CN109777744A - 一种快速筛选抑制赤霉病菌don毒素合成的化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法，属于真菌毒素防控技术领域。所述方法包括：(1)构建Tri1‑GFP::ΔTri1菌株；(2)将Tri1‑GFP::ΔTri1菌株接种于TBI培养基，培养，加入待筛选的化合物，继续培养，然后观察绿色荧光蛋白在菌体内的积累情况，与未添加待筛选化合物的对照相比，根据荧光强度强弱来判断该化合物对赤霉病菌合成DON的抑制效果。本发明利用病菌中DON合成量与DON合成关键限速酶Tri1蛋白量呈显著的正相关的特点，选择测定Tri1蛋白量用于指示DON毒素的合成量，可快速的检测待测定化合物对赤霉病菌DON产毒的抑制效果，大大节约测定成本。

Description

一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法

技术领域

本发明涉及真菌毒素防控技术领域，尤其涉及一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法。

背景技术

小麦是我国重要的粮食作物，种植面积约占我国粮食种植总面积的25％。随着气候变化和耕作制度的改变，由禾谷镰刀菌复合种(Fusarium graminearum complex)引起的小麦赤霉病已经成为小麦上重要的真菌病害，严重影响小麦产量。此外，赤霉病菌在侵染小麦上产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，又称呕吐毒素)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)等多种真菌毒素，其中，DON对人畜具有很强的毒性，人畜误食DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐等急性中毒症状，严重时损害免疫系统造成死亡。DON毒素已经被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为“最危险的自然发生食品污染物”之一。世界上大多数国家对食品中DON毒素含量都有了明确的限量标准。我国粮食中DON毒素的限量标准是1mg/kg。近几年，由于赤霉病流行成灾，我国多地小麦样品中DON的含量出现超标问题，解决镰刀菌毒素污染已经成为保障食品安全的重要任务。

为防治病害，越来越多的杀菌剂被投入使用，例如：多菌灵、甲基硫菌灵、戊唑醇、氰烯菌酯、叶菌唑等，又如申请公布号为CN 104068025 A的专利文献公开了一种杀菌组合物，其活性成分为氰烯菌酯和丙硫菌唑，该药物组合物具有增效作用，能够显著抑制赤霉病菌毒素的形成。但是大量杀菌剂长时间使用容易导致病菌产生抗药性，此外，杀菌剂使用不当导致真菌抗逆性被激活，促进毒素相关基因表达，导致毒素生成量大幅度提高，而且为食品安全埋下隐患。因此，研发和应用有效的防治病害又抑制毒素的药剂是防治赤霉病菌的主要措施之一。

目前评价杀菌剂抑制病菌DON毒素形成的效果主要依靠液相色谱-串联质谱法(LCMS/MS)和酶联免疫吸附(ELISA)方法来测定，LCMS/MS定量检测DON需等待病菌产生毒素后才能进行DON测定，费时并且DON毒素提取过程比较繁琐；DON的检测费用比较昂贵，目前市场上一个样品检测费用约1500元，不利于大批量筛选抑制DON形成的化合物。因此，研发高效、便宜的DON毒素测定方法有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以快速筛选能够抑制赤霉病菌合成DON的化合物的方法，节约测定成本、缩短测定时间，可以用于抑制呕吐毒素合成化合物的大量筛选工作。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

Tri1(Cytochrome P450 monooxygenase,DON合成倒数第二步的催化酶)蛋白作为标志物在制备检测赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒中的应用。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，又称呕吐毒素)属于单端孢霉烯族类毒素，由乙酰CoA经过一系列酶催化反应形成。目前已经明确16个TRI(Trichothecene biosynthesis)基因编码的蛋白参与DON毒素的生物合成，Tri4(DON合成的第二步催化酶)和Tri1作为合成DON合成的关键酶，在毒素合成诱导条件(TBI)下，Tri1和Tri4会聚集在“产毒体”上。

