CN109793216A - 一种红曲沙棘籽仁粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红曲沙棘籽仁粉的制备方法。该方法依次包括如下步骤：(1)向无菌原料中接种红曲霉和/或紫色红曲，发酵，得到发酵产物；原料由沙棘籽仁、稻米和水组成；(2)将发酵产物高温灭菌，然后35℃‑45℃烘干24h‑48h；(3)粉碎，得到红曲沙棘籽仁粉。实验证明，采用上述方法制备的红曲沙棘籽仁粉富含Monacolin K。本发明在开发预防和/或治疗动脉粥样硬化和/或降低胆固醇和/或高血压和/或抗氧化的产品中具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于食品领域，具体涉及一种红曲沙棘籽仁粉的制备方法，尤其涉及一种以沙棘籽仁粉和稻米为原料、以红曲霉和/或紫色红曲为发酵菌种制备红曲沙棘籽仁粉的方法。
背景技术
红曲霉是一种重要的药食两用微生物资源，在我国应用红曲霉发酵生产的红曲米，已经有了上千年的历史，近现代发展也产生其它多种食品，如红曲黄酒、腐乳、酱菜、果酒等。此外，红曲霉还用于保健和医药领域，红曲霉具有多种有益成分，如ACE抑制肽、γ-氨基丁酸、支链氨基酸、红曲红色素、红曲黄色素、Monacolin K等，其中以Monacolin K最为重要。早在上世纪80年代，日本学者从红色红曲霉中分离出了一系列Monacolin活性成分，被统称为他汀同系物(Monacolins)。这些他汀类物质具有显著的降血脂功效，能够显著降低人体内源性胆固醇的合成，抑制细胞内胆固醇的固醇(Low density lipoproteincholesterin，LDL-C)的含量，有效预防动脉粥样硬化，具有高效、低度和安全的特点。目前，Monacolin K已成为公认的降低胆固醇的理想药剂。但是微生物产Monacolin K的产率很低，需用稻米为发酵基质，生产成本较高，限制了它的广泛应用。
沙棘籽含有丰富的原花青素、多酚等，具有显著的抗氧化功效。沙棘籽仁为沙棘籽脱壳之后的产物，通常作为动物饲料的原料，其含有丰富的蛋白质、碳水化合物。沙棘籽仁粉由沙棘籽仁粉碎后获得。
发明内容
本发明的目的是提供富含Monacolin K的产品。在本发明中，提供的富含Monacolin K的产品具体可为红曲沙棘籽仁粉。
本发明首先保护一种红曲沙棘籽仁粉的制备方法，可包括步骤a1)：向无菌原料中接种红曲霉和/或紫色红曲，发酵，得到发酵产物；所述原料包括沙棘籽仁粉。
所述沙棘籽仁粉是由沙棘籽仁粉碎后获得的，沙棘籽仁为沙棘籽脱壳之后的产物。
所述原料还可包括稻米。
所述原料中，沙棘籽仁粉和稻米的质量比可为1:(0.5-5)(如1:(0.5-3)、1:(3-5)、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5)。
所述原料还可包括水。水在所述原料中的含量可为40-80％(如40-60％、60-80％、40％、50％、55％、58％、60％、67％、70％、71％或80％)。
所述原料具体可由沙棘籽仁粉、稻米和水组成。
所述原料中，沙棘籽仁粉、稻米和水的质量比可为1:(0.5-5)：(2-30)(如1:(0.5-5)：(2-5)、1:(0.5-5)：(5-10)、1:(0.5-1)：(10-30)、1:(0.5-1)：(2-5)、1:(0.5-1)：(5-10)、1:(0.5-1)：(10-30)、1:(1-4)：(2-5)、1:(1-4)：(5-10)、1:(1-4)：(10-30)、1:(4-5)：(2-5)、1:(4-5)：(5-10)或1:(4-5)：(10-30)。
所述原料中，沙棘籽仁粉、稻米和水的质量比具体可为1:1:2.4。
所述原料中，沙棘籽仁粉、稻米和水的质量比具体可为1:4:10。
所述原料中，沙棘籽仁粉、稻米和水的质量比具体可为1:1:5。
上述任一所述的方法中，所述接种的接种量可为1.0×103-4.0×106个/100g无菌原料(如1.0×103-2.0×103个/100g无菌原料、2.0×103-4.0×104个/100g无菌原料、4.0×104-4.0×105个/100g无菌原料、4.0×105-4.0×106个/100g无菌原料、1.0×103个/100g无菌原料、2.0×103个/100g无菌原料、4.0×106个/100g无菌原料、4.0×105个/100g无菌原料或4.0×106个/100g无菌原料)。
