CN109789129A - 自噬改良材料及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了化学式1或化学式2的化合物及其用途。基于通过促进溶酶体产生的自噬激活的新机制，根据本申请的化合物可有利地用于预防或治疗代谢疾病，包括2型糖尿病、胰岛素抗性或肥胖。

Description

自噬改良材料及其用途
技术领域
本发明涉及用于调节自噬的试剂及其用于治疗与自噬相关的疾病的用途。
背景技术
自噬是一种溶酶体依赖的细胞过程，涉及细胞自身组分的降解和调节，并且包括大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。其中，大自噬(下文称为自噬)的特征在于将细胞质和细胞器隔离的亚细胞膜重新排列，以形成新的细胞器样结构(大自噬体)。自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，在其中通过溶酶体酶降解隔离的物质(Klionsky，DJ，and Emr，SD(2000)Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation.Science290，1717-1721)。自噬的生理作用包括细胞器或细胞蛋白质的质量控制和营养平衡的保护(Mizushima，N，and Komatsu，M(2011)Autophagy：renovation of cells andtissues.Cell 147，728-741)。
因为自噬在控制诸如氨基酸、脂质和葡萄糖的多种必需营养物的细胞代谢平衡中起着至关重要的作用，所以预期自噬在生理条件下维持全身代谢中发挥关键作用。另一方面，在病理条件下，失调的自噬可能参与代谢紊乱的发展，比如糖尿病和代谢综合征。特别是在糖尿病中，自噬可能是疾病各个方面的重要因素，因为胰岛素及其下游因子mTOR(雷帕霉素的机制性靶标)是众所周知的自噬抑制剂(Sarbassov，DD等人(2005)Growing rolesfor the mTOR pathway.Curr Opin Cell Biol 17，596-603)，而胰高血糖素，胰岛素的一种反调节激素，是自噬的激活剂。这些使得产生了自噬可能在糖尿病的各个方面发挥重要作用的观点。此外，对于胰腺细胞功能和胰岛素敏感性至关重要的细胞器比如内质网(ER)或线粒体的完整性依赖于自噬(Mizushima，2011同上)。由于自噬在脂质和蛋白质的移动和受损细胞器的循环中起着关键作用，因此自噬活性的缺乏将导致细胞间积聚过多的脂肪、聚集的蛋白质和功能失调的细胞器，这些都会导致代谢紊乱或糖尿病。
因此，已经使用特定组织中或以系统方式改变自噬的各种遗传模型，广泛研究了体内自噬在糖尿病和代谢综合征中的作用(Kim，J等人(2014)Amyloidogenic peptideoligomer accumulation in autophagy-deficient b-cells leads to diabetes.J ClinInvest 125，3311-3324)。取决于自噬缺陷的位置和严重程度，这些小鼠表现出不同的代谢状况(Coupe，B等人(2012)Loss of autophagy in pro-opiomelanocortin neuronsperturbs axon growth and causes metabolic dysregulation.Cell Metab 15，1-9)。尽管在能量代谢调节中各种组织中自噬改变的代谢作用复杂且相互矛盾，但系统性增强的自噬活性可能对体内的身体代谢产生有益影响，尤其是与代谢应激或肥胖有关(Kim等人，2014，同上)。此外，最近的一篇论文指示，在代谢应激状态下，由于高脂肪喂养或衰老(这两个因素都是糖尿病发展的重要因素)，体内的线粒体自噬(mitophagic)活性(自噬活性的一个重要组成部分)显著降低，指示自噬活性增强可逆转代谢综合征或糖尿病的潜在原因的可能性(Sun，N等人(2015)Measuring In Vivo Mitophagy.Mol Cell 60，685-696)。
由于自噬涉及广泛的生物过程和各种疾病，因此已经对自噬调节剂进行研究，尝试开发对神经变性、传染病、癌症或衰老具有治疗作用的新型化合物。例如，已经开发了许多自噬增强剂，包括天然化合物、具有已知功能的化合物或新化合物(Eisenberg，T等人(2009)Induction of autophagy by spermidine promotes longevity，Nature CellBiol11，1305-1314；Shoji-Kawata，S等人(2013)Identification of a candidatetherapeutic autophagy-inducing peptide.Nature 494，201-206)。
美国专利公开号2014-0134661公开了一种用于自噬增强剂的筛选方法，其中使用p62作为标记物，并且选择影响蛋白的材料作为潜在的增强剂。
然而，以前开发的增强剂并没有研究其参与代谢紊乱，因此它们对代谢疾病、糖尿病等的影响仍然不明确。相反，它们可能对治疗代谢紊乱有不良影响，因为它们与mTOR的相互作用还没有被清楚地识别。mTOR的抑制可导致自噬增强；但它可能加重糖尿病，因为它可能导致胰岛细胞的减少，从而降低胰岛素的分泌。因此，有必要开发一种可以显著增强mTOR的自噬活性的自噬增强剂。
发明内容
本公开提供了通过调节溶酶体的自噬调节剂和用于治疗或预防2型糖尿病、胰岛素抗性和肥胖的组合物。
在本公开的一个方面中，提供了一种用于治疗或预防代谢紊乱的药物组合物，所述药物组合物包括下述式1或式2的化合物或其药学上可接受的盐：
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
本发明的化合物或本发明的组合物可有利地用于治疗或预防代谢紊乱或代谢综合征，包括胰岛素抗性、2型糖尿病、高脂血症、肥胖或炎症中的一种或多种症状。
本发明的化合物具有增强、改善、促进或激活自噬的作用，因而可有效地用于治疗可能由自噬耗竭而发展的各种疾病。此外，本发明的化合物不抑制mTOR的功能，并因此可有效地用于治疗或预防代谢紊乱或代谢综合征，包括胰岛素抗性、2型糖尿病、高脂血症、肥胖或炎症的一种或多种症状。
本发明的化合物可通过促进钙调磷酸酶活性、TFEB(转录因子EB)活性和溶酶体生物发生来增强自噬活性，而不抑制mTOR。
因此，在另一方面中，提供了一种通过利用本发明式1或2的化合物促进溶酶体的生物发生来提高自噬活性的方法或试剂盒。
在又一个方面中，提供了一种包括本发明的分子式1或2的化合物的试剂盒，通过促进溶酶体生物发生来去除细胞脂肪或脂质，而不抑制mTOR。
在又一个方面中，提供了一种通过使细胞与本发明式1或2的化合物接触而增强体外或体内自噬活性的方法，其中接触使得TFEB转移到细胞核，而不抑制mTOR。
在又一个方面中，提供了一种通过使细胞与本发明式1或2的化合物接触而在体内或体外从细胞中去除脂肪或脂质的方法，其中接触使得自噬活性增强，从而使得从细胞中去除脂肪或脂质。
在又一个方面中，提供了一种基于本公开中所确定的机制，筛选用于治疗或预防代谢疾病的治疗剂的方法，所述方法包括：提供真核细胞，其中细胞表达TFEB、钙调磷酸酶并具有自噬活性；使细胞经受代谢应激；用测试化合物处理该细胞；测定细胞中钙调磷酸酶、TFEB(转录因子EB)和自噬的活性；和当测定步骤中，与未经过测试化合物处理的对照细胞相比，细胞中钙调磷酸酶、TFEB和自噬的活性增加时，选择这些化合物作为用于治疗或预防代谢紊乱的潜在治疗剂。
在又一个方面中，提供了下述式2的化合物，一种式1的衍生物。
[式2]
其中R为F、Cl或Br。
提供了式1或式2的化合物用于治疗肥胖的用途。
提供了式1或式2的化合物用于治疗代谢紊乱的用途。
本发明的式1(MSL)和式2(MSL-7)的化合物可通过改善溶酶体的功能来增强自噬性活性。因此，本发明的化合物可有利地用于治疗或预防由于自噬机能障碍引起的各种疾病，特别是代谢疾病，包括肥胖、2型糖尿病和胰岛素抗性。尤其，本发明的化合物不依赖于mTOR机制起作用，从而避免了常规试剂通过抑制mTOR导致降低胰岛素分泌量的mTOR而降低胰岛细胞的可能副作用。因此本发明的化合物可有效地用作治疗2型糖尿病的疗法。
附图说明
图1指示根据本公开，基于荧光素酶分析，选择新的自噬增强剂的筛选测定结果。图1a指示本公开中确定的机制的示意图。图1b指示其中用pRLuc(C124A)-LC3(wt)或pRLuc(C124A)-LC3(G120A)转染Hek 293细胞，并且然后用50μM筛选的化合物处理HEK 293细胞6小时的结果。wt/G 120A的比率表示为相对于未处理的对照值的百分比。图1c指示其中将用该化合物处理的细胞进行裂解并且用所指示的抗体进行免疫印迹分析的结果。图1c、1d和1e是其中用二级筛选化合物处理细胞随后进行裂解并且用所指示的抗体进行免疫印迹的结果。
