CN109793729A

CN109793729A - 硝呋齐特或其盐在治疗骨肉瘤中的用途

Info

Publication number: CN109793729A
Application number: CN201910148372.1A
Authority: CN
Inventors: 罗翼; 巫丽娟; 谢永美; 屠重棋
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2019-05-24

Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤药物，它是以硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。本发明还提供了硝呋齐特在制备抗肿瘤药物中的用途。优选的，前述肿瘤为骨肉瘤。硝呋齐特及其盐能有效诱导骨肉瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，在体内也具有显著的抗肿瘤效果。将硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐用于骨肉瘤的药物制备中，具有良好的产业前景。

Description

硝呋齐特或其盐在治疗骨肉瘤中的用途

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物领域，尤其涉及硝呋齐特或其盐在治疗骨肉瘤中的用途。

背景技术

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一种起源于骨间叶细胞的原发恶性骨肿瘤，其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟的骨或骨样组织，易发生于儿童和青少年时期，是儿童中发病率第八的癌症，同时占所有原发骨恶性肿瘤的20％。骨肉瘤侵袭性强，易发生肺转移，其存活率在小儿癌症中较低。

骨肉瘤的治疗手段主要包括手术切除和化疗。单纯手术切除而无术前术后化疗患者5年生存率约为15-20％。上世纪70年代以来，化疗的应用大大提升了骨肉瘤的治疗效果，其结合手术治疗，可使80-85％的骨肉瘤患者得以保留肢体，患者总体生存率约为60％。

化疗一线用药包括顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤和异环磷酰胺等，这类药物在骨肉瘤中通常是大剂量、多药联合使用，尽管一线化疗药物的应用取得了一定的临床疗效，但其并发症相对较多。总的来说，阿霉素属于蒽环类(Anthracycline)抗肿瘤药，作用广谱，临床上用于白血病、淋巴瘤、骨肉瘤的治疗，临床应用过程中可产生严重的心肌毒性从而导致治疗失败，心肌毒性已经成为阻碍阿霉素临床应用的最主要毒副作用，并被认为比骨髓抑制作用、消化道、肾脏毒性等抗肿瘤药物常见毒副作用更为危险；顺铂是目前临床上较为有效的抗肿瘤药物，广泛用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、骨肉瘤等多种实体瘤化疗，均显示一定的疗效，其疗效与用药剂量成正比，但其剂量的增加却受肾毒性的限制，尽管采取水合疗法等防护措施，临床肾毒性发生率仍高达1/3左右。同样，甲氨蝶呤也常导致骨髓抑制等不良反应，而异环磷酰胺也常导致消化系统不良反应、神经毒性等。这些临床常规一线用药除了并发症多影响治疗效果以外，还有一个阻碍骨肉瘤治疗疗效提升的重要因素，那便是多药耐药，从而导致难以控制的复发和转移。目前对于复发和肺转移患者，5年生存率甚至可低于20％。因此，寻找新的高效低毒、具有抑制骨肉瘤转移作用的化疗药物及新疗法迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种抗肿瘤药物，它是以硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。

进一步地，所述肿瘤为骨肉瘤。

进一步地，所述药物的最小制剂单位中，含有199.5～399.0mg的硝呋齐特。

如前述的药物，所述药物是口服制剂或注射制剂。

本发明还提供了一种抗肿瘤联合用药物，它含有含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐、以及其它任何具有抗肿瘤活性的药物。

如前述的联合用药物，所述肿瘤为骨肉瘤。

如前述的联合用药物，所述联合用药物是口服制剂或注射制剂。

本发明还提供了硝呋齐特在制备抗肿瘤药物中的用途。

如前述的用途，所述肿瘤是骨肉瘤。

如前述的用途，所述药物是口服制剂或注射制剂。

硝呋齐特(别名硝呋酚酰肼，英文名Nifuroxazide，Nif)是一种抗菌药，CAS号为965-52-6，结构如图1所示。硝呋齐特目前主要用于防治大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌(包括里氏杆菌)、产气杆菌、变形杆菌、坏死杆菌及葡萄球菌等引起的肠道或泌尿系统疾病。能有效预防下痢，抗菌谱广，抗菌活性高，抑菌浓度低。与磺胺类药、喹诺酮类药及其它抗生素无交叉耐药性。但目前未见其运用于骨肉瘤的治疗。

本发明的发明人偶然地发现，硝呋齐特具有抗肿瘤活性，尤其是抗骨肉瘤的活性。具体体现在：硝呋齐特能有效诱导骨肉瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，在体内也具有显著的抗肿瘤效果。硝呋齐特的盐具有硝呋齐特的活性结构，也具有硝呋齐特的前述效果。

