上清液，将上清液进行干燥，得到抗氧化活性肽。