图2指示式I化合物(下文称为MSL)处理的Hela细胞的结果，显示处理的细胞中自噬通量增加。图2a指示其中将用RFP-LC3质粒转染48小时的HeLa细胞用本公开的化合物MSL或载剂对照处理1小时，然后用抗LAMP1的抗体对其进行免疫印迹的实验结果。箭头表示斑点(puncta)。LC3或斑点的数量也表示为条形图。图2b指示其中将用mRFP-GFP-LC3质粒转染48小时的HeLa细胞用本公开的化合物MSL或载剂对照处理1小时的实验结果，其中使用Image J软件测量自噬体(黄色斑点)或自噬溶酶体(红色斑点)。斑点的数量表示为条形图。图2c指示其中将用FYVE-dsRed质粒转染48小时的HeLa细胞用本公开的化合物MSL或载剂对照处理1小时的实验结果，其中测量了FYVE-dsRed囊泡的数量。测量值为从至少3个图像中获得的平均值。误差条，S.D.**，P<0.01；***，P<0.001。结果指示，根据本公开的MSL化合物增加了自噬通量。
图3指示MSL处理通过钙调磷酸酶激活控制TFEB的核转位。图3a是显示用MSL化合物处理TFEB-GFPHeLa细胞4小时然后用DAPI染色该细胞的核的核转位的TFEB百分比的图。图3b是其中在存在MSL化合物或载剂对照的情况下孵育HeLa细胞24小时，然后用吖啶橙染色所形成的酸性囊泡细胞器的实验结果。图3c是其中用MSL化合物或载剂对照处理TFEB-GFP HeLa细胞4小时然后用所指示的抗体对细胞进行免疫印迹的实验结果。图3d和图3e是用所指示的化合物处理的Hepa1c1c7细胞的裂解物中钙调磷酸酶活性的测量结果。误差条，S.D.**，P<0.01；***，P<0.001。结果指示，作用机理显示，通过本发明的化合物MSL处理的自噬通量增加，通过钙调磷酸酶的激活，导致TFEB的控制。
图4指示本发明的化合物MSL增加了脂滴的清除。图4a是其中用棕榈酸和油酸处理HeLa细胞16小时，然后用载剂对照或MSL化合物处理20小时，然后用BODIPY493/503将其染色的实验结果。图4b是其中用LC3染色图4a的细胞以观察溶酶体、LMAP1和自噬体的实验结果。图4c是其中用棕榈酸和油酸处理HeLa细胞16小时，然后用所指示的化合物处理20小时，之后通过Image J软件定量每个细胞中的脂滴的实验结果。测量值是从至少3个图像中获得的平均值。误差条，S.D.**，P<0.01；***，P<0.001。结果指示，通过本发明的MSL化合物增加自噬通量，提高了代谢性疾病中通常增加的脂滴的清除，并因此通过本发明的化合物有效改善/治疗代谢性疾病。
图5是指示本发明的化合物MSL降低了炎性体(inflammasome)的活化并且增强了线粒体的功能的结果。图5a是用棕榈酸、LPS和MSL分离和处理原代腹腔巨噬细胞，然后利用ELISA测量来自上清液中IL-β的浓度的实验结果。误差条，S.D.**，P<0.01；***，P<0.001，双因素ANOVA。图5b和图5c是下述实验的结果，其中将原代腹腔巨噬细胞用与图5a所述相同的条件处理，然后用MitoSOX(图5b)处理细胞以测量线粒体的ROS，或用MitoTracker Red和Mitotracker Green处理细胞以通过FACS分析测量线粒体的电位，其中数字表示指定设门的细胞百分比。结果指示，本发明的化合物MSL可通过改善代谢疾病中增加的炎症而有效改善/治疗代谢性疾病，并改善线粒体功能。
图6是指示本发明的化合物MSL改善了ob/ob小鼠的代谢参数的结果。图6a和图6c各自指示分别接受载剂对照或(50mg/kg/2天)处理8周的ob/ob小鼠的空腹血糖和体重。图6c指示用载剂对照或处理8周的ob/ob小鼠的饲料摄入量。图6d和图6e各自指示8周施用后测得的IPGTT结果和AUC值。图6f和图6g指示8周施用后的ITT结果和AUC值。图6h指示8周施用后的空腹血糖。图6i指示8周施用后的胰岛素浓度。图6j指示8周施用后测得的HOMA-IR的结果。图6k指示8周施用后测得的胰岛素生成指数的结果。误差条，S.D.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。学生t检验和单因素ANOVA。结果指示，本发明的化合物MSL可通过改善疾病模型小鼠的代谢参数而有利地用于有效治疗代谢疾病。
图7指示本发明的MSL化合物增强了体内自噬通量。图7a是其中ob/ob小鼠腹腔注射30mg/kg的亮肽素，然后1小时后，腹腔施用载剂对照或MSL化合物的实验结果。施用3小时后，制备肝裂解物并进行免疫印迹。条带上方的数字表示归一化为β肌动蛋白带的倍数变化。图7b指示通过使用与上述处理相同但不施用亮肽素的肝样品分离的总RNA进行RT-PCT而测量的TFEB相关基因的mRNA浓度。该值表示与对照小鼠(载剂对照)相比，从三只小鼠获得的倍数变化的平均值±S.D。结果指示，代谢参数的提高与自噬作用的增加有关。
图8指示，本公开的MSL改善了与代谢和脂肪肝相关的炎症。图8a是用MSL化合物或载剂处理8周的ob/ob小鼠肝切片苏木精-伊红染色的结果。图8b是使用含有脂肪酶的游离甘油试剂在使用氯仿/乙醇混合物从ob/ob小鼠肝脏中提取的脂质样品中测量TG浓度的结果。图8c是使用化学分析仪从用MSL化合物或载剂处理8周的ob/ob小鼠血清样品中分析血液化学状况(profile)的结果。图8d是用MSL化合物或载剂处理8周的ob/ob小鼠苏木精-伊红染色白色脂肪组织切片的结果。图8e是来自白色脂肪组织的F4/80+细胞的免疫染色结果(左)，和脂肪细胞F4/80+CLS的量化结果(右)，其表示为小鼠白色脂肪组织中CLS(树冠状结构)的频率，如上所述。图8f是用RT-PCR定量上述小鼠的WAT基因表达的结果。误差条，S.D.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。结果指示，通过本发明的MSL增加自噬通量改善了代谢疾病中增加的脂滴的去除，从而指示本发明的化合物可有效地用于治疗或改善代谢疾病。
图9指示本公开的MSL化合物对从溶酶体释放钙没有作用。用GCaMP3-ML1钙探针转染HeLa细胞，并获得比率图像(474和410nm激发)。之后，应用GPN(200μM)诱导较小的响应。应用离子霉素(ionomycin)(1μm)诱导最大响应。这指示，本发明的MSL化合物对TFEB的调节，不依赖于钙释放的控制。
图10是使用本公开的式2化合物(下文称为MSL-7)作为自噬增强剂的实验结果。图10a是使用经MSL或MSL-7处理的HeLa细胞，使用指示的抗体进行免疫印迹的结果。图10b是用载剂对照或不同浓度的MSL-7(50-100μm)处理48小时的HeLa细胞的活力的测量结果。图10c是用载剂对照或MSL-7处理4小时的TFEB-GFP HeLa细胞的DAPI染色细胞核的结果。图显示了转位到细胞核中的TFEB的百分比。误差条，S.D.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。结果指示MSL-7，MSL化合物的衍生物，也能增强自噬作用。
图11指示本公开的式2化合物(下文称为MSL-7)改善了ob/ob小鼠的代谢参数。图11a是施用载剂对照或MSL-7(50mg/kg/2天)8周的ob/ob小鼠空腹血糖浓度的结果。图11b是图11a中的小鼠的监测体重。图11c是在施用IPGTT(图11c)和ITT(图11d)后8周进行的实验结果。图11e是使用化学分析仪测量施用载剂对照或MSL-7化合物8周的ob/ob小鼠的血液化学状况的结果。误差条，S.D.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。学生t检验和单因素ANOVA。结果指示，MSL比其衍生物MSL-7更有效地改善肥胖引起的代谢疾病。
图12指示MSL-7对HFD喂养的小鼠的代谢状况的改善：(a)用串联mRFP-GFP-LC3转染并用MSL-7处理的HeLa细胞的共聚焦显微镜结果，其中红色斑点表示自噬溶酶体。(b、c)8周龄雄性C57BL/6小鼠用HFD或正常饮食(NCD)喂养8周，然后每周3次施用50mg/kg MSL-7，持续8周。监测非空腹血糖水平(b)和体重(c)。(d)IPGTT。(e)(d)的AUC曲线。(f)ITT。(g)(f)的AUC曲线。结果指示，与MSL相比，MSL的衍生物MSL-7更有效地改善高脂饮食引起的代谢疾病。