本发明研究表明，Tri1蛋白量和DON的合成呈正相关，因此，通过观察Tri1在毒素体的积累情况，可以判断DON的合成量。所述的Tri1蛋白包括512个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了Tri1蛋白作为标志物在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化合物中的应用。

本发明选择编码Tri1蛋白的基因(NCBI登录号为：XM_011317365.1)作为靶基因构建了菌株Tri1-GFP::ΔTri1，即将GFP(绿色荧光蛋白)标记的Tri1融合基因转入Tri1基因敲除突变体(ΔTri1)中，进而通过观察荧光蛋白GFP在毒素体上的积累量，确定该菌株毒素合成量；在此基础上，利用该菌株(Tri1-GFP::ΔTri1)筛选抑制或刺激DON合成的化合物。

因此，本发明提供了Tri1-GFP::ΔTri1菌株在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成DON的化合物中的应用，所述Tri1-GFP::ΔTri1菌株的构建方法，包括：以禾谷镰刀菌作为亲本菌株，利用同源重组技术将基因组中的Tri1基因替换成Tri1-GFP融合基因，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株。

本发明还提供了一种快速筛选抑制赤霉病菌合成DON的化合物的方法，包括以下步骤：

(1)构建Tri1-GFP::ΔTri1菌株：以禾谷镰刀菌测序菌株PH-1作为亲本菌株，利用同源重组技术敲除Tri1基因，获得突变体ΔTri1；再利用PCR和原生质转化技术将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Tri1-GFP融合基因转入ΔTri1突变体的基因组中，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株；

(2)将Tri1-GFP::ΔTri1菌株接种于TBI培养基，培养24-30h后，加入待筛选的化合物，继续培养24-36h，然后观察绿色荧光蛋白在菌体内的积累情况，与未添加待筛选化合物的对照相比，根据荧光强度强弱来判断该化合物对赤霉病菌合成DON的抑制效果。

将新鲜的Tri1-GFP::ΔTri1菌丝接种于含TBI(呕吐毒素合成诱导培养基)的三角瓶中，摇床上震荡培养，培养24-30小时后向三角瓶中加入待筛选的化合物，再继续培养24-36h，然后利用激光共聚焦显微镜观察Tri1-GFP在菌体内的积累情况，根据荧光强度强弱来判断化合物对毒素的抑制效果：Tri1-GFP荧光强度越弱，表明待测定化合物抑制呕吐毒素的作用越强；相反，Tri1-GFP荧光强度越强，表明待测定化合物抑制呕吐毒素的效果越差。

作为优选，步骤(2)中，培养的条件为：培养温度为28℃、转速为150-180rpm。

作为优选，通过ImageJ软件进行荧光强度定量。

本发明具备的有益效果：

本发明利用病菌中DON合成量与DON合成关键限速酶Tri1蛋白量呈显著的正相关的特点，选择测定Tri1蛋白量用于指示DON毒素的合成量。

本发明构建了Tri1-GFP::ΔTri1菌株，通过Tri1-GFP的荧光蛋白量可以准确判断菌体DON毒素合成量，并以此菌株为实验对象，可快速的检测待测定化合物对赤霉病菌DON产毒的抑制效果，每个样品测定成本仅需5元左右，大大节约测定成本、缩短测定时间，可以用于抑制呕吐毒素合成化合物的大量筛选工作。

附图说明

图1为氰烯菌酯对赤霉病菌DON合成的抑制效果，(A)Tri1-GFP::ΔTri1菌株在TBI中预培养24h后，加入1.0mg/L多菌灵或0.3mg/L的氰烯菌酯，这两种药剂分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，以DMSO作为溶剂对照，药剂处理24h后，荧光显微镜下观察Tri1-GFP的荧光量，Bar＝10μm；(B)利用ImageJ软件定量测定的荧光强度，并通过LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)；(C)将各处理样品培养7天后，利用LCMS/MS进行定量检测DON的含量，并利用LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)。

