CN109745567B - 一种dna固定纳米水凝胶微球及其与核酸适配体复合物的制备和应用 - Google Patents
一种dna固定纳米水凝胶微球及其与核酸适配体复合物的制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学及生化药物技术领域,具体涉及一种DNA固定纳米水凝胶微球及其与核酸适配体复合物的制备方法和其作为肿瘤靶向制剂的应用。本发明制备方法简单,只需要在合成核酸适配体时在其一端合成一段单链DNA作为连接臂,此时DNA连接臂的序列与纳米水凝胶微球的纳米材料表面的DNA序列可以互补配对。在水溶液中共同孵育即可将一种或多种核酸适配一次性的连接在纳米材料的表面,从而得到具有特异性靶向功能的药物传递载体。本发明通过碱基互补配对的方式可以将一种或多种核酸适配体同时一次性的连接在药物传递载体的表面,碱基互补配对可以在水溶液中进行,反应条件温和容易控制,制备工艺十分简单。
Description
技术领域
本发明属于化学及生化药物技术领域,具体涉及一种DNA固定纳米水凝胶微球及其与核酸适配体复合物的制备方法和其作为肿瘤靶向制剂的应用。
背景技术
癌症是当今严重危害人类健康的重大疾病之一,并且已被列为人类面临的“第二号杀手”(仅次于心血管病)。目前,临床上癌症治疗手段主要包括外科手术治疗、放疗和化疗,但是除早期癌症进行外科手术治疗可以取得良好效果以外,对于中晚期阶段的癌症疗效都不能令人满意,并且使用小分子化疗药物是临床上应对中晚期患者最常规的方法。众所周知,小分子化疗药物靶向性较差,具有良好靶向性的小分子化疗药物又很少,导致小分子化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时往往也会将大量正常细胞杀死,产生严重的毒副作用。因此,开发一种安全、高效、肿瘤靶向、以及多功能的药物递送系统已成为肿瘤治疗领域中最为迫切且具有挑战性的课题之一。
核酸适配体(Aptamer)为一段DNA、RNA、XNA(核酸类似物)序列。通常是利用体外筛选技术或指数富集的配体系统进化(SELEX)技术,从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合,因此被广泛应用于生物传感和靶向药物传递领域。Ferreira课题组于2009年筛选到了一组针对MUC1蛋白的核酸适配体。由于MUC1蛋白在恶性肿瘤细胞表面高度异常表达,而在正常细胞表面则表达量相对极少,因此MUC1蛋白可作为靶点和肿瘤标志物,用于肿瘤靶向治疗。
在肿瘤治疗领域,为了进一步提高药物传递载体的肿瘤靶向性,将核酸适配体连接在药物传递载体的表面赋予其主动靶向功能成为常用的策略。然而,将核酸适配体连接在药物传递载体材料或其他材料表面的方式并不多。具体的连接方法有以下几种:1)在核酸适配体的5’端进行巯基化修饰,由于金属金能够与巯基形成化学键(Au-S)从而将其固定在金基底表面;2)利用生物素-亲和素法将生物素修饰的核酸适配体特异性的连接在亲和素修饰的材料表面;3)利用正负电荷吸引的作用将带负电荷的核酸适配体吸附在阳离子型载体表面;4)利用氨基修饰的核酸适配体与材料表面的羧基进行酰胺化反应的方法,将其共价连接在载体材料的表面。上述核酸适配体连接方法中前两种方法,复杂且昂贵,应用有一定局限性。第三种方法仅能在部分阳离子型的载体上使用,且结合不够稳定。第四种方法是目前较为常用的方法,但是该方法仍然存在较大的缺陷,例如在制剂材料表面进行酰胺化有机反应,后处理提纯繁琐复杂等。
针对上述不足,我们开发了一种将核酸适配体连接在药物载体材料表面,制备肿瘤靶向制剂的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA固定纳米水凝胶微球。
本发明的第二个目的是提供DNA固定纳米水凝胶微球与核酸适配体的复合物。