图13指示MSL-7对人型糖尿病小鼠β细胞功能及代谢状况的影响。(a)将用非淀粉样前-mIAPP-HA或淀粉样前hIAPP-HA构建物转染的INS-1细胞用MSL或MSL-7处理，随后使用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析。(b)在存在或不存在巴佛洛霉素(bafilomycin)的情况下，用MSL-7处理(A)的转染细胞，随后使用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析。(c)在存在或不存在3-MA的情况下，用MSL-7处理转染细胞，然后测量细胞裂解物中所含的寡核小体的量。(d)给HFD喂养的hIAPP+小鼠施用MSL-7，并监测非空腹血糖水平。(e)IPGTT。(f)给HFD喂养的hIAPP+小鼠施用MSL-7持续8周，并测量胰岛素生成指数。(g)给HFD喂养的hIAPP+小鼠施用MSL-7持续8周，并获得胰腺切片。A11抗体用于免疫组化(左)。DAPI+细胞中A11双核(duatorehl)细胞的百分比(右)。(h)施用MSL-7持续8周的HFD喂养的hIAPP+小鼠的FSB染色胰腺切片(左)。平均荧光强度/面积(右)。结果指示，本公开的MSL的衍生物MSL-7可通过改善人型糖尿病小鼠的代谢状况和β细胞功能而改善该疾病。
图14指示，在体内施用本发明的化合物的MSL或MSL-7没有有害影响或没有毒性，如主要器官样品活检所证明。将从施用MSL或MSL-7持续8周的ob/ob小鼠获取的器官，用H&E染色进行组织学分析。发现脂肪肝得到改善。除此之外，未观察到显著变化(比例尺。500μm)。这指示，本发明的MSL或MSL-7在体内施用后对主要器官没有毒性，因而指示其作为治疗剂的潜力。
具体实施方式
本发明基于发现能够通过不依赖于mTOR上调溶酶体的生物发生来增强自噬的小分子。通过利用基于荧光素酶检测的自噬能通量分析筛选化合物库来发现本发明的小分子。
在一个方面中，本公开涉及一种用于治疗或预防代谢疾病的，包括下述所示的式1的化合物(MSL)或式2的化合物(MSL-7)，或其药学上可接受的盐的药物组合物：
[式1]
或
[式2]
其中，在式2中，R为F、Cl或Br。
在另一方面中，本公开涉及具有增强自噬活性的如下所示的式2化合物(MSL-7)。
本公开的式2化合物可通过下述反应式1的方法合成。
[反应方案1]
其中，R为F、Cl或Br。
在反应方案1的步骤1中，可以用溴乙酸甲酯合成苯磺酰乙酸甲酯。可使用有机溶剂，比如甲醇、乙醇或异丙醇在室温至溶剂沸点下进行2至30小时的反应。
在反应方案1的步骤2中，用氮杂化合物合成重氮化合物(重氮转移)。在该反应中，可使用4-乙酰氨基苯磺酰氮杂类、甲苯磺酰氮杂类等。可使用有机溶剂，比如乙腈或二氯甲烷等在存在碱，比如TEA的情况下进行该反应。
在反应方案1的步骤3中，可以形成噁唑环。可在存在催化剂铑(II)的情况下进行该反应。可使用铑(II)、Rh2(OAc)2或Rh2(CF3CONH)2等作为催化剂。
上述反应方案仅代表可用于合成本发明的化合物的多种方法中的一种，因此可根据相关领域中普通人员可实施的方法采用不同的反应条件，或也可采用其他方法来合成本发明的化合物。
根据本公开的化合物激活或增强自噬，并因此可有利地用于预防或治疗可能受益于自噬增强的各种疾病。
在本公开中，自噬或自噬作用是指利用溶酶体的作用，分解代谢以去除细胞中包含变性蛋白质或不必要蛋白质的各种细胞组分。自噬的调节对于细胞组分的正常合成、降解和循环是必要的。在自噬过程中，形成自噬体，其然后与溶酶体融合，并且细胞组分被降解或再循环。自噬包括大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬，这些都包含在本公开的范围内。尤其，本公开包括大自噬。
本公开中的术语调节是指激活生物功能、刺激或上调、或降低或下调，或两者兼有。在一个实施方式中，调节是指生物功能的激活。此外，调节包括体外条件、体内条件或离体条件的调节。
因为自噬与诸如氨基酸、脂质和葡萄糖的多种营养物的代谢调节密切相关，所以自噬在维持全身代谢中也起着重要作用。因此，自噬失调可导致代谢疾病的发展，比如胰岛素抗性综合征，包括肥胖、糖尿病和胰岛素抗性。2型糖尿病的两个主要因素是胰岛素抗性和β细胞功能障碍。然而，2型糖尿病的病因在分子和细胞水平上尚不清楚。JNK活化、NF-kB活化和由于过量脂质、趋化因子和细胞因子积聚引起的低级组织炎症是重要的分子机制(Arkan，MC等人(2005)IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulinresistance.Nat Med 11，191-198；Vandanmagsar，B等人(2011)The NLRP3inflammasomeinstigate obesity-induced inflammation and insulin resistance.Nat Med 15，179-188)。在细胞器水平上，ER和线粒体的功能障碍以及应激也被认为是导致糖尿病的主要因素(Ozcan，U等人(2004)Endoplasmic reticulum stress links obesity，insulinaction，and type 2Diabetes.Science 306，457-461；Petersen，KF等人(2003)Mitochondrial dysfunction in the elderly：possible role in insulinresistance.Science 300，1140-1142)，这可能影响上述分子机制的上游或下游水平。在过量脂质存在的条件下或在衰老过程中，自噬活性降低，因此自噬不足可能导致ER和线粒体的功能障碍。因此，缺乏自噬可为糖尿病和与肥胖和衰老相关的代谢综合征的一个基本原因。
因此，具有用于增强自噬的活性的本公开的化合物可有利地用于治疗或预防代谢疾病或代谢综合征、胰岛素抗性、2型糖尿病、高脂血症或肥胖、或肥胖引起的炎症等。
在本公开中，代谢疾病或代谢综合征是指受试者由于代谢的基本异常而患有多种疾病状态或病症，比如2型糖尿病、高脂血症、肥胖和/或炎症的疾病或病症(PershadsinghHA，Dual Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha/gamma Agonists：Inthe Treatment of Type 2Diabetes Mellitus and the Metabolic Syndrome.TreatEndocrinol.2006；5(2):89-99)。
在本公开中，术语肥胖是指受试者由于能量不平衡而在体内积累的脂肪高于正常水平的疾病或病症。根据WHO，在亚太地区，用于诊断肥胖的公式定义为受试者的体重除以受试者身高(以米为单位)的平方，并且25.0或更高的值被视为肥胖，并且23或更高且小于25的值被定义为超重(有风险的体重)。肥胖分为内分泌性肥胖(由于内分泌异常或脑疾病)、单纯性肥胖(由于营养过剩)、增生性肥胖(由于脂肪细胞计数增加而肥胖)、肥大型肥胖(由于脂肪细胞大小增加而肥胖)、上身肥胖、下身肥胖以及由于内脏脂肪过多导致的肥胖、由于皮下脂肪过多导致的肥胖等，均包括在本发明的范围内。
在一个实施方式中，肥胖是与代谢疾病相关的肥胖。
在本公开中，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”包括通过施用本发明的组合物或化合物，缓解、减轻或改善疾病或病症的至少一种症状，和/或降低其严重性、进展和/或持续时间，和/或预防额外症状，并且包括预防性和/或治疗措施。在相关领域中，该领域普通技术人员能够参照医学协会等公开的材料来确定治疗、缓解、减轻或改善的水平或程度。
在本公开中，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”包括通过施用本发明的组合物或化合物来预防或延迟疾病或病症的至少一种症状的发展。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，当在与抑制自噬相关的症状发展之前施用本发明的组合物时，可以预防本文所公开的疾病。
因此，用于增强自噬的本发明的化合物可以制备成药物组合物。所述药物组合物中的至少一种可以同时或按顺序施用，或所述组合物可以与用于治疗本文所公开的疾病的其他活性成分组合施用。
本发明的治疗或药物组合物可用一种或多种药学上可接受的载体配制成各种适当形式。术语“药学上可接受”是指当向人类施用时在生理上可接受且通常不会引起诸如胃肠道疾病、头晕或类似反应等过敏反应的组合物。药学上可接受的载体的例子包括但不限于水、合适的油、盐水、用于胃肠外施用的水性载体(比如葡萄糖水溶液和二醇水溶液等)，并且可另外含有稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，比如亚硫酸氢钠、硫酸钠或抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。此外，根据本发明的组合物可进一步包含悬浮液、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、止痛剂、缓冲剂和抗氧化剂等，取决于具体的配方和施用路径。适用于本发明的药学上可接受的载体和配方，包括上文所例示的那些，详细描述于Remington Pharmaceutical Sciences的最新版本中。