上述任一所述的方法中，所述发酵的体系的pH值可为5.0-12.0(如5.0-7.0、7.0-12.0、5.0、7.0或12.0)。
上述任一所述的方法中，制备所述无菌原料的步骤为：将沙棘籽仁粉、燕麦米和水混合，调节pH值为5.0-12.0(如5.0-7.0、7.0-12.0、5.0、7.0或12.0)，然后高温灭菌。
上述任一所述红曲霉具体可为红曲霉(Monascus purpureus)CGMCC No.12502。
上述任一所述红曲霉具体可为北纳生物编号为BNCC212464的红曲霉菌属菌种(Monascus sp.)。
上述任一所述紫色红曲具体可为北纳生物编号为BNCC187825的紫色红曲。
上述任一所述的方法中，所述发酵参数为20℃-35℃(如20℃-28℃、28℃-35℃、20℃、28℃或35℃)培养15-20d(如15-17d、17-20d、15d、16d、17d、18d、19d或20d)。
上述任一所述的方法还可包括步骤a2)和a3)：
a2)取步骤a1)得到发酵产物，高温灭菌，然后35℃-45℃(如35℃-40℃、40℃-45℃、35℃、40℃或45℃)烘干24h-48h(如24h-36h、36h-48h、24h、36h或48h)或真空冷冻干燥；
a3)完成步骤a2)后，粉碎，得到红曲沙棘籽仁粉。
所述步骤a2)中，真空冷冻干燥的参数可为：0.025mbar－0.1mbar(如0.025mbar－0.05mbar、0.05mbar－0.1mbar、0.025mbar、0.05mbar或0.1mbar)条件下，4℃－20℃(如4℃－10℃、10℃－20℃、4℃、10℃或20℃)干燥2h－6h(如2h－4h、4h－6h、2h、4h或6h)。
所述稻米可为粳米、糯米、薏仁米、燕麦米和籼米中的至少一种。
采用上述任一所述方法制备的红曲沙棘籽仁粉富含Monacolin K。此外，还富含总酚、原花青素、多肽和总糖。在本发明的一个实施例中，制备的红曲沙棘籽仁粉甲中，Monacolin K含量为1.52mg/g，总酚的含量为1.90mg/g，原花青素的含量为1.20mg/g，多肽的含量为2.00mg/g，总糖的含量为23.11mg/g。在本发明的一个实施例中，制备的红曲沙棘籽仁粉乙中，Monacolin K含量为4.01mg/g，总酚的含量为4.09mg/g，原花青素的含量为0.29mg/g，多肽的含量为4.40mg/g，总糖的含量为33.50mg/g。在本发明的一个实施例中，制备的红曲沙棘籽仁粉丙中，Monacolin K含量为1.90mg/g，总酚的含量为2.50mg/g，原花青素的含量为0.90mg/g，多肽的含量为1.85mg/g，总糖的含量为25.11mg/g。
本发明还保护采用上述任一所述方法制备的红曲沙棘籽仁粉的应用，可为A1)-A10)中的至少一种：A1)生产Monacolin K；A2)预防和/或治疗动脉粥样硬化；A3)降低胆固醇；A4)预防和/或治疗高血压；A5)提高羟自由基清除率；A6)清除羟自由基；A7)提高DPPH自由基清除率；A8)清除DPPH自由基；A9)抗氧化；A10)提高抗氧化活性。
本发明还保护沙棘籽仁粉或沙棘籽仁的应用，可为B1)-B21)中的至少一种：B1)制备红曲沙棘籽仁粉；B2)制备用于生产Monacolin K的产品；B3)制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的产品；B4)制备用于降低胆固醇的产品；B5)制备用于预防和/或治疗高血压的产品；B6)制备用于提高羟自由基清除率的产品；B7)制备用于清除羟自由基的产品；B8)制备用于提高DPPH自由基清除率的产品；B9)制备用于清除DPPH自由基的产品；B10)制备具有抗氧化活性的产品；B11)制备具有抗氧化活性的产品；B12)生产Monacolin K；B13)预防和/或治疗动脉粥样硬化；B14)降低胆固醇；B15)预防和/或治疗高血压；B16)提高羟自由基清除率；B17)清除羟自由基；B18)提高DPPH自由基清除率；B19)清除DPPH自由基；B20)抗氧化；B21)抗氧化。
上述应用中，所述产品可为采用上述任一所述方法制备的红曲沙棘籽仁粉。