本发明的第三个目的是提供上述DNA固定纳米水凝胶微球、DNA固定纳米水凝胶微球与核酸适配体的复合物的制备方法和应用。
本发明制备方法简单,只需要在合成核酸适配体时在其一端合成一段单链DNA作为连接臂,此时DNA连接臂的序列与纳米水凝胶微球的纳米材料表面的DNA序列可以互补配对。在水溶液中共同孵育即可将一种或多种核酸适配一次性的连接在纳米材料的表面,从而得到具有特异性靶向功能的药物传递载体。
本发明是通过以下技术方案实现上述目的:
将Acrydite-DNA与制备纳米材料的单体一起加入到反应液中,在单体聚合形成纳米材料的过程中Acrydite-DNA随单体一起共聚在纳米材料的内部和表面,得到单链DNA共价连接的纳米材料。然后将小分子化疗药物与单链DNA共价修饰的纳米材料在磷酸盐缓冲液中共同孵育,之后通过离心得到单链DNA共价修饰的载药纳米水凝胶。最后,向单链DNA共价修饰的载药纳米水凝胶溶液中同时一种或多种核酸适配共同孵育,即可得到连接有一种或多种核酸适配体的肿瘤靶向制剂。
本发明所述的DNA固定纳米水凝胶微球是核酸适配体与DNA固定载药纳米水凝胶微球的复合物。其中DNA固定纳米水凝胶微球是通过蒸馏沉淀聚合法制得。
本发明的DNA固定纳米水凝胶微球通过如下方法制备:
(1)将水溶性聚合单体、丙烯类或甲基丙烯类交联剂、自由基聚合的引发剂、5’末端N-(6-羟基己基)甲基丙烯酰胺单体修饰的单链DNA(Acrydite-DNA)加入到反应液中,搅拌完全溶解。在适当的温度下,反应一段时间即可获得单链DNA共价修饰的纳米材料;
(2)反应结束后,高速离心、弃上清,对离心后的下层固体进行洗涤及冷冻干燥;
(3)将冻干纳米材料加入到一定浓度的药物溶液中,室温下搅拌24h。之后将该混合溶液进行高速离心,即可得到单链DNA固定纳米水凝胶微球,之后再次进行冷冻干燥。
步骤(1)中所述的水溶性聚合单体为:甲基丙烯酸(MAA)、N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、N,N’-双(甲基丙烯酰)胱氨酸(NDMCC)、甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种;
步骤(1)中所述的水溶性聚合单体的浓度为:1~200mg/mL,优选浓度为:2~100mg/mL;
步骤(1)中所述的丙烯类或甲基丙烯类交联剂为:N,N’-双(甲基丙烯酰)胱氨酸二甲酯、N,N’-双(丙烯酰)胱氨、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种;
步骤(1)中所述的交联剂的浓度为:0.1~40mg/mL,优选浓度为:0.5~20mg/mL;
步骤(1)中所述的自由基聚合的引发剂为:偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸);
步骤(1)中引发剂浓度为:0.01~2mg/mL,优选浓度为:0.05~1mg/mL;
步骤(1)中所述Acrydite-DNA的具体结构为:
步骤(1)中所述Acrydite-DNA中其中DNA为10~80碱基长的任意序列的单链DNA。
步骤(1)中所述Acrydite-DNA的具体用量为:0.1~50OD/mL,优选用量为:0.5~30OD/mL;
步骤(1)中所述反应溶剂为:去离子水、乙醇、乙腈、甲醇、环己烷或其混合溶液;
步骤(1)中所述反应温度为:25~90℃,优选反应温度为:50~90℃;
步骤(1)中所述反应时间为:10~90min,优选反应时间:15~75min;
步骤(1)中所述的药物为:抗肿瘤药物,如阿霉素、紫杉醇、顺铂。
步骤(2)中所述的高速离心其转速在6000~12000r/min,优选转速为:7000~10000r/min;
步骤(2)中所述的对离心后的下层固体进行洗涤,其洗涤溶液为:去离子水、乙腈、乙醇或丙酮。
步骤(3)中所述的盐酸阿霉素浓度为0.2~1.0mg/mL,优选浓度为:0.4~0.8mg/mL。