本发明的组合物可通过下述方法以单位剂型或容器中所含的形式制备：根据本领域技术人员可以毫不费力地实施的方法，使用药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制该组合物。所述配方可以是油或水介质中的溶液、悬浮液或乳剂的形式，或是粉末、颗粒、片剂或胶囊形式。
本发明的组合物的施用途径可以毫不费力地选择，并且可以以各种途径向人类、动物等施用。例如，本发明的组合物可以以粉末、片剂、丸剂、颗粒、糖衣丸、硬胶囊或软胶囊、液体、乳剂、悬浮液、糖浆、酏剂、外用制剂、栓剂、灭菌注射液等的形式配制，并且用于全身或局部施用，或口服或胃肠外施用。在一个实施方式中，可尤其优选胃肠外施用。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。非水溶剂和悬浮剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(比如橄榄油)、可注射酯(比如油酸乙酯)等。Witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可纸(cacao paper)、月桂酸甘油酯(laurin)、甘油、明胶等可作为栓剂的基础。
本发明的药物组合物的剂量可根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病严重程度而变化。对于成人(60kg)的有效剂量通常为约1ng至10mg/天，尤其是约为1μg至1mg/天。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以改变上述剂量，因为剂量可以根据不同的条件变化，因此剂量不会以任何方式限制本发明的范围。
本发明的组合物可在期望范围内每天施用一次或多次，并且施用期没有特别限制。
本文使用的筛选方法基于解决传统基于LC3的测定的方法(Rubinsztein，DC等人Nat Rev Drug Discov 11，709-730)，其不区分自噬和自噬通量水平。传统的方法只能测量自噬水平，而不能测量自噬活性。因此，这可能导致自噬抑制剂被误认为是自噬增强剂。此外，测量自噬活性的常规方法适用于单独分析，而不适用于高通量测定。本发明的方法适用于高通量测量自噬活性。
根据本发明的化合物通过促进溶酶体的生成来增强自噬。如上文所述，溶酶体产生是自噬的重要构成部分。具体地，本发明的化合物通过促进溶酶体产生而激活自噬，而不依赖于m TOR抑制，即不通过抑制mTOR机制。
从这个角度来看，本发明的化合物涉及通过溶酶体产生来调节或增强自噬的试剂盒。
根据本公开的试剂盒可用于需要增强细胞中自噬的各种体内或体外方法。
从这个角度来看，公开了一种活体外、体内或离体激活或增强自噬的方法，该方法包括使细胞与本公开的式1或2化合物接触的步骤，其中所述接触使得TFEB转位到细胞核，而不抑制mTOR。
此外，本公开中发现，本发明的化合物抑制脂质代谢和炎性体活性。根据本公开的化合物促进溶酶体的生成，并且然后生成的自噬溶酶体直接与细胞中的脂质相互作用并去除脂质。因此，本发明的化合物可增强与过量脂质或肥胖相关的代谢状况。
因此，从这个角度来看，提供了一种药物组合物，其包括本公开的式1或2化合物，或其药学上可接受的盐，用于治疗或预防肥胖。
此外，从这个角度来看，提供了一种试剂盒，用于通过促进溶酶体的生成来去除细胞的脂质或脂肪，而不依赖于mTOR的抑制。
根据本公开的试剂盒可用于需要在体内或体外去除细胞的脂肪或脂质的各种方法。
从这个角度来看，提供了一种从体外、体内和离体细胞中去除脂肪的方法，所述方法包括使本公开的式1和2的化合物与细胞接触的步骤，其中所述接触使得自噬的活化，从而去除细胞的脂质。
传统上，主要在癌症、神经系统疾病和炎症性疾病中研究了自噬与疾病发展的关系。目前还没有关于自噬在代谢疾病发展中的作用的报道。在本公开中，已经发现代谢疾病可通过控制自噬来治疗，其导致控制炎症和去除细胞中的脂肪，并且还确定了潜在的分子机制(见图1a、图1b)。
因此，在另一方面中，基于本公开中确定的机制，提供了一种鉴别用于治疗或预防代谢疾病的治疗剂的筛选方法。
在一个实施方式中，本发明的方法包括下述步骤：提供用于所述方法的真核细胞；使所述细胞经受代谢应激；在使所述细胞经受代谢应激的步骤之前或之后用测试剂或测试化合物处理所述细胞；以及从所述细胞测量自噬活性、钙调磷酸酶和TFEB。作为测量步骤的结果，当用特定测试剂处理的细胞显示出比未用测试剂处理的细胞增加的自噬活性、钙调磷酸酶和TFEB时，可以选择特定的试剂作为潜在的治疗剂。
本公开中可使用的细胞包括体外细胞或实验中使用的动物(即实验动物模型)中存在的细胞。因为如上文所述，自噬对细胞的稳态至关重要，并因此需要所有类型的细胞具有适当的功能，所以本发明可采用具有自噬功能的各种类型的细胞。因此，只要可以从细胞中检测到用测试物质处理或不处理的自噬、TFEB和钙调磷酸酶的活性，本发明的方法所使用的细胞就没有特别的限制。所述细胞可包括但不限于例如HeLa、TFEB-GFP-HeLa、脂肪细胞或肝细胞，包括比如SK-HEP1(肝癌细胞系)和Hepa1c1c7(肝癌细胞系)。
在本发明的方法中，采用在用测试物质处理细胞之前或之后使细胞经受代谢应激的步骤。
如本文所用，术语代谢应激是指细胞识别和响应各种应激的一系列过程，特别是与营养物应激有关的一系列过程，特别是当特定营养物过量或不足时的应激，以满足或维持细胞的生物能量需要。尤其，从代谢疾病的角度来看，它可以解释为激活或灭活自噬。因此，根据本发明的方法筛选自噬调节剂，需要可以通过细胞激活或灭活自噬的适当的处理步骤。
在一个实施方式中，代谢应激包括但不限于用适当的脂质，例如棕榈酸或油酸处理细胞，或从细胞中消耗葡萄糖。本领域普通技术人员能够参照本公开(包括实施例)中所述内容来选择在本发明的方法中使用的合适的脂质。
在本发明的方法中，本领域已知测量自噬、TFEB和钙调磷酸酶的活性的方法，并且本领域普通技术人员能够参考本发明实施例中所述的内容毫不费力地选择适当的方法。此外，参照本公开(包括实施例)中所述内容，与未处理的细胞相比，可以毫不费力地确定处理的细胞中自噬、TFEB和钙调磷酸酶的活性水平或程度。
在本发明的方法中，预期本发明的方法中可使用的测试剂或物质不会抑制mTOR，而是诱导自噬、mTOR和钙调磷酸酶的活性。这些物质可包括但不限于小分子、高分子量分子、核酸(比如DNA、RNA、PNA和适配体)、蛋白质、碳水化合物和脂质等。
在一个实施方式中，小分子用来识别用于治疗和/或预防代谢疾病的试剂。例如分子量约小于1000Da(比如400Da、600Da或800Da)的小分子。如果需要，小分子可构成文库的一部分，其中包含的小分子总数可从数十到数百万不等。文库的测试物质可由下述组成：肽、类肽、环状或线性低聚化合物、基于模板的化合物(比如苯二氮卓、乙内酰脲、联芳)、碳环和多环化合物(比如萘、吩噻嗪、吖啶、类固醇等)、碳水化合物和氨基酸衍生物、二氢吡啶、二苯甲基和杂环化合物(比如三嗪、吲哚、噻唑烷等)，但不限于此。所用测试物质的量可根据所用的特定实验条件或方法和测试物质的种类而变化，其可由相关领域普通技术人员毫不费力地确定。
在本公开的其他方面中，提供了一种治疗有需要的受试者中代谢疾病的方法，所述方法包括施用有效量的式1或2化合物或包含该化合物和药学上可接受的载体的组合物的步骤。
对于本发明的方法中可使用的化合物或组合物。可参考上文所描述的内容。
可将本发明的化合物或本发明的组合物施用给需要治疗或预防代谢疾病的受试者。受试者包括但不限于哺乳动物，尤其包括灵长类，更尤其是人类。
本发明的化合物或组合物以治疗有效量施用。术语“治疗有效量”是指足以以适用于医疗的合理效益/风险比治疗疾病的量，并且可考虑疾病类型、严重程度、施用时间、对药物的敏感性、药物活性、施用途径和释放率、治疗持续时间、包括联合用药的因素以及医学领域众所周知的其他因素而确定。本发明的组合物可作为单个治疗剂或与其他治疗剂组合，按顺序或同时与传统治疗剂施用，并且可施用一次或多次。重要的是要考虑到上述所有因素，并施用能够以最小量获得最大效果且无副作用的量，这可以由本领域技术人员毫不费力地确定。
参考下述实施例，进一步详细解释本公开。然而，这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实验例