本发明的发明人以红曲霉和/或紫色红曲为发酵菌种，以沙棘籽仁粉和稻米(如粳米、糯米、薏仁米、燕麦米或籼米)为原料生产富含Monacolin K的红曲沙棘籽仁粉。采用本发明提供的方法生产的红曲沙棘籽仁粉，在开发预防和/或治疗动脉粥样硬化和/或降低胆固醇和/或高血压和/或抗氧化的产品中具有重大的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的沙棘籽仁粉由沙棘籽仁粉碎后获得，沙棘籽仁为沙棘籽脱壳之后的产物。具体的，沙棘籽仁粉为青海康普生物股份有限公司的产品。粳米和糯米均为五常市彩桥米业有限公司的产品。燕麦米和薏仁米均为十月稻田公司的产品。
红曲霉(Monascus purpureus)已于2016年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12502。在下文中，该红曲霉简称为红曲霉。
下述实施例中的紫色红曲为北纳生物(网址为：www.bnbio.com)的产品，编号为BNCC187825。
下述实施例中，检测红曲沙棘籽仁粉中Monacolin K的含量的方法如下：
(1)将Monacolin K标准品(Sigma公司的产品)用无水甲醇溶解，得到浓度分别为5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL的Monacolin K溶液；采用高效液相色谱测定各个浓度的Monacolin K溶液的峰面积，然后以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
(2)将1.00g红曲沙棘籽仁粉置于15mL 75％(v/v)甲醇水溶液中，先超声20min(超声频率为20kHz)，然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤，收集滤液。采用高效液相色谱测定滤液的峰面积，然后根据步骤(1)的标准曲线，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉中的MonacolinK的含量(检测结果均以mg/g DW表示)；
高效液相色谱条件均如下：色谱柱C18(5μm，150mm×4.6mm)；流动相由3体积份甲醇和1体积份0.1％(v/v)磷酸水溶液组成；柱温30℃；流速1mL/min；进样量10μL。
下述实施例中，检测红曲沙棘籽仁粉中总糖含量和黄酮含量的方法参考如下文献：王倩，张佳婵，王昌涛等.碳氮比对真菌发酵桑枝-燕麦麸皮的活性成分和抗氧化能力的影响[J].食品工业科技，2018.检测红曲沙棘籽仁粉中多肽含量的方法参考如下文献：高英，俞玉忠.福林酚法测定脑蛋白水解物溶液中的多肽含量[J].海峡药学，2004，16(6):57-58.检测红曲沙棘籽仁粉中原花青素含量的方法参考如下文献：张佳婵，王昌涛，孙宝国，曲悠歌.沙棘籽仁原花青素制备、体外抗氧化及细胞活力评价[J].食品工业科技，2016，37(23):103-108.检测红曲沙棘籽仁粉中多酚含量的方法参考如下文献：范艳丽，韩丽娜，孟雪梅等.枸杞叶黄酮提取物的组成及初步结构表征[J].食品工业科技，2017(14)：46-50.上述检测结果均以mg/g DW表示。检测羟自由基清除率的方法参考如下文献：张佳婵，谢娅霏，虞旦，蒋晓燕，王昌涛，孙宝国.玫瑰花及花渣中黄酮类物质的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2014,(22):226-230。检测DPPH自由基清除率的方法参考如下文献：孙芸,谷文英.硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量[J].食品与发酵工业.2003，29(9):43-46。
下述实施例中，实验数据利用SPSS 19.0数据处理软件进行统计学处理，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，所得结果以表示。
下述实施例中的营养液为含0.3％(m/v)磷酸二氢钾和0.15％(m/v)硫酸镁的水溶液。
葡萄糖马铃薯琼脂培养基：将46g马铃薯葡萄糖琼脂干粉(青岛科技工业园海博生物技术有限公司的产品)溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。