DNA固定纳米水凝胶微球制备如下:
(A)将水溶性聚合单体加入到反应溶剂中,搅拌完全溶解;
(B)将丙烯类、甲基丙烯类交联剂加入到反应溶剂中,搅拌完全溶解;
(C)将5’末端N-(6-羟基己基)甲基丙烯酰胺单体修饰的单链DNA(Acrydite-DNA)加入到反应溶剂中,搅拌完全溶解;
(D)将自由基聚合的引发剂加入到上述反应溶液中,搅拌溶解;
(E)在合适的温度条件下进行聚合反应;
(F)反应结束后,高速离心、弃上清;
(G)对离心后的下层固体进行洗涤、冻干;
(H)将冻干纳米材料加入到一定浓度的盐酸阿霉素溶液中,室温下搅拌12~48h。之后将该溶液进行高速离心,转移上清,洗涤下层载药纳米材料,之后进行冷冻干燥。
DNA固定纳米水凝胶微球与核酸适配体的复合物通过如下方法制备:
a.取核酸适配体适量用缓冲溶液溶解,在室温下孵育20~90分钟。
b.将载药的纳米水凝胶,加入到a中的溶液中,10~30℃孵育20~90分钟,得到核酸适配体介导的具有肿瘤靶向功能的纳米制剂。
步骤a中所述核酸适配体为:MUC1 S2.2、A10PMSM、AS1411、Sgc8c、CD40;
步骤a中所述核酸适配体连接臂DNA序列与前述Acrydite-DNA的序列完全互补,通过分子杂交方式链接;
步骤a中所述的核酸酸适配体具体用量为0.1~20OD/mL,优选用量为:0.2~10OD/mL;
步骤b中所述肿瘤靶向纳米制剂可以用于治疗:乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、结肠腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌。
本发明在制备过程中,首先将Acrydite-DNA与聚合单体及交联剂混合在一起,通过自由基聚合的方式将单链DNA接枝在高分子纳米材料的内部及表面。然后加入含有单链DNA连接臂的核酸适配体,该核酸适配体连接臂的DNA序列与微球表面的单链DNA通过碱基互补配对的方式键合,从而将核酸适配体连接在纳米材料的表面。通过该方法可以得到具有肿瘤靶向功能的药物传递载体。
本发明提供了一种将核酸适配体共价连接在纳米材料表面制备肿瘤靶向制剂的新方法,与现有技术相比,具有如下优点:
1.通过Acrydite-DNA与反应单体共聚合的方式制备DNA共价修饰的纳米材料,该方法十分简单,Acrydite-DNA可以通过DNA固相自动合成仪批量生产,重现性好不存在批次差异,使用原料廉价易得,接枝在材料表面的DNA可以长期稳定存在,对不同溶剂、不同温度耐受性好。
2.通过碱基互补配对的方式可以将一种或多种核酸适配体同时一次性的连接在药物传递载体的表面,碱基互补配对可以在水溶液中进行,反应条件温和容易控制,制备工艺十分简单。
附图说明
图1为实施例1中Acrydite-DNA的质谱结果图;
图2为实施例1中PMAA纳米水凝胶的粒径分布图;
图3为实施例1中PMAA纳米水凝胶的扫描电镜图;
图4为实施例2中PMAA纳米水凝胶降解性能试验结果图;
图5为实施例3中PMAA纳米水凝胶表面连接核酸适配体后荧光检测结果图;
图6为实施例4中载药纳米微球在PBS pH 7.4的条件下释放行为曲线图;
图7为实施例4中载药纳米微球在醋酸-醋酸钠pH 5.0的条件下释放行为曲线图;
图8为实施例7激光共聚焦显微镜检测MUC1-Dox-PMAA对肿瘤细胞的靶向选择性;
图9为实施例7激光共聚焦显微镜检测MUC1-Dox-PMAA对肿瘤细胞的靶向选择性的荧光定量结果。
具体实施方式
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种将核酸适配体共价连接在纳米材料表面制备肿瘤靶向制剂的新方法及应用进行详细描述。
实施例1
(1)Acrydite-DNA的合成