材料和方法
自噬增强剂的筛选。用10ul脂质体将10cm培养皿中的HEK293细胞转染5ug的pRLuc(C124A)-LC3(wt)或pRLuc(C124A)-LC3(G120A)质粒(Faskas，Identification of novelautophagy regulators by a luciferase-based assay for the kinetics ofautophagic flux.Autophagy 5：1018-1025，2009)。通过在存在400μg/ml G418的情况下培养而筛选出稳定的转染物，并分离出125nM帕霉素处理6h后野生/突变归一化荧光素酶比<0.7的克隆用于文库筛选。
荧光素酶测定。根据制造商的建议，使用双荧光素酶报告分析系统(Promega)进行萤火虫和海肾(Renilla)荧光素酶测定。简言之，细胞在1x裂解缓冲液中裂解，并经受单轮冷冻/解冻。在将5μL的裂解液与25μL的荧光素酶分析试剂II混合之后测定萤火虫荧光素酶。在进一步添加20ul的Stop&Glo试剂之后测定海肾荧光素酶。
细胞培养、培养基和药物治疗。将HeLa、TFEB-GFP-HeLa、SK-HEP1(肝癌细胞系)和Hepa1c1c7(肝癌细胞系)细胞在下述培养基中培养：(正常)添加10％FBS和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM、Sigma-Aldrich)；(饥饿)添加10mM HEPES的具有Ca和Mg的HBSS培养基；药物处理：MSL化合物(50-100μM)；雷帕霉素(2.5mg/ml)；Torin-1(1μM)；巴佛洛霉素(100nM)；环孢菌素A(10μM)；和FK506(5μM)。细胞用油酸(400μM)和棕榈酸(400μM)处理24小时。当指示时，用HBSS冲洗掉细胞，用含或不含MSL的DMEM替换16小时。在存在或不存在巴佛洛霉素的情况下，如前所述培养小鼠胰岛素瘤细胞系的INS-1细胞(Kim等人，2014，同上)，并用MSL-7处理。
乳酸脱氢酶(LDH)测定。根据制造商的方案，通过使用LDH试剂盒(Roche)测量细胞培养基中的LDH释放来测定细胞毒性。
转染和质粒。根据制造商的方案，使用脂质体2000(Invitrogen)用DNA质粒3×FLAG-hTFEB(A Ballabio)、FYVE-dsRed(Cantley LC)、RFP-LC3或mRFP-GFP-LC3瞬时转染细胞。根据制造商的方案，使用jetPEIDNA将INS-1细胞用prepro-mIAPP-HA或prepro-hIAPP-HA转染。
成像和图像量化。在LSM780共聚焦显微镜(Zeiss)上用40倍物镜进行成像。使用Image J进行图像分析(每个细胞的斑点计数)。当指示时，根据制造商的方法，用BODIPY493/503(Invitrogen，20μg/ml，20分钟)对细胞脂滴进行染色。用吖啶橙染色(Invitrogen，5ug/ml，10分钟)通过染色细胞来定量酸性囊泡细胞的形成。
抗体和蛋白质印迹。将细胞或组织溶解在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中，并且通过Bradford法测定蛋白质浓度。将十至30微克负载在4-12％Bis-Tris凝胶(NUPAGE，Invitrogen)或8-15％SDS-PAGE上，转移到PVDF膜，并用ECL法(Pierce)进行蛋白质印迹分析。使用下述抗体：LC3(Novus NB100-2331，1:1,000)，p62(Progen GP62-C，1:1,000)，b-肌动蛋白(Santa Cruz sc-47778，1:5,000)，FLAG(Sigma-Aldrich F1804，1:2,000)，70S6K(Cell Signaling 9202S，1:1000)，p-70S6K(Cell Signaling 9206S，1:1000)，mTOR(Cell Signaling 2983，1:1000)，pmTOR(Cell Signaling 2971S，1:1000)，TFEB(CellSignaling 4240，1:1000)。通过使用ImageJ软件分析定量蛋白质水平。
RNA提取、RT和实时RT-PCR。根据制造商的方案，使用TRIzol(Invitrogen)从细胞或组织中提取总RNA，并且使用MMLV-Rtase合成cDNA。使用SYBR绿(Takara)，在ABI PRISM7000(Applied Biosystems)中进行实时RT-PCR。所有表达值被归一化到GAPDH mRNA水平。使用的引物(5’至3’)：
TFEB-F(5′-CCAGAAGCGAGAGCTCACAGAT-3′)，TFEB-R(5′-TGTGATTGTCTTTCTTCTGCCG-3′)，MCOLN1-F(5′-TTGCTCTCTGCCAGCGGTACTA-3′)，MCOLN1-R(5′-GCAGTCAGTAACCACCATCGGA-3′)，UVRAG-F(5′-CTGTTTGGATGGGCTGAAAT-3′)，UVRAG-R(5′-YGCGAACACAGTTCTGATCC-3′)，CLCN7-F(5′-TGATCTCCACGTTCACCCTGA-3′)，CLCN7-R(5′-TCTCCGAGTCAAACCTTCCGA-3′)，LAMP1-F(5′-ACGTTACAGCGTCCAGCTCAT-3′)，LAMP1-R(5′-TCTTTGGAGCTCGCATTGG-3′)，CTSA-F(5′-CAGGCTTTGGTCTTCTCTCCA-3′)，CTSA-R(5′-TCACGCATTCCAGGTCTTTG-3′)，CTSD-F(5′-AACTGCTGGACATCGCTTGCT-3′)，CTSD-R(5′-CATTCTTCACGTAGGTGCTGGA-3′)，CTSF-F(5′-ACAGAGGAGGAGTTCCGCACTA-3′)，CTSF-R(5′-GCTTGCTTCATCTTGTTGCCA-3′)，ATP6V0E1-F(5′-CATTGTGATGAGCGTGTTCTGG-3′)，ATP6V0E1-R(5′-AACTCCCCGGTTAGGACCCTTA-3′)，ATP6V1H-F(5′-GGAAGTGTCAGATGATCCCCA-3′)，ATP6V1H-R(5′-CCGTTTGCCTCGTGGATAAT-3′)，GAPDH-F(5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′)和GAPDH-R(5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′)。
GCaMP3 Ca2+成像。HeLa细胞在15mm的盖玻片上生长，并用编码外周体(perilysosomal)局部ML1-GCaMP3钙探针的质粒进行转染。使用LSM780共聚焦显微镜(Zeiss)监测470nm处的荧光强度。48小时后，在含有或不含MSL的145mMNaCl、5mM KCl、3mMMgCl2、10mM葡萄糖、1mM EGTA、20mM HEPES(pH7.4)的碱性Ca2+溶液中测量溶酶体Ca2+释放。使用GPN(200μm，溶酶体破坏剂)作为阳性对照，诱导来自溶酶体的Ca2+释放。在所有实验结束时添加离子霉素(1μM)，以诱导最大响应用于比较。
钙调磷酸酶活性测定。根据制造商的方案，使用细胞钙调磷酸酶活性测定试剂盒(Abcam，ab139464)检测钙调磷酸酶活性。
组织学。将组织样品固定在10％福尔马林缓冲液中，并嵌入石蜡中。将切片(5μm)用苏木精-伊红染色用于形态测定，或加工以检测脂肪细胞周围树冠状结构(CLS)中聚集的F4/80阳性巨噬细胞。为了检测IAPP低聚物，将冷冻胰腺切片用A11抗体(Millipore)免疫染色，然后在存在缀合Alexa 488的山羊抗兔免疫球蛋白G的情况下孵育，并用共聚焦显微镜观察。
淀粉样染色。将脱蜡胰腺切片用70％甲酸处理20分钟，然后在存在10mMFSB(Millipore)的情况下孵育1小时。在荧光显微镜(Nikon)下观察DAPI反染切片。使用NIS-Elements AR 3.0软件(Nikon)测量平均荧光强度/面积。
IL-1βELISA测定。使用3.85％巯基乙酸盐培养基从C57BL/6小鼠分离原代腹腔巨噬细胞，并在存在或不存在500ng/ml LPS的情况下用PA处理。根据制造商的方法，孵育24小时后，使用小鼠ELISA试剂盒(R&D系统)测定培养上清液中的IL-1β含量。