葡萄糖马铃薯液体培养基：将26g马铃薯葡萄糖水干粉(青岛科技工业园海博生物技术有限公司的产品)溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。
实施例1、红曲霉菌液和紫色红曲菌液的制备
1、红曲霉菌液的制备
(1)将红曲霉接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d(目的为活化)。
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、200rpm培养7d，得到红曲霉菌液。
2、紫色红曲菌液的制备
(1)将紫色红曲接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d(目的为活化)。
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、200rpm培养7d，得到紫色红曲菌液。
实施例2、红曲沙棘籽仁粉甲的制备及其抗氧化活性的检测
一、红曲沙棘籽仁粉甲的制备
1、取沙棘籽仁粉和粳米混合均匀，得到混合物。混合物中，沙棘籽仁粉和粳米的质量比为1:1。
(2)完成步骤(1)后，取100g混合物，加入120mL蒸馏水，搅拌均匀，此时pH值约为5.0；然后121℃高温灭菌30min，得到培养基质。
3、完成步骤2后，向100g培养基质中接种红曲霉菌液(接种量为10×104个)，充分混匀后，在温度为28℃、湿度为60％的条件下培养20d。
4、取完成步骤3的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到红曲沙棘籽仁粉甲。
5、检测红曲沙棘籽仁粉甲中Monacolin K的含量。
6、取1.00g红曲沙棘籽仁粉甲，加入7mL 80％(v/v)乙醇水溶液(药液比为1g:7mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。
7、完成步骤6后，检测醇提液中的原花青素含量和总酚含量，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉甲中的原花青素含量和总酚含量。
8、取1.00g红曲沙棘籽仁粉甲，加入7mL蒸馏水(药液比为1g:7mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。
9、完成步骤8后，检测水提液中的总糖含量和多肽含量，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉甲中的总糖含量和多肽含量。
结果表明，红曲沙棘籽仁粉甲中，Monacolin K含量为1.52mg/g，总酚的含量为1.90mg/g，原花青素的含量为1.20mg/g，多肽的含量为2.00mg/g，总糖的含量为23.11mg/g。
二、抗氧化活性的检测
1、检测羟自由基清除率
(1)取醇提液或水提液，用水稀释，得到浓度为0.015625μg/mL的溶液1、浓度为0.03125μg/mL的溶液2、浓度为0.0625μg/mL的溶液3、浓度为0.125μg/mL的溶液4、浓度为0.25μg/mL的溶液5或浓度为0.50μg/mL的溶液6。
(2)完成步骤(1)后，检测各个溶液的羟自由基清除率。
实验结果见表1。结果表明，溶液的浓度越高，羟自由基清除率越高。
表1
2、检测DPPH自由基清除率
(1)同步骤1中(1)。
(2)完成步骤(1)后，检测各个溶液的DPPH自由基清除率。
实验结果见表1。结果表明，溶液的浓度越高，DPPH自由基清除率越高。
3、细胞内活性氧水平的检测
小鼠B16F10细胞为中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心的产品。
(1)取醇提液或水提液，用水稀释，得到浓度为0.03μg/mL的溶液2、浓度为0.13μg/mL的溶液4或浓度为0.50μg/mL的溶液6。
(2)取贴壁良好的小鼠B16F10细胞(约106个)，去除DMEM细胞培养液，加入5mL溶液2、溶液4或溶液6，37℃、5％CO2下培养24h；然后弃液相，先用pH7.2、0.0.1mM的PBS缓冲液洗涤2次，再加入0.5mL 0.25％胰酶充分消化，离心，收集沉淀。
