CN109758607B

CN109758607B - 抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶

Info

Publication number: CN109758607B
Application number: CN201910175659.3A
Authority: CN
Inventors: 辛瑜
Original assignee: Ningxia Miaolang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningxia Miaolang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN109758607A

Abstract

本发明提供一种抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶：包括交联透明质酸凝胶以及天然黄素辅酶及其衍生物，包括核黄素、异咯嗪、7‑M‑8‑C、7‑B‑8‑M、7‑M‑8‑B、7‑C‑8‑E、7,8‑D。本发明的提供了一组利用天然黄素辅酶及其衍生物降低透明质酸酶活性，有效增强交联透明质酸凝胶维持时间与塑性效果的方法。利用该方法，在体外交联透明质酸酶解的实验中，透明质酸酶的催化效率被降低50％以上。具有较大的应用潜力，体现出较大的经济效益。

Description

抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶

技术领域

本发明涉及一种抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，属于材料领域。

背景技术

透明质酸为组织基质中具有限制水分及其它细胞外物质扩散作用的成分，透明质酸酶(hyaluronidase，HAase；EC 4.2.99.1)为一种能水解透明质酸的酶，可以特异性水解N-乙酰葡糖胺和D-葡萄糖醛酸之间的β-1,4-糖苷键，从而降解透明质酸分子。用于人体能暂时降低细胞间质的粘性，可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，为一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。在整形美容行业，透明质酸酶被用于消解微注射后结块的透明质酸凝胶。

整形美容行业，利用交联透明质酸凝胶注射填充后，会受到人体自身表达的透明质酸酶分子的攻击，逐渐降解塌缩。因此，为了提高凝胶的整体维持时间以及塑形效果，有必要考虑利用特异性的方法来抑制人体透明质酸酶的酶解效率。目前，提高透明质酸凝胶的维持时间，仅用提高化学交联度的模式，但是化学交联剂含量的提高，可能导致后续的不良反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，以解决上述问题。

本发明采用了如下技术方案：

一种抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，其特征在于：

包括交联透明质酸凝胶以及天然黄素辅酶及其衍生物，

所述天然黄素辅酶及其衍生物的结构式如下所示：

进一步，本发明的抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，还具有这样的特征：其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.2-0.6mmol/L。

进一步，本发明的抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，还具有这样的特征：其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.4-0.6mmol/L。

本发明还提供一种天然黄素辅酶及其衍生物在制备抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶中的应用，其特征在于，所述天然黄素辅酶及其衍生物的结构式如下：

进一步，本发明所提供的应用，还具有这样的特征：其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.2-0.6mmol/L。

进一步，本发明所提供的应用，还具有这样的特征：其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.4-0.6mmol/L。

发明的有益效果

本发明的提供了一组利用天然黄素辅酶及其衍生物降低透明质酸酶活性，有效增强交联透明质酸凝胶维持时间与塑性效果的方法。利用该方法，在体外交联透明质酸酶解的实验中，透明质酸酶的催化效率被降低50％以上。具有较大的应用潜力，体现出较大的经济效益。

附图说明

图1是FAD与透明质酸酶活性中心相互作用；

图2是FMN与透明质酸酶活性中心相互作用；

图3是Riboflavin与透明质酸酶活性中心相互作用；

图4是Isoalloxazine与透明质酸酶活性中心相互作用；

图5是7-M-8-C与透明质酸酶活性中心相互作用；

图6是7-B-8-M与透明质酸酶活性中心相互作用；

图7是7-M-8-B与透明质酸酶活性中心相互作用；

图8是7-C-8-E与透明质酸酶活性中心相互作用；

图9是7,8-D与透明质酸酶活性中心相互作用；

图10是不同浓度FAD对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图11是不同浓度FMN对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图12是不同浓度Riboflavin对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图13是不同浓度Isoalloxazine对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图14是不同浓度7-M-8-C对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图15是不同浓度7-B-8-M对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图16是不同浓度7-M-8-B对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图17是不同浓度7-C-8-E对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响；

图18是不同浓度7,8-D对人源性透明质酸酶降解透明质酸凝胶能力的影响。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。

实施例一：

天然黄素辅酶及其衍生物的名称分别是：包括核黄素：Riboflavin、异咯嗪：isoalloxazine、

7-methyl-8-chloro-10-(1′-D-ribityl)isoalloxazine(7-M-8-C)、

7-bromo-8-methyl-10-(1′-D-ribityl)isoalloxazine(7-B-8-M)、

7-methyl-8-bromo-10-(1′-D-ribityl)isoalloxazine(7-M-8-B)、

7-chloro-8-ethyl-10-(1′-D-ribityl)isoalloxazine(7-C-8-E)、

7,8-diethyl-10-(1′-D-ribityl)isoalloxazine(7,8-D)。

利用Discovery Studio 4.0软件将所述天然黄素辅酶与其衍生物与透明质酸酶进行模拟对接。人源透明质酸酶已通过结晶-X射线晶体衍射解析基本结构，PDB ID:2PE4。如图1至图9所示，这组分子能够与透明质酸酶催化中心形成稳定的相互作用，具有降低透明质酸酶催化效率的潜力。实施例二中将通过具体的实验来证这些化合物对透明质酸酶活性的影响。

实施例二：

利用天然黄素辅酶及其衍生物抑制人源性重组透明质酸酶活性

反应体系的建立：

0.5g交联透明质酸凝胶，透明质酸含量为28mg/g，加入2mL PBS缓冲液，pH 6.5-7.5，其中含有人源性重组透明质酸酶250U/mL；此外，添加一定量的天然黄素辅酶或其衍生物分子。整个反应体系在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。

(1)FAD最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓度FAD添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图10所示。

(2)FMN最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓度FMN添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图11所示。

(3)Riboflavin最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓Riboflavin添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图12所示。

(4)Isoalloxazine最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓Isoalloxazine添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图13所示。

(5)7-M-8-C最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓7-M-8-C添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图14所示。

(6)7-B-8-M最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓7-B-8-M添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图15所示。

(7)7-M-8-B最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓Isoalloxazine添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图16所示。

(8)7-C-8-E最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓7-C-8-E添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图17所示。

(9)7,8-D最佳添加量的确定

确定配体分子的最大添加量。在上述反应体系中，添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的FAD，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后去上清测定游离透明质酸含量。计算各种浓7,8-D添加后在不同时间点交联透明质酸凝胶的酶解效率结果如图18所示。

结果显示，天然黄素辅酶及其衍生物均能在一定程度上抑制人源性透明质酸酶对交联透明质酸凝胶的降解能力。对比未添加配体的空白反应体系，FAD,FMN,Riboflavin,7-M-8-C,7-B-8M,7-M-8-B,7-C-8-E等分子添加后在72小时内均能降低空白反应体系中约一半的酶解效率。配体分子的最佳添加添加浓度为0.4-0.6mM。

Claims

1.一种抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，其特征在于：

包括交联透明质酸凝胶以及天然黄素辅酶及其衍生物，

所述天然黄素辅酶及其衍生物的结构式如下所示：

其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.2-0.6mmol/L。

2.根据权利要求1所述的抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶，其特征在于：

其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.4-0.6mmol/L。

3.天然黄素辅酶及其衍生物在制备抵抗透明质酸酶水解的交联透明质酸凝胶中的应用，其特征在于，所述天然黄素辅酶及其衍生物的结构式如下：

其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.2-0.6mmol/L。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

其中，天然黄素辅酶及其衍生物的浓度为0.4-0.6mmol/L。