线粒体变化。为了确定线粒体电位，在37℃下分别用1μM的MitoTracker Green和MitoTracker Red(Invitrogen)将腹腔巨噬细胞染色25分钟。使用FlowJo软件(TreeStar)在FACSVerse(BD Biosciences)上分析悬浮在PBS中1％FBS中的细胞。为了测量线粒体ROS含量，在37℃下用5μM MitoSOX(Invitrogen)孵育细胞5分钟，并且如上所述完成荧光激活细胞分类分析。
小鼠实验。从Jackson购买雄性ob/ob小鼠(6-8周)。将小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环中，并喂以饲料。在8周内用载剂(n＝9)、MSL或MSL-7(n＝9)处理ob/ob小鼠(腹腔注射；50mg/kg/2天)。在处理期间，对处理小鼠进行监测和称重。对于使用饮食诱导肥胖模型的实验，8周龄的雄性C57BL/6小鼠被喂以HFD8周，然后用50mg/kg MSL或MSL-7处理每周3次，与HFD一起喂养8周。如上所述维持表达淀粉样生成hIAPP的转基因小鼠(hIAPP+小鼠)(JacksonLaboratory)(Kim等人，2014年，同上)。16周龄的雄性hIAPP+小鼠用HFD以促进低聚物的积累，并且同时也施用MSL-7。所有动物实验均按照实验动物使用公共卫生服务部门的指导进行。用载剂(n＝9)或MSL(n＝9)(腹腔注射；50mg/kg/2天)处理ob/ob小鼠8周。在处理期间对小鼠进行监测并测量其体重。小鼠实验获得了延世大学的AAALAC认证单位IACUC动物护理和使用机构委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的批准。
腹腔葡萄糖耐受性试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。整夜禁食后通过腹腔注射1g/kg葡萄糖来进行IPGTT。在注射葡萄糖前(0分钟)和注射葡萄糖后15、30、60、120和180分钟用一触式血糖仪(Lifescan)测定血糖浓度。通过向禁食小鼠腹腔注射0.75U/kg常规胰岛素并在0、15、30、60和120分钟时测量血糖水平来进行ITT。使用ELISA试剂盒(Shibayagi)测定血清胰岛素浓度。采用下述公式计算HOMA-IR：(空腹胰岛素×空腹血糖)/22.5。胰岛素生成指数计算如下：(15分钟胰岛素-0分钟胰岛素)/(15分钟葡萄糖-0分钟葡萄糖)。
血液化学。根据制造商的说明，使用Fuji Dri-Chem血液化学分析仪进行血清ALT/AST、TG、总胆固醇、ALP、ALB、DBIL、GTT和LDH水平的测量。Hamevet950血液分析仪(DrewScientific)根据制造商的说明从肝素化血液中获取血象。
TG测量。为了生化测定TG含量，使用氯仿/甲醇混合物(2:1)从均质组织中提取脂质。将蒸发后的脂质残余物悬浮于100％乙醇中的1％Triton X-100中，并与游离甘油试剂混合。在37℃孵育5分钟后，在标准曲线上测量A540以计算TG浓度。
肝微粒体稳定性。反应混合物由在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中的人肝微粒体(BD Gentest)和10μm测试化学品组成。在37℃下预孵育5分钟后，通过添加NADPH再生溶液(BD Biosciences)启动反应。在0分钟和30分钟时，收集样品(50μl)。通过添加450μl的冰冷乙腈和丙咪嗪(100ng/ml，内标物)终止反应。在4℃下以13,000rpm旋转离心5分钟后，收集澄清的上清液，转移到液相色谱(LC)小瓶中，并通过LC-MS/MS(Agilent 6460)进行分析，以量化化学品。
统计分析。所有数值均表示为≥3的重复三次进行的独立实验的平均值±s.e.m.。除非另有说明，否则采用双尾学生t检验比较两组之间的数值。采用单因素ANOVA和图基(Tukey)检验比较多组间的数值。采用双因素重复测量ANOVA和邦弗朗尼事后检验(Bonferroni’s post-hoc test)比较两组之间的多次重复测量。当没有数值时，采用线性混合模型的双因素ANOVA。P值<0.05被认为是统计上显著的差异。
实施例1.式1的MSL化合物的合成。
式1化合物购自Chembridge(Cas No.831243-88-0)。
实施例2.制备2-(2-氯苯基)-5-甲氧基-4-(苯基磺酰基)噁唑(式2化合物：MSL-7)
实施例2-1.制备2-(苯基磺酰基)乙酸甲酯
将溴乙酸甲酯(10g，65.38mmol)和苯磺酸钠盐(12.9g，78.4mmol)在乙醇(200ml)中的溶液回流过夜。然后在减压下去除多余的溶剂。将混合物溶解于二氯甲烷(400ml)中并用水(2x 200ml)和盐水(150ml)洗涤。将有机层用无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩以得到标题化合物(13.5g，96％)。该化合物用于下一步，而不用进一步纯化。
实施例2-2.制备2-重氮-2-(苯基磺酰基)乙酸甲酯
在0℃下向乙腈(500ml)中2-(苯基磺酰基)乙酸甲酯(13.5g，67.7mmol)和4-乙酰氨基苯磺酰叠氮化物(16.65g，69.31mmol)的搅拌溶液逐滴添加三乙胺(7.0g，69.3mmol)。在室温下将反应混合物搅拌24小时。过滤反应混合物并用乙酸乙酯彻底洗涤所得固体。将滤液在真空中浓缩。使用乙酸乙酯和正己烷通过柱层析法纯化所得残余物，从而得到为淡黄色固体的标题化合物(15g，99％)。
实施例2-3.制备2-(2-氯苯基)-5-甲氧基-4-(苯基磺酰基)噁唑
向2-氯苯甲腈(600mg，4.36mmol)和乙酸铑(I1)(38.55mg，0.087mmol)的氯仿(10ml)回流溶液中添加2-重氮-2-(苯基磺酰基)乙酸甲酯(1.15g，4.8mmol)的氯仿(10ml)溶液。加入完成后，反应混合物在回流条件下保持3小时。将反应混合物在减压下冷却并浓缩。通过柱层析法纯化残余物，从而得到为白色固体的标题化合物(1.4g，92％)1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.99-7.87(m，3H)，7.76–7.59(m，4H)，7.58-7.44(m，2H)，4.25(s，3H)。
实施例3.无mTOR抑制的自噬增强剂的筛选。
为此，用pRLuc(C124A)-LC3(wt)或pRLuc(C124A)-LC3(G120A)转染HEK 293细胞。LC3的G120A替代可抵抗溶蛋白性裂解，这对形成LC3-I和-II至关重要，并因而抑制LC3的自噬体定位(Faskas，T等人(2009)Identification of novel autophagy regulators by aluciferase-based assay for the kinetics of autophagic flux.Autophagy 5，1018-1025)，而pRLuc的C124A替代降低了RLuc的自噬独立翻转(Faskas，2009同上；Loening，AM等人.Protein Eng Des Sel 19，391-400)。
然后，用化学库(包括7,800种购买的化学品(Korea Chemical Bank)和选定的化学品处理转染物，这些化学库在50μM浓度下将野生/突变体归一化荧光素酶比率降低到<0.6，而没有明显的细胞毒性(存活率>80％)。筛选两次后，我们选择了39种显示可重现自噬增强活性的候选化学品(图1a和图1b)。
接着，我们通过蛋白质印迹分析(使用SK-Hep1细胞)证实了自噬增强活性。39种化学物质中的16种在存在巴弗洛霉素的情况下诱导了LC3-I至-II的转化(图1c)。这指示它们是能够增加自噬通量的真正的自噬增强剂。在没有巴弗洛霉素的情况下，它们也降低了p62(图1c)。
接着，我们研究了这些自噬增强剂是否能够抑制mTOR活性，因为我们想消除对代谢状况和胰腺β细胞功能可能具有有害影响的mTOR抑制剂。为此，我们进行了蛋白质印迹分析，并且发现16种化学品中有8种在增强自噬通量的同时不抑制(血清诱导的)S6K1磷酸化(图1e)。这指示它们不依赖于mTOR的途径中诱导自噬活性。
为了进一步证实通过化学MSL的自噬通量的增加，我们研究了与自噬活性相关的溶酶体事件。MSL诱导的LC3+自噬体对溶酶体标志物LAMP1呈阳性，显示了共定位的自噬细胞器和溶酶体，并且提示在自噬溶酶体形成过程中发生了溶酶体事件(图2a)。此外，串联mRFP-GFP-LC3B探针转染后的共聚焦显微镜显示，用MSL处理后黄色斑点(RFP+GFP+；代表早期自噬细胞器)和红色斑点(RFP+GFP-，代表自溶酶体)数量均增加，再次证实了自噬的溶酶体步骤的发生(图2b)。我们还评估了自噬体成核。通过MSL增加了FYVE-dsRed+囊泡的募集，提示Vps34的激活和磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)的产生，这是自噬体形成的必要步骤(图2c)。总之，所有这些结果都指示MSL增强了自噬通量。