(3)完成步骤(2)后，取所述沉淀，加入1mL DCFH-DA溶液(用1000mL无血清培养液稀释1g DCFH-DA得到的溶液)，混匀；然后置于细胞培养箱，37℃培养20min(期间每隔3-5min颠倒一次)。
(4)完成步骤(3)后，弃液相，用无血清细胞培养液洗涤3次(目的为充分去除未进入小鼠B16F10细胞内的DCFH-D)，然后5000r/min离心5min，收集沉淀。
(5)完成步骤(4)后，取所述沉淀，加入pH7.2、0.0.1mM的PBS缓冲液，得到浓度为1×106个/mL的细胞悬液。将所述细胞悬液点板(设置3个复孔)，使用荧光酶标仪在488nm激发波长，525nm发射波长处测定荧光强度。
按照上述步骤(2)-(5)，将步骤(2)替换为步骤(2A)，步骤(4)替换为步骤(4A)，其它步骤均不变，作为阳性对照。步骤(2A)：取贴壁良好的小鼠B16F10细胞(约106个)，加入0.5mL 0.25％胰酶充分消化，离心，收集沉淀。步骤(4A)：完成步骤(3)后，弃液相，用ROSUP(碧云天活性氧检测试剂盒(S0033),自带阳性对照药)处理20min，然后5000r/min离心5min，收集沉淀。
按照上述步骤(2)-(5)，将步骤(2)中的溶液2、溶液4或溶液6替换成无血清的DMEM培养基，其它步骤均不变，作为空白对照。
实验结果见表2。结果表明，ROSUP能够显著增加细胞的荧光强度，表明活性氧水平显著上升；溶液2、溶液4和溶液6作用小鼠B16F10细胞后，其荧光强度显著低于空白对照，表示ROS水平显著降低；且随着浓度的升高，其荧光强度呈现降低趋势。
上述结果表明，红曲沙棘籽仁粉甲的醇提液或水提液均具有良好的抗氧化活性。
表2
实施例3、红曲沙棘籽仁粉乙的制备及其抗氧化活性的检测
一、红曲沙棘籽仁粉乙的制备
1、取沙棘籽仁粉和糯米混合均匀，得到混合物。混合物中，沙棘籽仁粉和糯米的质量比为1:4。
(2)完成步骤(1)后，取100g混合物，加入200mL蒸馏水，搅拌均匀，用10％的碳酸氢钠水溶液调节pH值至7.0；然后121℃高温灭菌30min，得到培养基质。
3、完成步骤2后，向100g培养基质中接种红曲霉菌液(接种量为6.25×103个)，充分混匀后，在温度为30℃、湿度为60％的条件下培养25d。
4、取完成步骤3的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到红曲沙棘籽仁粉乙。
5、检测红曲沙棘籽仁粉乙中Monacolin K的含量。
6、取1.00g红曲沙棘籽仁粉乙，加入7mL 80％(v/v)乙醇水溶液(药液比为1g:7mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。
7、完成步骤6后，检测醇提液中的原花青素含量和总酚含量，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉乙中的原花青素含量和总酚含量。
8、取1.00g红曲沙棘籽仁粉乙，加入7mL蒸馏水(药液比为1g:7mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。
9、完成步骤8后，检测水提液中的总糖含量和多肽含量，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉乙中的总糖含量和多肽含量。
结果表明，红曲沙棘籽仁粉乙中，Monacolin K含量为4.01mg/g，总酚的含量为4.09mg/g，原花青素的含量为0.29mg/g，多肽的含量为4.40mg/g，总糖的含量为33.50mg/g。
二、抗氧化活性的检测
提取液为醇提液或水提液。
1、检测羟自由基清除率
按照实施例2步骤二中1的方法，将红曲沙棘籽仁粉甲的提取液替换为红曲沙棘籽仁粉乙的提取液，其它步骤均不变。
实验结果见表1。结果表明，溶液的浓度越高，羟自由基清除率越高。
2、检测DPPH自由基清除率
按照实施例2步骤二中2的方法，将红曲沙棘籽仁粉甲的提取液替换为红曲沙棘籽仁粉乙的提取液，其它步骤均不变。
实验结果见表1。结果表明，溶液的浓度越高，DPPH自由基清除率越高。
3、细胞内活性氧水平的检测
按照实施例2步骤二中3的方法，将红曲沙棘籽仁粉甲的提取液替换为红曲沙棘籽仁粉乙的提取液，其它步骤均不变。
实验结果见表2。结果表明，溶液的浓度越高，小鼠B16F10细胞内活性氧水平越低。