本发明将硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐用于骨肉瘤的药物制备中，具有良好的产业前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：硝呋齐特化学结构式。

图2：硝呋齐特对骨肉瘤细胞增殖抑制活性的影响。

图3：硝呋齐特诱导骨肉瘤细胞凋亡及对凋亡相关蛋白的影响。

图4：硝呋齐特抑制UMR106细胞迁移和侵袭。

图5：硝呋齐特的体内抗癌作用。

具体实施方式

实验例1硝呋齐特体外抑制细胞增殖实验

1.方法

(1)通过MTT实验检测的骨肉瘤细胞的增殖活性。

首先，将处于对数期生长的UMR106、MG63和HEK 293T细胞(3-5×10³/孔)以100μl/孔铺在96孔板中。24小时孵育后，加入不同浓度的硝呋齐特，对照组为含有0.1％DMSO的培养基，分别在加药24小时，48小时，72小时后，每孔加入20μl的5mg/ml的MTT(避光操作)。37℃孵育2-4小时，然后将培养基全部吸走，加入150μl的DMSO，放在摇床上10min直到甲瓒全部溶解，然后使用光谱MAX M5微孔板分光光度计来测570nm处的吸光度值。所有的结果都重复了三次。

(2)骨肉瘤细胞克隆形成实验。

首先将UMR106和MG63细胞以400-600个细胞/孔的浓度种植在六孔板中。在孵箱孵育24小时后，每孔加入不同浓度的硝呋齐特，每隔两天换药一次，共孵育12天。然后吸走上清液，PBS洗2遍，用甲醇固定细胞，然后用0.5％的结晶紫染色15-30分钟，PBS洗3遍，然后放在通风处理晾干。晾干后在显微镜下计数。数据是三次独立实验的平均值。

2.结果

图2a和2b结果表明，硝呋齐特可抑制骨肉瘤UMR106和MG63细胞活性且具有浓度和时间依赖性。如图2c所示，硝呋齐特对骨肉瘤具有强烈的生长抑制性和细胞毒性。图2d结果表明，硝呋齐特对肺肿瘤细胞HEK 293T具有较弱的生长抑制活性。

以上结果表明，硝呋齐特能选择性地杀死骨肉瘤细胞。

实验例2硝呋齐特诱导骨肉瘤细胞凋亡及对凋亡相关蛋白的影响

1.方法

(1)Hoechst33258染色。

首先将UMR106细胞(1～2×10⁵个/孔)铺到放有18mm的盖玻片的6孔板中。孵育24小时后，加入药物再次孵育24h，然后用冷的PBS洗2遍，然后用甲醇固定15-30分钟，PBS洗2遍。根据试剂盒说明书用Hoechst33258染色，然后将盖玻片取出，有细胞的一面朝下放在滴有50％甘油的载玻片上，用荧光显微镜(Leica，DM4000B)观察细胞凋亡形态。

(2)流式检测凋亡实验。

首先将UMR106细胞(1～2×10⁵个/孔)种植在6孔板中。孵育24小时后，加入药物再次孵育24h，收集上清液，然后用胰酶将细胞消化下来，将上清液和细胞一起离心，用PBS洗两遍。然后按照Annexin V/PI双染试剂盒的说明书染色，之后上机检测，用FlowJo软件分析数据。

(3)凋亡相关蛋白的检测。

首先，用配好的硝呋齐特的浓度来处理UMR106细胞24小时。然后用冷的PBS洗两遍，然后用RIPA裂解液裂解细胞，用Bradford法或CBA法测蛋白浓度，在上样前定量。每孔上相同量的蛋白样，80V电压下在压缩胶进行压缩，之后120V电压下在分离胶内分离。之后利用湿转法转膜(PVDF膜)，100V电压下，转膜30-60分钟。最后将膜取出放在5％脱脂牛奶里，室温下封闭2小时。孵特定抗体，抗体浓度根据说明书决定，4℃过夜。PBST洗膜三遍，每次10分钟。然后孵二抗，37℃一小时，PBST洗膜六遍，每次10分钟。然后利用增强化学发光法显色。

2.结果

实验结果见图3。

Hoechst 33258染色实验结果(图3a)表明硝呋齐特诱导了UMR106的凋亡，具有剂量依赖性。流式细胞术检测细胞凋亡如图3b所示，UMR106细胞经过硝呋齐特处理24h后，细胞出现凋亡且具有浓度依赖性。蛋白检测结果如图3c所示，经硝呋齐特处理后，Bcl-2明显下降，而Bax，cleaved caspase-3的表达量上升且具有浓度依耐性，表明硝呋齐特诱导骨肉瘤细胞凋亡的通路可能是线粒体调节的凋亡途径。