实施例4.集中在溶酶体上的自噬激活机制的鉴定。
接着，我们研究了通过MSL的自噬激活的分子机制，这与抑制mTOR活性无关。我们研究了通过MSL在自噬激活中激活的自噬的溶酶体步骤。当我们检查TFEB的变化(溶酶体生物发生和自噬的关键调节因子)时，我们观察到在大多数MSL处理的HeLa细胞中，TFEB被转移到细胞核(图3a)。与未处理的细胞相比，MSL处理的细胞中显示TFEB阳性的细胞核百分比大大提高(图3a)。与TFEB转位一致，吖啶橙染色后的红色荧光显著增加，显示MSL处理的细胞中溶酶体酸化增强和含量增加(图3b)。
接着，我们通过研究已被报道为通过脱磷酸化TFEB增强TFEB转位(Medina，DL等人(2015)Lysosomal calcium signaling regulates autophagy through calcineurin andTFEB.Nature Cell Biol 17，288-299)的溶酶体钙-钙调磷酸酶途径，研究了不涉及mTOR抑制的MSL对TFEB转位的机制(图3c)。当我们用溶酶体特异性Ca2+探针GCaMP3-ML1(Medina，2015，同上)转染HeLa细胞来测试MSL是否增加溶酶体Ca2+的释放时，我们观察到没有溶酶体Ca2+释放增加，而钙离子载体亲溶酶体剂GPN或离子霉素诱导溶酶体Ca2+释放(图9)。因此，我们研究了无论溶酶体Ca2+流出如何，MSL是否增加钙调磷酸酶活性。事实上，体外钙调磷酸酶测定显示，MSL显著增加了钙调磷酸酶活性(图3d)。此外，环孢菌素A(CsA)或FK506显著抑制了磷酸酶活性的增加，支持MSL增强钙调磷酸酶活性。环孢菌素A(CsA)或FK506也通过MSL消除了TFEB转位(图3e)，这与钙调磷酸酶活性在通过MSL的TFEB转位中的作用一致。通过MSL增加的钙调磷酸酶活性通过在蛋白质印迹分析中增强的TFEB迁移率(数据未示出)得到进一步证实。
实施例5.MSL对体外脂质代谢和炎性体激活的影响。
接着我们研究了MSL是否能够影响细胞代谢。我们用PA和OA装载Hepa1c1c7细胞(ATCC CRL 2026TM)，并检查MSL是否提高脂滴的清除率。与未处理的对照相比，用MSL处理16小时的细胞显示出显著的BODIPY染色的脂滴含量降低(图4a)。此外，具有BODIPY的LC3或LAMP1与BODIPY共定位(图4b)，证实了自噬溶酶体与细胞内脂质之间的直接相互作用。与脂质染色一致，MSL显著降低了装载PA(棕榈酸)和OA(油酸)的细胞中的脂质含量(图4c)。这些结果指示，MSL很可能由通过增强钙调磷酸酶活性激活自噬或脂噬来增加脂质周转，并指示MSL可能改善与脂质超载或肥胖相关的代谢状况的可能性。
通过NLRP3的炎性体激活是肥胖中与胰岛素抗性相关的代谢炎症的重要组成部分，诸如棕榈酸(PA)的脂质作为NLRP3的配体(Vandanmagsar，B等人(2011)TheNLRP3inflammasome instigate obesity-induced inflammation and insulinresistance.Nat Med 15，179-188)。此外，NLRP3激活通过自噬来调节，自噬不仅调节营养状态或细胞器功能，还调节先天或适应性免疫(Levine等人，Unveiling the roles ofautophagy in innate and adaptive immunity.Nature Review Immunology 7:767-777，2007)。当我们用PA结合脂多糖(LPS)处理巨噬细胞(mΦ)时，用ELISA测定的MSL处理的巨噬细胞中IL-1β的释放量显著低于未处理的巨噬细胞(图5a)，指示MSL降低了脂质诱导的炎性体激活。蛋白质印迹分析也显示MSL降低了半胱天冬酶-1裂解和IL-1β成熟，证实了来自IL-1β测量的结果(数据未示出)。
由于以前的文献报道，自噬通过控制用作炎性体激活中枢细胞器的功能失调线粒体的周转来调整炎性体的激活(Misawa，T等人(2013)Microtubule-driven spatialarrangement of mitochondria promotes activation of the NLRP3 inflammasome.NatImmunol 14，454-460)。因此，我们研究了用MSL处理的细胞中的线粒体事件。当线粒体ROS含量反映线粒体功能失调或损伤时，PA结合LPS可显著增加mΦ中的线粒体ROS含量。这里，MSL处理显著降低了用PA加LPS处理的细胞中的线粒体ROS含量(图5b)。我们还评估了反映线粒体功能的线粒体电位。用PA加LPS处理的MΦ，通过MitoTracker Red染色法测定的线粒体电位明显降低。同样，MSL处理显著降低了用PA加LPS处理的细胞的线粒体电位(图5c)。
这些结果指示，MSL通过降低用作炎性体激活配体的脂质含量和改善脂质超载的细胞中的线粒体功能来降低炎性体激活。
实施例6.通过MSL的体内代谢改善。
接着我们研究了MSL是否能激活体内自噬通量。当我们在用亮肽素预处理之后施用MSL时(Ueno，T等人(1991)Membrane markers of endoplasmic reticulum preservedin autophagic vacuolar membranes isolated from leupeptin-administered ratliver.J Biol Chem 266，18995-18999)，在肝脏中LC3-I到-II的转化率增加，支持MSL可以增加体内自噬通量。接着我们研究了MSL是否能改善与肥胖相关的代谢状况。我们用50mg/kg的MSL处理ob/ob小鼠8周。食物摄入量和体重不受MSL的影响，但是，与对照处理的ob/ob小鼠相比，这些小鼠的非空腹血水平显著降低(图6a，图6b)。
连续8周施用MSL也显著提高了空腹血糖水平(图6h)。此外，IPGTT和ITT分别显示出葡萄糖耐受不良和胰岛素敏感性的显著改善(图6d，6f)，伴随着AUC的降低(图6e，6g)。与对照小鼠相比，MSL处理的小鼠的代表胰岛素抗性的HOMA-IR指数也略有下降(图6j)。施用MSL 8周后代谢状况改善，伴随着亮肽素施用后肝自噬活性增加(图7a)。值得注意的是，基因表达分析显示，MSL处理的小鼠中TFEB调节的基因的表达显著高于对照(图7b)，这与通过MSL处理体外细胞的TFEB的核转位一致。
接着我们研究了与肥胖相关的脂肪肝的可能改善。用MSL处理8周明显减少了ob/ob小鼠肝脏中脂滴的积累(图8a)。油红O染色证实，与对照小鼠相比，用MSL处理的ob/ob小鼠脂质含量降低(数据未示出)。通过MSL处理8周，血清ALT/ASL水平也显著降低(图8c)，指示脂肪肝损伤降低。我们还检查了那些小鼠中代谢炎症的变化，它在与肥胖相关的胰岛素抗性中起着重要作用。与对照小鼠相比，在用MSL处理8周的小鼠的WAT中，树冠状结构(CLS)、死亡脂肪细胞周围的巨噬细胞聚集物(反映代谢炎症严重程度)的数量明显减少(图8d，e)，指示MSL改善了代谢炎症。实时RT-PCR也证明了炎症标志物(比如Tnfa、I-l6、Il-1β和F4/80)的表达显著降低(图8f)，证实了通过MSL处理肥胖小鼠降低了代谢炎症。
我们还对MSL进行了化学改性，以产生具有更好的功效和成药性的MSL的衍生物。在几种衍生物中，我们测试了显示明确的自噬增强活性(图10a)但没有细胞毒性或mTOR抑制(图10b)的化学物质(式2的化合物MSL-7)的效果。MSL-7也诱导了TFEB的核转位，类似于MSL(图10c)。当向ob/ob小鼠施用时，MSL-7显著改善非空腹血糖水平，而对体重没有显著影响(图11a和11b)。IPGTT和ITT也分别证明了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的显著改善(图11c和11d)。
最后，我们研究了MSL或MSL-7是否具有全身毒性。CBC未被MSL或MSL-7改变(表1)。主要器官比如心脏、肾脏、肌肉、脾、肺和胰腺的活检显示组织组织学无显著变化，指示对这些器官没有显著毒性(图14)。
实施例7.通过本发明的自噬增强剂改善肥胖小鼠的代谢状况。