图2为氰烯菌酯和氟唑菌酰羟胺混剂对赤霉病菌DON的合成抑制效果，(A)Tri1-GFP::ΔTri1菌株在TBI中预培养24h后，加入氰烯菌酯和氟唑菌酰羟胺混剂(氰烯菌酯浓度为0.15mg/L，氟唑菌酰羟胺的浓度为0.01mg/L)，同时以溶剂DMSO作为对照，处理24h后，利用荧光显微镜观察菌体中Tri1-GFP的荧光情况，Bar＝10μm；(B)利用ImageJ软件定量测定的荧光强度，并通过LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)；(C)将各处理样品在TBI中继续培养7天后，利用LCMS/MS测定各样品中DON的含量，并通过LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)。

图3为低浓度戊唑醇刺激赤霉病菌DON的合成效果，(A)Tri1-GFP::ΔTri1菌株在TBI中预培养24h后，加入0.25mg/L的戊唑醇，同时以DMSO溶剂作为对照，药剂处理24h后，利用荧光显微镜观察菌体中Tri1-GFP的荧光情况，Bar＝10μm；(B)利用软件ImageJ定量分析(A)中各样品的荧光强度，并利用LSD方法进行差异显著性分析(P＝0.05)；(C)将(A)中样品在TBI中继续培养7天后，利用LCMS/MS方法测定每个处理样品中DON含量，并用LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、Tri1-GFP标记菌株的构建

Tri1-GFP::ΔTri1菌株构建流程如下：以禾谷镰刀菌菌株PH-1(已经进行全序列测序的菌株)作为亲本菌株，首先通过三轮PCR合成包含Tri1上游同源臂-潮霉素抗性基因-Tri1下游同源臂的基因片段，具体操作如下：

A)第一轮PCR：扩增同源臂，上游同源臂由正向引物

FGSG_00071-P1：TTGTGAGTAGGCCTCATA和反向引物

FGSG_00071-P2:

CAAAATAGGCATTGATGTGTTGACCTCCGACAGCGAAATGGTCTGTC扩增，下游同源臂由正向引物FGSG_00071-P3：

CTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGGTAGGAGGACGTCACAGTCTTG和反向引物FGSG_00071-P4:GCCTCAGTGACCGAGGTAG扩增，引物P2和P3设计时含有25-30bp左右与抗性基因同源的接头序列。引物

HPH-F:GGAGGTCAACACATCAATGCCTATT和

HPH-R:CTACTCTATTCCTTTGCCCT扩增抗性筛选基因HPH

(Hygromycin B)，切胶纯化回收上下游同源臂以及抗性基因片段；

B)第二轮PCR：融合上游同源臂-抗性基因-下游同源臂；

C)第三轮PCR：以第二轮PCR产物为模板，以引物P1和P4为引物，扩增包含Tri1上游同源臂-潮霉素抗性基因-Tri1下游同源臂的基因片段，PCR产物切胶回收后。

再利用同源重组的原理在PH-1菌株中敲除Tri1基因，获得突变体ΔTri1；

然后合成包含Tri1基因和GFP基因的基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质转化技术将Tri1-GFP融合基因转入到ΔTri1突变体中，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株。

2、氰烯菌酯对呕吐毒素合成的抑制作用

以多菌灵为对照药剂，测定氰烯菌酯对禾谷镰刀菌中呕吐毒素合成的抑制效果。

将新鲜的Tri1-GFP::ΔTri1菌丝接种于含100ml TBI(呕吐毒素合成诱导培养基)(见已发表文献:Menke,J.,Dong,Y.H.&Kistler,H.C.Fusarium graminearum Tri12pinfluences virulence to wheat and trichothecene accumulation.Molecular Plant–Microbe Interaction.2012,25:1408–1418)三角瓶中,将三角瓶摇床上震荡培养，培养温度为28℃、摇床转速为150rpm。

培养24小时后，在培养基中分别加入0.3mg/L的氰烯菌酯(Phenamacril)或1.0mg/L的多菌灵(Carbendazim)，药剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，药剂处理24h后，挑取少量的菌丝到载玻片上，在激光共聚焦下进行观察并拍照。