本实验例结果表明，硝呋齐特诱能导骨肉瘤细胞凋亡。

实验例3硝呋齐特诱导骨肉瘤细胞迁移与侵袭实验

1.方法

(1)划痕实验。

将对数生长期的UMR106细胞接种在6孔板里，当细胞生长至覆盖培养皿80％的面积时，用10μl的枪尖在细胞层表面轻轻划一下，然后用PBS洗一遍，之后加入含不同浓度药物的新鲜培养基(含2％的血清)。孵育24h后，利用显微镜(Zeiss，Germany)统计划痕区的细胞迁移数

(2)小室迁移实验。

每个小室的上室加入100μl含1×10⁵的UMR106细胞的无血清培养基，下室加入600μl的含10％胎牛血清的培养基。上下室均加入不同浓度的药物。24小时后，利用棉签将上室没有迁移的细胞轻轻擦去。已经迁移的细胞用甲醇固定，然后用0.5％的结晶紫染色30分钟。在白光显微镜下随机选择6个视野对迁移的细胞进行统计。

(3)人工基底膜侵袭实验。

步骤类似于迁移实验，唯一的不同就是侵袭实验需要在小室内铺基质胶，小室上表面用60μl基质胶包被(无血清培养基∶基质胶＝3∶1)，其余步骤与迁移实验相同。

2.结果

划痕实验(图4a)和小室迁移实验(图4b)结果显示，硝呋齐特抑制了UMR106细胞的迁移并且具有浓度依耐性。人工基底膜侵袭分析(图4c)结果表明，硝呋齐特对骨肉瘤细胞的侵袭具有强烈的抑制能力。

本实验例结果表明，硝呋齐特能有效抑制骨肉瘤细胞的迁移与侵袭。

实验例4硝呋齐特体内抗肿瘤研究

1.动物模型

雄性C57小鼠(6-8周)购买于中国北京华阜康生物科技股份有限公司。

2.方法

将UMR106细胞(1.0×10⁶/100μl/只)皮下接种小鼠。当肿瘤长至约100mm³时，荷瘤鼠被随机分为3组，每组8只。分别腹腔注射50mg/kg、10mg/kg的硝呋齐特(2个实验组)或等体积溶剂(1个对照组)，每天给药一次，连续24天。每三天测一下肿瘤体积和体重。肿瘤体积根据公式：肿瘤体积(mm³)＝0.52×长度×宽度的平方。给药结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取出肿瘤，称重。

3.结果

实验结果见图5。对UMR106荷瘤小鼠进行的体内抗癌活性实验结果表明实验组的荷瘤小鼠的体重相比对照组没有明显增加(图5C)，但肿瘤体积(图5A)和肿瘤重量(图5B)显著减少。

本实验例的结果表明，50mg/kg给药剂量的硝呋齐特在小鼠体内抗癌效果明显。

将其换算成人的给药剂量为：4.99mg/kg。换算过程如下：

人用剂量：50mg/kg(小鼠剂量)×0.018kg(小鼠体重)×387.9(70kg成人对应体表面积系数)/70kg(70kg成人体重)＝4.99mg/kg。

如果将硝呋齐特用于抗肿瘤药物的制备，该药物的每单位制剂中硝呋齐特的含量为199.5～399.0mg。换算过程如下：

每单位制剂中硝呋齐特的含量：4.99mg/kg(人用剂量)×(40～80)kg(人体重)＝199.5～399.0mg。

综上，硝呋齐特能有效诱导骨肉瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，在体内也具有显著的抗肿瘤效果。硝呋齐特的盐具有硝呋齐特的活性结构，也具有硝呋齐特的前述效果。

Claims

1.一种抗肿瘤药物，其特征在于：它是以硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。

2.如权利要求1所述的药物，其特征在于：所述肿瘤为骨肉瘤。

3.如权利要求2所述的药物，其特征在于：所述药物的每单位制剂中，含有199.5～399.0mg的硝呋齐特。

4.如权利要求1所述的药物，其特征在于：所述药物是口服制剂或注射制剂。

5.一种抗肿瘤联合用药物，其特征在于：它含有含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的硝呋齐特和/或硝呋齐特的盐、以及其它任何具有抗肿瘤活性的药物。

6.如权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述肿瘤为骨肉瘤。

7.如权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物是口服制剂或注射制剂。

8.硝呋齐特在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于：所述肿瘤是骨肉瘤。

10.如权利要求7所述的用途，其特征在于：所述药物是口服制剂或注射制剂。