CN109758589B - 可活体调控隐花色素cry2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器及其制备方法，包括如下步骤：1)掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒的制备及表征；2)柔性上转换蓝光传感器的制备：(1)配置不同比例10:1～7:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒10mg/ml～100mg/ml，负压0.03MPa～0.05MPa抽真空30min～40min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物；(2)待液体成膜0.2mm～3mm后，80℃真空高温固化30min～60min；(3)待其冷却后压紧避免气泡产生。本发明传感器面积在25mm2～1cm2，在980nm近红外光激发下，可发射波长470nm的明亮蓝光，其发出的蓝光可使隐花色素CRY2蛋白构相变化，实现上转换颗粒在活体的安全高效光转换。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和材料技术领域，具体涉及一种可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器及其制备方法。
背景技术
上转换发光材料是一种吸收长波长光而发射出短波长光的一种材料，因其激发光波长较长(980nm)，具有良好的组织穿透性，因此被广泛运用于活体的疾病治疗、信号通路调控等。上转换材料在活体的应用方式主要包括局部注射及尾静脉注射两种方式，但这两种方式均有局限性。首先，上转换材料成分为稀土金属，其应用于活体的安全性需被谨慎考虑。通常是通过复杂的表面修饰方法，如柠檬酸表面改性、聚乙二醇包裹表面等方法来降低其生物毒性，而对于上转换材料的过度改造，会影响其光子产率，极大程度地削弱其发光效率；其次，上转换在体内通过长时间的血循环或体液循环，逐渐被代谢，常用的方法是多次注射，这种方法对上转换的量的需求量高，且对活体产生较大的代谢负担。隐花色素CRY2是一种接收蓝光而发生构相变化的蛋白，通常被用于光遗传工具。在活体中使用CRY2蛋白需要皮下植入蓝光光纤，因此，研发一种制备方法简单、价格低廉且对活体完全无毒的上转换光传感方法，使其能够在活体调控CRY2的变构，更方便应用于后续生化等研究。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，提出了一种具有发光效率高、生物安全性高优势的一种可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器及其制备方法。
本发明的技术方案如下：可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒的制备及表征；
2)柔性上转换蓝光传感器的制备。
所述步骤2)中柔性上转换蓝光传感器的制备的具体步骤：
(1)在玻璃薄板上预先铺设一层聚酯薄膜，配置不同比例10:1～7:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒10mg/ml～100mg/ml，负压0.03MPa～0.05MPa抽真空30min～40min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物；
(2)待液体成膜0.2mm～3mm后，80℃真空高温固化30min～60min；
(3)待其冷却后，在顶层铺设一层聚酯薄膜，压紧避免气泡产生。
还包括CRY2质粒导入活体并激发其构相变化的步骤，具体是CRY2蛋白接收蓝光发生构相变化后，与其锚定蛋白CIB1结合，利用荧光共定位的方法观察CRY2蛋白构相变化情况。
本发明的第二个目的是采用上述方法制备可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器，柔性上转换蓝光传感器面积在25mm2～1cm2，厚度0.2mm～3mm。
有益效果
1.本发明制备的柔性上转换蓝光传感器，面积在25mm2～1cm2，在980nm近红外光激发下，可发射波长470nm的明亮蓝光，可埋植于活体动物皮下组织，具有较高的蓝光转换效率；具有较低的生物毒性。其发出的蓝光可使隐花色素CRY2蛋白构相变化，实现上转换颗粒在活体的安全高效光转换。
2.制备的掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒直径1～2μm，980nm波长近红外光激发下发射波长为470nm。
3.制备的柔性上转换蓝光传感器面积在25mm2～1cm2，厚度0.2mm～3mm。
4.制备的柔性上转换蓝光传感器可埋植于活体裸鼠，并有较高的生物安全性和发光效率，可用于活体光转换。
5.经上述制备的传感器激发后，利用荧光共定位可观测到CRY2蛋白聚集到细胞核中，证明制备的柔性上转换蓝光传感器能够实现隐花色素CRY2蛋白变构。
6.本发明研制出一种可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器，将上转换微米棒包封进聚二甲基硅氧烷柔性基底中，避免了上转换与细胞的直接接触，在保证光子产率的同时，省略了一系列复杂的材料改造步；同时为了防止上转换颗粒的体内泄露，在外层包封了聚酯薄膜，使其具有更高的生物安全性。将隐花色素CRY2蛋白导入活体组织中，利用此传感器可以实现CRY2的蛋白变构。在生物技术及材料如光遗传学等领域具有较高的科研应用前景。
附图说明
图1是制备的柔性上转换蓝光传感器合成路线路及实物图。
图2是制备的掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒高倍透射电镜照片。
图3是制备的掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒的发光光谱。
图4是制备的柔性上转换蓝光传感器可实现隐花色素CRY2蛋白的细胞核聚集:
a为NLS-CIB1；
b为CRY2-mCherry。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施例1
柔性上转换蓝光传感器的制备