显微镜使用参数如下：物镜为EC Plan-Neofluar 40x/1.30Oil DIC M27，分色镜为MBS488，激发光波长为488nm，功率为50％；尺寸为X＝70.78μm,Y＝70.78μm；针孔为90μm；主要增益：590；数字增益:1.00；滤片为：493-557；分辨率：1024*1024，数字放大是2.0。每次试验选择的拍照参数保持一致，在此基础上，通过软件ImageJ将菌丝中Tri1-GFP荧光强度进行定量测定。

荧光越强，毒素产生越多。结果显示：与没有经过药剂处理的DMSO相比，1.0mg/L的多菌灵处理赤霉病菌24小时后，菌体内Tri1-GFP荧光强度明显强于对照，而0.3mg/L的氰烯菌酯(Phenamacril)处理病菌后，荧光明显减弱(图1A)；通过ImageJ软件进行荧光强度定量，图1B结果显示，多菌灵处理后菌体中Tri1-GFP荧光强度高于对照2倍，而0.3mg/L的氰烯菌酯处理的菌体中检测不到任何Tri1-GFP的荧光强度。

为了进一步验证GFP荧光的强弱与毒素的合成量的相关性，将上述样品继续培养7天后，利用LCMS/MS检测各处理样品的培养液中DON的量。

利用LCMS/MS检测了DON产量发现:1.0mg/L的多菌灵处理后样品中，DON的量是对照组的2倍；而0.3mg/L的氰烯菌酯处理的样品检测不到DON(图1C)，这也进一步氰烯菌酯说明能够有效抑制赤霉病菌中DON的合成。

实施例2

氰烯菌酯和氟唑菌酰羟胺混剂对呕吐菌毒素抑制效果

本实验测定氰烯菌酯与氟唑菌酰羟胺的复配剂对DON合成的抑制作用，复配药剂中氰烯菌酯浓度为0.15mg/L、氟唑菌酰羟胺的浓度为0.01mg/L。药剂处理时间、荧光观察时间、毒素检测时间与实施例1保持一致。

实验结果显示：氰烯菌酯与氟唑菌酰羟胺的复配剂处理赤霉病菌后，检测不到Tri1-GFP荧光信号(图2A，B)；与该结果一致，LCMS/MS也检测不到该混剂处理病菌中DON(图2C)，该结果表明，氰烯菌酯与氟唑菌酰羟胺复配剂非常有效抑制DON的生物合成。

氰烯菌酯和氟唑菌酰羟胺抑制赤霉病菌呕吐毒素合成机理如下：在禾谷镰刀菌产毒过程中，内质网发生重塑，形成“DON毒素体”，内质网重塑形成毒素体过程中需要FgMyoI这个马达蛋白提供动力。氰烯菌酯通过抑制FgMyoI的活性，使得病菌中不能形成毒素体，进而抑制DON的合成。氟唑菌酰羟胺能有效抑制菌体内ATP的合成，而“DON毒素体”形成过程中需要FgMyoI将生物能ATP转化成机械能，进而拉动内质网的重塑。因此，该药剂通过抑制菌体内ATP合成，使得内质网不能重塑形成“DON毒素体”，进而抑制DON合成。

实施例3

低浓度戊唑醇能够刺激呕吐毒素合成

本实验以单剂戊唑醇(Tebuconazole)为测试药剂，药剂浓度为0.25mg/L，具体实施方法与实施例1相同。

实验结果显示：相比较DMSO溶剂处理相比，0.25mg/L戊唑醇处理赤霉病菌后，菌体中Tri1-GFP荧光强度明显强于对照(图3A)，荧光定量结果也表明，0.25mg/L戊唑醇处理后，菌体中Tri1-GFP荧光强度是对照2.6倍(图3B)，LCMS/MS方法检测菌体的DON毒素产量发现，0.25mg/L戊唑醇处理后，菌体产生的DON量是对照的2倍(图3C)，表明，低浓度戊唑醇刺激赤霉病菌产生更多的呕吐毒素。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum PH-1)