上述结果表明，红曲沙棘籽仁粉乙的醇提液或水提液均具有良好的抗氧化活性。
实施例4、红曲沙棘籽仁粉丙的制备及其抗氧化活性的检测
一、红曲沙棘籽仁粉丙的制备
1、取沙棘籽仁粉和籼米混合均匀，得到混合物。混合物中，沙棘籽仁粉和籼米的质量比为1:1。
(2)完成步骤(1)后，取100g混合物，加入250mL蒸馏水，搅拌均匀，此时pH值约为5.0；然后121℃高温灭菌30min，得到培养基质。
3、完成步骤2后，向100g培养基质中接种红曲霉菌液(接种量为8×105个)，充分混匀后，在温度为30℃、湿度为70％的条件下培养20d。
4、取完成步骤3的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到红曲沙棘籽仁粉丙。
5、检测红曲沙棘籽仁粉丙中Monacolin K的含量。
6、取1.00g红曲沙棘籽仁粉丙，加入7mL 80％(v/v)乙醇水溶液(药液比为1g:7mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。
7、完成步骤6后，检测醇提液中的原花青素含量和总酚含量，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉丙中的原花青素含量和总酚含量。
8、取1.00g红曲沙棘籽仁粉丙，加入7mL蒸馏水(药液比为1g:7mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。
9、完成步骤8后，检测水提液中的总糖含量和多肽含量，进一步计算得到红曲沙棘籽仁粉丙中的总糖含量和多肽含量。
结果表明，红曲沙棘籽仁粉丙中，Monacolin K含量为1.90mg/g，总酚的含量为2.50mg/g，原花青素的含量为0.90mg/g，多肽的含量为1.85mg/g，总糖的含量为25.11mg/g。
二、抗氧化活性的检测
提取液为醇提液或水提液。
1、检测羟自由基清除率
按照实施例2步骤二中1的方法，将红曲沙棘籽仁粉甲的提取液替换为红曲沙棘籽仁粉丙的提取液，其它步骤均不变。
实验结果见表1。结果表明，溶液的浓度越高，羟自由基清除率越高。
2、检测DPPH自由基清除率
按照实施例2步骤二中2的方法，将红曲沙棘籽仁粉甲的提取液替换为红曲沙棘籽仁粉丙的提取液，其它步骤均不变。
实验结果见表1。结果表明，溶液的浓度越高，DPPH自由基清除率越高。
3、细胞内活性氧水平的检测
按照实施例2步骤二中3的方法，将红曲沙棘籽仁粉甲的提取液替换为红曲沙棘籽仁粉丙的提取液，其它步骤均不变。
实验结果见表2。结果表明，结果表明，溶液的浓度越高，小鼠B16F10细胞内活性氧水平越低。
上述结果表明，红曲沙棘籽仁粉丙的醇提液或水提液均具有良好的抗氧化活性。
实施例5、红曲沙棘籽仁粉甲、红曲沙棘籽仁粉乙和红曲沙棘籽仁粉丙的降血脂功效的检测
SPF级ICR雄性小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。
基础饲料为江苏省协同医药生物工程有限责任公司的产品。
高脂饲料由4质量份胆固醇、10质量份猪油、0.2质量份甲基硫氧嘧啶和86质量份基础饲料混合而成。
实验期间，自由饮水和进食，饲养环境温度22-25℃，相对湿度50-60％，每隔3d更换一次垫料，光照充足。
1、取50只、重量为(23±3)g的SPF级ICR雄性小鼠，先适应性饲养一周，然后随机分成正常对照组、高脂模型组、红曲沙棘籽仁粉甲组、红曲沙棘籽仁粉乙组和红曲沙棘籽仁粉丙组共5组，每组10只；然后进行如下处理：
正常对照组：饲喂基础饲料且每天用生理盐水灌胃，连续灌胃42d；每天灌胃的生理盐水体积和红曲沙棘籽仁粉甲组中的红曲沙棘籽仁粉甲的灌胃体积相同；
高脂模型组：饲喂高脂饲料且每天用生理盐水灌胃，连续灌胃42d；每天灌胃的生理盐水体积和红曲沙棘籽仁粉甲组中的红曲沙棘籽仁粉甲的灌胃体积相同；
红曲沙棘籽仁粉甲组：饲喂高脂饲料且每天用红曲沙棘籽仁粉甲灌胃，连续灌胃42d；剂量为300mg/(kg·d)；
红曲沙棘籽仁粉乙组：饲喂高脂饲料且每天用红曲沙棘籽仁粉乙灌胃，连续灌胃42d；剂量为300mg/(kg·d)；
红曲沙棘籽仁粉丙组：饲喂高脂饲料且每天用红曲沙棘籽仁粉丙灌胃，连续灌胃42d；剂量为300mg/(kg·d)。