在玻璃薄板上预先铺设一层聚酯薄膜，配置10:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒10mg/ml，负压0.03MPa抽真空30min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物，待液体成膜0.2mm后，80℃真空高温固化30min，待其冷却后，在顶层铺设一层聚酯薄膜，避免气泡产生(图1)。
实施例2
柔性上转换蓝光传感器的制备
在玻璃薄板上预先铺设一层聚酯薄膜，配置比例9:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒10mg/ml，负压0.03MPa抽真空40min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物，待液体成膜1mm后，80℃真空高温固化40min，待其冷却后，在顶层铺设一层聚酯薄膜，避免气泡产生。
实施例3
柔性上转换蓝光传感器的制备
在玻璃薄板上预先铺设一层聚酯薄膜，配置比例7:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒100mg/ml，负压0.03MPa抽真空40min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物，待液体成膜3mm后，80℃真空高温固化60min，待其冷却后，在顶层铺设一层聚酯薄膜，避免气泡产生。
实施例4
柔性上转换蓝光传感器的制备
在玻璃薄板上预先铺设一层聚酯薄膜，配置比例7:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒100mg/ml，负压0.05MPa抽真空40min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物，待液体成膜3mm后，80℃真空高温固化60min，待其冷却后，在顶层铺设一层聚酯薄膜，避免气泡产生。
实施例5
掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒的制备
向100ml圆底烧瓶中依次加入1.25g氢氧化钠，8mL双蒸水，300rpm搅拌10min至溶液澄清透明。边搅拌边依次逐滴加入25mL无水乙醇和等体积油酸。300rpm室温下搅拌30min后，烧瓶内的溶液均一稳定，分别配置浓度为1M的硝酸钇六水合物(YCl3·6H2O)、硝酸镱六水合物(YbCl3·6H2O)及硝酸铥六水合物(TmCl3·6H2O)溶液，4℃保存。取1M的硝酸钇六水合物(YCl3·6H2O)650μl，1M的硝酸镱六水合物(YbCl3·6H2O)200μl，硝酸铥六水合物(TmCl3·6H2O)10μl混合均匀，逐滴缓慢加入圆底烧瓶中，室温下继续800rpm搅拌10min。最后加入2.5ml浓度2M的氟化铵溶液，800rpm搅拌30min后，将反应体系转移至高温反应釜中，180℃反应12h。反应完毕，自然冷却至室温后，将得到的白色沉淀用等体积乙醇超声悬浮，5000rpm离心10min，重复5次。将混合物转移至浓度为2M的盐酸溶液中超声5min，再次用双蒸水清洗5次。沉淀用10mL双蒸水超声重悬。得到的透明液体即为单一分散稳定的上转换荧光微米棒。(图2，图3)
实施例6
将柔性上转换蓝光传感器埋植于裸鼠皮下
(1)超净工作台内，将紫外光照射灭菌过夜的柔性上转换蓝光传感器剪出适当面积25mm2，去除其锐角；
(2)将雌性7周龄BALB/c nμde品系裸鼠按其重量给用10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，皮肤表面用碘伏消毒；
(3)根据实际传感器大小利用手术剪将皮肤剪开一道创口，清除皮下连接筋腱，用镊子夹持传感器植于皮肤与筋膜间隙，然后手术缝合；
(3)一周后可观察皮下传感器的光传感效果。
实施例7
CRY2质粒导入活体并激发其构相变化观察
将表达CRY2-mCherry融合蛋白及其细胞膜锚定蛋白CAAX-CIB1质粒各20μg与200μl转染试剂聚醚酰亚胺室温混合20min，用1ml一次性注射器打入传感器覆盖下的小鼠组织中，48h后，利用980nm激光机照射传感器(每2min照射2s)持续照射4h，组织切片观察蛋白定位。
实施例8
CRY2质粒导入活体并激发其构相变化观察
将表达CRY2-mCherry融合蛋白及其线粒体锚定蛋白Tom20-CIB1质粒各20μg与200μl转染试剂聚醚酰亚胺室温混合20min，用1ml一次性注射器打入传感器覆盖下的小鼠组织中，48h后，利用980nm激光机照射传感器(每2min照射2s)持续照射4h，组织切片观察蛋白定位。
实施例9
CRY2质粒导入活体并激发其构相变化观察
将表达CRY2-mCherry融合蛋白及其细胞核锚定蛋白NLS-CIB1质粒各20μg与200μl转染试剂聚醚酰亚胺室温混合20min，用1ml一次性注射器打入传感器覆盖下的小鼠组织中，48h后，利用980nm激光机照射传感器(每2min照射2s)持续照射4h，组织切片观察蛋白定位(图4)。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒的制备及表征；
2)柔性上转换蓝光传感器的制备；
所述步骤2)中柔性上转换蓝光传感器的制备的具体步骤：
(1)在玻璃薄板上预先铺设一层聚酯薄膜，配置不同比例10:1～7:1的聚二甲基硅氧烷前体，并混入掺杂稀土铥元素的蓝光发射上转换微米棒10mg/ml～100mg/ml，负压0.03MPa～0.05MPa抽真空30min～40min去气泡，在聚酯薄膜上均匀旋涂该混合物；
(2)待液体成膜0.2mm～3mm后，80℃真空高温固化30min～60min；
(3)待其冷却后，在顶层铺设一层聚酯薄膜，压紧避免气泡产生。
2.采用权利要求1所述的方法制备可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器，其特征在于，柔性上转换蓝光传感器面积在25mm2～1cm2，厚度0.2mm～3mm。
3.根据权利要求1所述的可活体调控隐花色素CRY2蛋白变构的柔性上转换蓝光传感器的制备方法，其特征在于，还包括CRY2质粒导入活体并激发其构相变化的步骤，具体是CRY2蛋白接收蓝光发生构相变化后，与其锚定蛋白CIB1结合，利用荧光共定位的方法观察CRY2蛋白构相变化情况。
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