<400> 1

Met Ala Leu Ile Thr Ser Leu Gln Asp Val Arg Leu Asp Met Leu Ala

1 5 10 15

Tyr Phe Val Ala Phe Leu Val Val Val Ser Val Val Arg Lys Lys Leu

20 25 30

Ala Pro Gln Pro Ser Ala Tyr Leu Leu Asn Pro Arg Arg Trp Tyr Glu

35 40 45

Phe Thr Asp Ala Arg Ala Val Ser Glu Val Leu His Thr Thr Arg Gln

50 55 60

Thr Leu Glu Glu Trp Phe His Lys His Pro Thr Thr Pro Val Arg Leu

65 70 75 80

Thr Thr Asp Phe Gly Glu Met Thr Phe Leu Pro Pro Thr Leu Ala Asp

85 90 95

Glu Ile Lys Ser Asp Lys Arg Leu Ser Phe Ile Lys Ala Ala Asn Asp

100 105 110

Ser Ala Phe His Thr Glu Ile Pro Gly Phe Glu Pro Phe Arg Glu Gly

115 120 125

Gly Arg Asn Glu Ala Ala Leu Ile Lys Glu Val Ile His Gly Gln Leu

130 135 140

Lys Lys Thr Leu Asn Lys Met Thr Phe Pro Leu Ala Gln Glu Thr Gln

145 150 155 160

Leu Ala Val Glu His Tyr Leu Gly Ala Asn Lys Glu Trp His Lys Ile

165 170 175

Arg Leu Arg Asp Ala Leu Leu Pro Leu Val Thr Arg Ile Ser Thr Arg

180 185 190

Ile Phe Leu Gly Glu Asp Leu Cys Gln Asn Asp Lys Trp Ile Ser Ile

195 200 205

Thr Ser Glu Tyr Ala Ala Asn Ser Leu Glu Val Ala Asn Arg Leu Arg

210 215 220

Val Trp Pro Lys Tyr Met Arg Tyr Val Val Ser Tyr Phe Ser Pro Gly

225 230 235 240

Cys Gly Ile Leu Arg Asn Gln Val Lys Asn Ala Arg Glu Leu Ile Thr

245 250 255

Pro Ile Val Glu Arg Arg Arg Ser Glu Glu Lys Gly Lys Glu Tyr Asn

260 265 270

Asp Ser Leu Gly Trp Phe Glu Lys Thr Ala Lys Gln Ala Tyr Asn Pro

275 280 285

Ala Ala Thr Gln Leu Phe Leu Ser Ala Val Ser Val His Thr Thr Thr

290 295 300

Asp Leu Ile Cys Gln Cys Leu Glu Asp Ile Ala Ala His Pro Glu Ile

305 310 315 320

Ile Lys Pro Leu Gln Glu Glu Ile Arg Arg Val Ile Ala Glu Glu Gly

325 330 335

Trp Asn Thr Lys Ala Met Tyr Lys Met Phe Leu Leu Asp Ser Val Phe

340 345 350

Lys Glu Thr Gln Arg Leu Lys Pro Ile Gln Val Ala Ser Met Val Arg

355 360 365

Glu Ala Gln Ser Asp Ile Thr Leu Ser Asp Gly Thr Phe Ile Pro Lys

370 375 380

Gly His Gln Ile Ala Val Ser Cys His Asn Met Arg Asp Gly Arg Ile

385 390 395 400

Tyr Glu Asn Pro Glu Lys Trp Asp Gly Tyr Arg Phe Phe Arg Glu Arg

405 410 415

Gln Gln Ser Ala Arg Glu Asp Lys Val Gln Leu Ser Ser Thr Ser Val

420 425 430

Glu His Met Gly Phe Gly Tyr Gly Glu His Ala Cys Pro Gly Arg Phe

435 440 445

Phe Ala Ala Lys Gln Val Lys Ile Val Met Met Tyr Leu Leu Leu Asn

450 455 460

Tyr Glu Trp Lys Ile Pro Glu Gly Pro Glu Pro Gln Leu Met Ala Trp

465 470 475 480

Cys Thr Thr Trp Val Thr Asp Pro Asp Tyr Glu Val Leu Met Arg Arg

485 490 495

Lys Asp Lys Asp Asp Pro Cys Leu Arg Leu Glu Leu Val Gln Asp Asp

500 505 510

<210> 2

<211> 3977

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttctcgctc gtagtaacag atccggatta tcatgtgcag aaattgcagc tcgtgcagca 60