2、完成步骤1后，将各只ICR雄性小鼠处死，采血，制备血清；然后采用总胆固醇(TC)测试盒(南京建成生物工程研究所的产品，产品目录号为A111)、甘油三酯(TG)测试盒(南京建成生物工程研究所的产品，产品目录号为A110)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒(南京建成生物工程研究所的产品，产品目录号为A112)测定血清中的总胆固醇(TC)含量、甘油三酯(TG)含量、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量(由Friedwald WT公式(LDL-C＝TC－(1/5TG+HDL-C)可以计算出低密度脂蛋白胆固醇的含量)。
检测结果见表3。结果表明，高脂模型组的TC含量、TG含量均显著高于正常对照组，说明建模成功。红曲沙棘籽仁粉甲、红曲沙棘籽仁粉乙或红曲沙棘籽仁粉丙的摄入有助于小鼠血脂水平的改善，与高脂模型组相比，其TC、TG、LDL-C含量显著降低。
表3
注：“*”表示与高脂模型组比较差异性显著。
上述结果表明，红曲沙棘籽仁粉甲、红曲沙棘籽仁粉乙和红曲沙棘籽仁粉丙均具有良好的降血脂功效。
实施例6、采用红曲霉BNCC212464制备红曲沙棘籽仁粉及其检测
1、红曲霉BNCC212464菌液的获得
本实施例中的红曲霉菌属菌种(Monascus sp.)为北纳生物(网址为：www.bnbio.com)的产品，编号为BNCC212464。在下文中，该红曲霉菌属菌种简称为红曲霉BNCC212464。
(1)将红曲霉BNCC212464接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，28℃培养7d(目的为活化)。
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、200rpm培养7d，得到红曲霉BNCC212464菌液。
2、按照实施例2的方法，将红曲霉菌液替换为红曲霉BNCC212464菌液，其它步骤均不变。
结果表明，采用红曲霉BNCC212464菌液制备的红曲沙棘籽仁粉1的醇提液或水提液也均具有良好的抗氧化活性；与红曲沙棘籽仁粉甲相比，用红曲霉BNCC212464菌液制备的红曲沙棘籽仁粉中的Monacolin K含量、总酚含量、原花青素含量和黄酮含量略有下降。
3、按照实施例3的方法，将红曲霉菌液替换为红曲霉BNCC212464菌液，其它步骤均不变。
结果表明，采用红曲霉BNCC212464菌液制备的红曲沙棘籽仁粉2的醇提液或水提液也均具有良好的抗氧化活性；与红曲沙棘籽仁粉乙相比，用红曲霉BNCC212464菌液制备的红曲沙棘籽仁粉中的Monacolin K含量、总酚含量、原花青素含量和黄酮含量略有下降。
4、按照实施例4的方法，将红曲霉菌液替换为红曲霉BNCC212464菌液，其它步骤均不变。
结果表明，采用红曲霉BNCC212464菌液制备的红曲沙棘籽仁粉3的醇提液或水提液也均具有良好的抗氧化活性；与红曲沙棘籽仁粉丙相比，用红曲霉BNCC212464菌液制备的红曲沙棘籽仁粉中的Monacolin K含量、总酚含量、原花青素含量和黄酮含量略有下降。
5、降血脂功效的检测
SPF级ICR雄性小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。
实验期间，自由饮水和进食，饲养环境温度22-25℃，相对湿度50-60％，每隔3d更换一次垫料，光照充足。
1、取50只、重量为(23±3)g的SPF级ICR雄性小鼠，先适应性饲养一周，然后随机分成正常对照组、高脂模型组、红曲沙棘籽仁粉1组、红曲沙棘籽仁粉2组和红曲沙棘籽仁粉3组共5组，每组10只；然后进行如下处理：
正常对照组：饲喂基础饲料且每天用生理盐水灌胃，连续灌胃42d；每天灌胃的生理盐水体积和红曲沙棘籽仁粉甲组中的红曲沙棘籽仁粉1的灌胃体积相同；
高脂模型组：饲喂高脂饲料且每天用生理盐水灌胃，连续灌胃42d；每天灌胃的生理盐水体积和红曲沙棘籽仁粉甲组中的红曲沙棘籽仁粉1的灌胃体积相同；
红曲沙棘籽仁粉1组：饲喂高脂饲料且每天用红曲沙棘籽仁粉甲灌胃，连续灌胃42d；剂量为300mg/(kg·d)；
红曲沙棘籽仁粉2组：饲喂高脂饲料且每天用红曲沙棘籽仁粉乙灌胃，连续灌胃42d；剂量为300mg/(kg·d)；