接着我们研究了使用由于饮食导致的肥胖小鼠(其比ob/ob小鼠更具生理适应性)，通过MSL的自噬增强是否能改善肥胖小鼠的体内代谢状况。施用MSL 8周降低了高脂饮食(HFD)喂养的小鼠的非空腹血糖水平和葡萄糖耐受性。然而，除了IPGTT期间的某一点外，大多数比较都没有达到统计学显著性。通过体内施用MSL未能显著改善HFD喂养的小鼠代谢状况的原因之一可能是MSL的微粒体稳定性差(与人肝微粒体孵育30分钟后剩余不到10％)。因此，我们对MSL进行了化学改性，以制备更有效和更具成药性的化合物。在几种衍生物中，我们选择了一种具有改善的微粒体稳定性(30分钟后剩余90.5％)的化学物质(MSL-7)。我们确认，MSL-7以剂量依赖性方式诱导自噬溶酶体的形成、TFEB核转位和钙调磷酸酶激活(图12a和图10c)。当向ob/ob小鼠施用时，MSL-7显著降低非空腹血糖水平，而不改变体重(图12d，12c)。腹腔内葡萄糖耐受性试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)分别显示葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性显著提高(图12d-g)，以及曲线下面积减小(AUC)。这些结果指示本公开的改良自噬增强剂不仅可以改善ob/ob小鼠中的代谢状况，还可以改善HFD喂养的小鼠中的代谢状况。研究发现，MSL-7不影响消瘦小鼠或饲料喂养小鼠的血糖状况。
实施例8.MSL-7对hIAPP+小鼠的β-细胞功能和代谢状况的增强作用
人与鼠的糖尿病的彼此不同之处在于，>90％的人胰岛淀粉样蛋白累积，而在小鼠糖尿病中没有。这是由于胰岛相关多肽(IAPP)的氨基酸序列不同(Westermark等人(2011)Islet amyloid polypeptide，islet amyloid，and diabetes mellitus.PhysiolRev.Jul；91(3):795-826)。在本发明中，分析了本发明的自噬增强剂对自噬调节的毒性人型IAPP(hIAPP)低聚物积累的影响。结果，在用淀粉样蛋白prepro-hIAPP转染的INS-1胰岛素瘤细胞中，MSL和MSL-7都降低了pro-hIPP二聚体的积累，并且发现MSL-7的作用更突出(图13a)。MSL-7减少了pro-hIAPP的积累，如由pro-hIAPP二聚体的恢复和pro-hIAPP三聚体的出现，通过巴佛洛霉素处理后消失可以证明(图13b)。这指示MSL-7通过增强自噬活性减少了pro-hIAPP二聚体的积累。当研究由于hIAPP低聚物积累引起的细胞凋亡时(Kim等人，2014，同上)，MSL-7处理显著降低了在3-MA存在下用prepro-hIAPP转染的细胞的凋亡(图13c)，指示这是由MSL-7消除hIAPP低聚物引起的。MSL-7施用也显著降低了在胰腺β细胞中表达hIAPP的转基因小鼠(hIAPP+小鼠)的非空腹血糖水平，这是由HFD诱导的糖尿病(图13d)。通过8周的MSL-7处理，指示HFD后β细胞功能失调的葡萄糖耐受不良和胰岛素生成指数也显著改善(图13e，13f)。这证明了本发明的自噬增强剂在体内对人型糖尿病的作用。在本公开中，使用A11抗体进行免疫染色以检测hIAPP低聚物。通过8周施用MSL-7，HFD促进的hIAPP+小鼠中的hIAPP低聚物积累显著减少。这指示MSL-7提高了HIAP低聚物的清除率。在HFD喂养的hIAPP+小鼠中，发现EE-1-氟-2,5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(FSB)染色的胰岛淀粉样蛋白通过8周的MSL-7施用同样降低(图13h)。这证明MSL-7对胰岛淀粉样蛋白积累的影响。
最后，在本公开中，测试了本发明的增强剂的毒性。8周的MSL或MSL-7处理改善了代谢状况，并且降低了肝酶水平(下表1)。除此之外，施用不会影响ob/ob小鼠的血象或血液化学。在主要器官活检中，没有发现副作用。相反，脂肪肝得到了改善(图14)。这还指示，本公开的MSL或MSL-7不具有任何显著毒性，并支持其潜在的成药性。
[表1]
表1显示了在体内施用本发明的自噬增强剂8周后分析的血象和血液化学。发现，肝酶和TG水平降低，并且代谢状况改善。除此之外，未发现任何不良变化。与MSL相比，施用MSL-7的小鼠的血清TG水平和LDH水平显著降低(WBC，白细胞；NEU，中性粒细胞；LYM，淋巴细胞；MONO，单核细胞；EOS，嗜酸性粒细胞；BASO，嗜碱性粒细胞；RBC，红细胞；HGB，血红蛋白；HCT，红细胞压积；PLT，血小板；TG，甘油三酯；TCHO，总胆固醇；ALP，碱性磷酸酯；ALB，白蛋白；DBIL，直接胆红素；GGT，g-谷氨酰转移酶；LDH，乳酸脱氢酶；CRE，肌酐；CPK，肌酸磷酸激酶；CA，Ca2+；BUN，血尿素氮)。
总之，引起2型糖尿病的两个主要因素是胰岛素抗性和β细胞功能障碍。然而，在分子和细胞水平上，还没有确定构成上述因素的分子机制。脂质过多积累、由于趋化因子和细胞因子引起的低度炎症、NF-kB和JNK活化是重要的分子机制(Vandanmagsar，2011，同上)。细胞器和应激水平下的ER和线粒体功能障碍也被称为糖尿病发展的关键因素(Ozcan等人(2004年)Endoplasmic reticulum stress links obesity，insulin action，and type 2Diabetes.Science 306，457-461)，并且这可能会在上级或下级上影响上述机制。在脂质过多状况下和衰老期间自噬活性显著降低。因此，自噬的丧失可能导致ER和线粒体的功能障碍。而且，自噬的丧失可能是与年龄相关的代谢综合征和糖尿病的基础。相反，诱导自噬活性可为治疗代谢疾病或糖尿病提供一种新的途径。这与先前观点的不同之处在于，自噬是构成糖尿病发病机制的基础缺陷，而不是由与潜在缺陷引起的异常分子或细胞过程。以前，自噬与疾病发展的关系主要在癌症、神经退行性疾病和传染病方面研究，而其在代谢疾病中的作用尚未报道。本公开指示可以通过调节自噬来治疗代谢疾病。
虽然已经参考附图描述了一个或多个示例性实施方式，但本领域普通技术人员应理解，可以在不背离由下述权利要求所限定的发明构思的精神和范围的情况下，对其中的形式和细节作出各种改变。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文中，以公开和描述引用出版物的方法和/或材料。

Claims (11)

1.一种用于治疗或预防代谢紊乱的药物组合物，所述组合物包括下述式1或式2的化合物，或其药学上可接受的盐：
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述代谢紊乱包括胰岛素抗性、2型糖尿病、高脂血症、肥胖或炎症中的一种或多种症状。
3.一种提高体外自噬活性的方法，所述方法包括用式1或式2化合物，或其盐处理细胞的步骤，其中所述处理使得TFEB(转录因子EB)从细胞质转运到细胞核，而不抑制mTOR(雷帕霉素的机制性靶标)的活性，
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
4.一种提高体外自噬活性的方法，所述方法包括用式1或式2的化合物，或其盐处理细胞的步骤，其中，通过所述处理提高的自噬活性使得减少或去除了所述细胞中的脂肪：
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
5.一种用于治疗或预防肥胖的药物组合物，所述药物组合物包括下述式1或式2的化合物，或其药学上可接受的盐：
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
6.一种用于治疗或预防代谢紊乱的下述式1或式2的化合物：
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
7.一种用于治疗或预防肥胖的下述式1或式2的化合物：
[式1]
或
[式2]
其中，式2中，R为F、Cl或Br。
8.一种式2的化合物：
[式2]
其中，R为F、Cl或Br。
9.一种用于治疗或预防代谢紊乱的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求8所述的化合物。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述代谢紊乱包括胰岛素抗性、2型糖尿病、高脂血症、肥胖或炎症中的一种或多种症状。
11.一种筛选用于治疗或预防代谢紊乱的试剂的方法，所述方法包括：
提供真核细胞；
使所述细胞经受代谢应激；
用测试化合物处理所述细胞；
测定所述细胞中钙调磷酸酶、TFEB(转录因子EB)和自噬的活性；和
当所述测定步骤中，与未经所述测试化合物处理的对照细胞相比，所述细胞中钙调磷酸酶、TFEB和自噬的活性提高时，选择所述化合物作为用于治疗或预防代谢紊乱的潜在治疗剂。
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