gaggattgcc atcatcgtac agcagcttcg ctataacagc acatagtcct tctcaaaggc 120

tgccagcatc ttctcccgga tgcttgacgt agatttccag ggaccagcac aaataaaaca 180

aacgacttga ttgatcgatc ggagagagga acgccgtctt tcttgtctaa tattgcagtc 240

acagtatttt aaacagtatt taccaaggtg gtaggtggta aacgaaaata actcgataaa 300

cccgagtaga catcatgcca acagttagtt ctcaaggtgt ctctactagt gcactgaacc 360

tcgttggcaa atcgtgccat ccaacctctt atgtcccaca taactacaca ataagatttg 420

aggccatttt tgtgagtagg cctcatagcg acgatcttgc cgtactggta cactgttgcg 480

aaattaatat ccaatgagaa accaagtcaa gtcggtctat gagtctgtgg ggtggatggc 540

ctgagagtca ggcctaccaa cattgaaaca ccaaagtcaa ttacagggcc tctgcagata 600

ccctatagag aggttggagg cagtaaataa atagatggaa tgttgaagaa aatatagatt 660

acggataata catgtatggt ctcgtagtat aattgatgag aatttaataa atatatttcc 720

ttgttaagaa tttaattatt ttgctgtcca agtctacttc atgacagctt ttgccattat 780

gactgcttac agtaatccag agcctttgcc ttactcggca gaaacttgtg cattgtttca 840

caaagctaga ccagtagtag ttgccgatag ttagaccttt acagtcctca agacaaacaa 900

acagacacca tttgtagttt caaggagtgg tcgatggtgc ccttttgtct ctatgaaggt 960

tacgtgtact ggtaaatttg aaaccacggc tgagtatcgt aatgtcaaag tcaaccgctg 1020

atgccaggac tgtgtggtga gtaagtgggg agctaaccta gcaggctgga agttacgaat 1080

ctagactagc atgtgaagat aacgatacca aagtcaattc tgtttggtta caagttttgg 1140

atcttgtgca agctggcctg atagttagta ccctaccaat caatatgaag atcaatgcaa 1200

caaagtcagt attattcggt aggtcgtttt gttcgttagt gggggttggc ctgaatctac 1260

caattgaggc tgatactgtt cagtgtggtt cgttttgtta gctggcctta tacttaggac 1320

cctaccgatg tggatctgca gaaaatagag ttggagacaa cactcaatga aacggtctaa 1380

ccgtgaggca agccatgtca cgggccctgt aggtatatgt tataaatgta ggataccctc 1440

tacaactctg aaaattatct caaacacaac tggtatctct tccaaggctt gacagaccat 1500

ttcgctgtca tggctctcat caccagtttg caggatgtcc ggctcgacat gctggcatat 1560

tttgttgcct ttctcgtcgt agtatccgtc gtacgaaaga agctggcccc gcaacccagc 1620

gcatacttgc tcaaccccag acgctggtac gagtttaccg atgctcgtgc agtctcagaa 1680

gtccttcaca ccacccgcca aaccctcgaa gaatggttcc acaagcaccc aacaacccct 1740

gtccgcctga caaccgattt cggtgaaatg acctttttgc ctcccactct ggccgatgaa 1800

atcaagagcg ataagcgcct cagcttcatc aaggcagcta acgattcggt atgtggaact 1860

tgttgaataa atgactggtc catatagcta aacaaccaat aggccttcca cactgaaatc 1920

cccggttttg agcctttccg cgagggcgga agaaatgagg cagcactgat caaggaggtt 1980

attcacggtc aattaaagaa aactctgagt aagccggcaa accccgtcca gattataaca 2040

tgccatgtcg atgctaattg ttttgttaag acaaaatgac ctttccattg gctcaagaaa 2100

cccagctggc tgttgaacac tacctcggtg ctaacaaggg taaggaccat cgcgacacgt 2160

tgttgacttt aagctgatcg tctatagaat ggcacaagat tcgactcaga gacgcactgc 2220

tacccctggt cactagaatc tcaacacgta tctttttggg tgaagatcta tgccaaaatg 2280

acaaatggat tagcatcact tcggaatacg ctgccaacag tctcgaggtc gcaaaccgcc 2340

tgcgcgtctg gcccaagtac atgcgttacg tcgtttcata cttctctcca ggatgcggaa 2400