红曲沙棘籽仁粉3组：饲喂高脂饲料且每天用红曲沙棘籽仁粉丙灌胃，连续灌胃42d；剂量为300mg/(kg·d)。
2、完成步骤1后，将各只ICR雄性小鼠处死，采血，制备血清；然后采用总胆固醇(TC)测试盒、甘油三酯(TG)测试盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒测定血清中的总胆固醇(TC)含量、甘油三酯(TG)含量、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量(由Friedwald WT公式(LDL-C＝TC－(1/5TG+HDL-C)可以计算出低密度脂蛋白胆固醇的含量)。
检测结果表明，高脂模型组的TC含量、TG含量均显著高于正常对照组，说明建模成功。红曲沙棘籽仁粉1、红曲沙棘籽仁粉2或红曲沙棘籽仁粉3的摄入有助于小鼠血脂水平的改善，与高脂模型组相比，其TC、TG、LDL-C含量显著降低。
上述结果表明，红曲沙棘籽仁粉1、红曲沙棘籽仁粉2和红曲沙棘籽仁粉3均具有良好的降血脂功效。
Claims (10)
1.一种红曲沙棘籽仁粉的制备方法，包括步骤a1)：向无菌原料中接种红曲霉和/或紫色红曲，发酵，得到发酵产物；所述原料包括沙棘籽仁粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原料还包括稻米。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述原料中，沙棘籽仁粉和稻米的质量比为1:(0.5-5)。
4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述原料还包括水。
5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：制备所述无菌原料的步骤为：将沙棘籽仁粉、稻米和水混合，调节pH值为5.0-12.0，然后高温灭菌。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵参数为20℃-35℃培养15-20d。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤a2)和a3)：
a2)取步骤a1)得到发酵产物，高温灭菌，然后35℃-45℃烘干24h-48h或真空冷冻干燥；
a3)完成步骤a2)后，粉碎，得到红曲沙棘籽仁粉。
8.采用权利要求1至7任一所述方法制备的红曲沙棘籽仁粉的应用，为A1)-A10)中的至少一种：A1)生产Monacolin K；A2)预防和/或治疗动脉粥样硬化；A3)降低胆固醇；A4)预防和/或治疗高血压；A5)提高羟自由基清除率；A6)清除羟自由基；A7)提高DPPH自由基清除率；A8)清除DPPH自由基；A9)抗氧化；A10)提高抗氧化活性。
9.沙棘籽仁粉或沙棘籽仁的应用，为B1)-B21)中的至少一种：B1)制备红曲沙棘籽仁粉；B2)制备用于生产Monacolin K的产品；B3)制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的产品；B4)制备用于降低胆固醇的产品；B5)制备用于预防和/或治疗高血压的产品；B6)制备用于提高羟自由基清除率的产品；B7)制备用于清除羟自由基的产品；B8)制备用于提高DPPH自由基清除率的产品；B9)制备用于清除DPPH自由基的产品；B10)制备具有抗氧化活性的产品；B11)制备具有抗氧化活性的产品；B12)生产Monacolin K；B13)预防和/或治疗动脉粥样硬化；B14)降低胆固醇；B15)预防和/或治疗高血压；B16)提高羟自由基清除率；B17)清除羟自由基；B18)提高DPPH自由基清除率；B19)清除DPPH自由基；B20)抗氧化；B21)抗氧化。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为采用权利要求1至7任一所述方法制备的红曲沙棘籽仁粉。
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| 王茂广: "沙棘籽蛋白酶解物抗氧化作用初探", 《中国粮油学报》 * |
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