ttctacgaaa ccaggtcaag aatgctcgcg aactaatcac tcccattgtt gaacgccgtc 2460

gatccgagga aaagggtaag gaatacaatg attctctggg ctggtttgag aagactgcca 2520

aacaagcgta caaccctgct gctacccaac tattcctttc tgctgtatct gtccacacca 2580

ccaccgatct catctgccaa tgtttggaag atattgccgc tcaccctgaa atcatcaagc 2640

ccctgcagga agagatcagg agagttattg ccgaagaagg gtggaacacg aaggctatgt 2700

acaagatgtt ccttctcgac agcgtattta aggaaaccca acgattgaaa cccattcaag 2760

ttggtaagtt ggacaattat cgcttttgta aagtcgcttg cttacctcaa atcagcttca 2820

atggtgcgag aagcgcagtc cgacatcaca ctctcagacg gtacatttat ccccaagggt 2880

catcaaattg ctgtctcctg tcacaacatg cgcgatggaa ggatctacga gaaccctgaa 2940

aagtgggatg gttaccgatt cttccgtgag agacaacaat ccgccagaga agacaaggtc 3000

cagctatctt cgaccagtgt tgaacacatg ggcttcggtt acggagaaca cgcctgccct 3060

ggtcgcttct ttgccgccaa gcaagtcaag attgtcatga tgtacctttt gctcaactac 3120

gagtggaaga ttcctgaagg tcccgagccg caactgatgg cctggtgcac cacttgggtt 3180

acggatccag actacgaagt gctaatgcgc agaaaggata aagatgaccc ttgtctgcga 3240

ttggaattgg tacaggatga ctgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 3300

tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 3360

agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 3420

ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 3480

accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 3540

aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 3600

tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 3660

gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 3720

ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 3780

gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 3840

tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 3900

agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 3960

acgagctgta caagtaa 3977

Claims (6)

1.Tri1蛋白作为标志物在制备检测赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒中的应用。

2.Tri1蛋白作为标志物在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化合物中的应用。

3.Tri1-GFP::ΔTri1菌株在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化合物中的应用，其特征在于，所述Tri1-GFP::ΔTri1菌株的构建方法，包括：以禾谷镰刀菌作为亲本菌株，利用同源重组技术将基因组中的Tri1基因替换成Tri1-GFP融合基因，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株。

4.一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建Tri1-GFP::ΔTri1菌株：以禾谷镰刀菌测序菌株PH-1作为亲本菌株，利用同源重组技术敲除Tri1基因，获得突变体ΔTri1；再利用PCR和原生质转化技术将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Tri1-GFP融合基因接入ΔTri1突变体的基因组中，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株；

(2)将Tri1-GFP::ΔTri1菌株接种于TBI培养基，培养24-30h后，加入待筛选的化合物，继续培养24-36h，然后观察绿色荧光蛋白在菌体内的积累情况，与未添加待筛选化合物的对照相比，根据荧光强度强弱来判断该化合物对赤霉病菌合成DON的抑制效果。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养的条件为：培养温度为28℃、转速为150-180rpm。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过ImageJ软件进行荧光强度定量。