称取6-氨基-1-己醇(1.0g,8.1mmol)与50mL圆底烧瓶中,然后加入10mL无水CH2Cl2将6-氨基-1-己醇溶解,量取无水三乙胺(2.4mL,17mmol),滴加入反应液中,将圆底烧瓶冰浴15min,用注射器缓慢滴加甲基丙烯酰氯(2.5mL,25mmol),反应4小时,反应结束后分别使用饱和NaHCO3与饱和NaCl萃取各萃取三次。取下层有机相进行旋蒸除去溶剂,然后加入10mL无水乙醇将样品溶解,再加入新配制NaOH溶液(4mL 15%,15mmol),继续反应2小时。反应结束后,旋蒸除去溶剂加入25mL CH2Cl2溶液溶解,分别用8mL的饱和NaHCO3与饱和NaCl萃取三次,之后旋蒸除去溶剂得:N-(6-羟基己基)甲基丙烯酰胺1.62g,产率为89%。
称取N-(6-羟基己基)甲基丙烯酰胺(100mg,0.54mmol)于25mL的圆底烧瓶中,用5mL无水CH2Cl2溶解,通氮气保护,将圆底烧瓶冰浴15min。分别使用微量注射器缓慢滴加(264μL 0.2mmol)无水DIPEA与(183μL,0.65mmol)氯代亚磷酰胺于反应液中,冰水浴条件下继续反应4小时。反应结束后用加入25mL CH2Cl2于反应液中。分别用8mL的饱和NaHCO3、饱和NaCl萃取三次,有机相旋蒸除去溶剂,得无色油状液体。然后将其转移至DNA固相自动合成仪中,即可得到目标产品:Acrydite-DNA,其序列为5’-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA-3’其质谱结果见图1。
(2)DNA固定还原敏感性PMAA纳米水凝胶(DNA-PMAA)微球的制备
吸取甲基丙烯酸单体(450mL,5.2mmol)于40mL无水乙腈中,加入引发剂AIBN(8mg,0.05mmol),交联剂N,N'-双(甲基丙烯酰)胱胺酸二甲酯(80mg,0.2mmol),Acrydite-DNA5OD,超声10min。使用水浴锅进行加热,20min分钟内将水温从室温加热到82℃,继续反应40min后,停止反应。恢复室温后,将上述溶液转移至1.5mL离心管中,每个离心管1.0mL溶液。然后高速离心8000r/min,10min。转移上清,加入无水乙腈1mL,超声分散30min,然后高速离心8000r/min,10min,转移上清,再加入无水乙腈1mL,超声分散30min,得混浊溶液,冻干后,得到DNA修饰的PMAA纳米水凝胶。用马尔文激光粒度仪和扫描电镜对所得到的DNA修饰的PMAA纳米水凝胶进行测试表征,其动态光散射平均为530nm,扫描电镜的平均粒径在200nm左右,该纳米水凝胶微球的粒径分布结果见图2,扫描电镜结果见图3。
(3)还原敏感性DNA-PMAA载药纳米水凝胶微球的制备
称取盐酸阿霉素6mg于10mL磷酸盐缓冲液(PBS pH 7.4)中,溶解后称取冻干的DNA修饰的还原敏感PMAA纳米水凝胶微球10mg于上述溶液中,室温下搅拌12小时。将上述混合溶液转移至1.5mL离心管中,每个离心管1.0mL溶液。然后高速离心8000r/min,10min,转移上清,加入1.0mL PBS pH 7.4缓冲液,超声分散30min,重复洗涤三次。将三次洗涤液混合均匀,用UV检测游离的盐酸阿霉素的浓度。下层固体即为制备的DNA-PMAA载药纳米水凝胶,其载药量为35.8wt%,包封率为88.4%。其他条件具体载药量与包封率结果见表1。
表1DNA-PMAA纳米水凝胶的载药量及包封率
(4)MUC1酸适配体介导的还原敏感性PMAA载药纳米水凝胶的制备
首先,称取30mg DNA-PMAA载药纳米水凝胶于5mL西林瓶中,加入870μL PBS pH7.4缓冲液,用封口膜密封,超声10min。然后,用100μL(100mM NaCl-5mM MgCl)缓冲液将5ODMUC1核酸适配体(序列为5’-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG GTT TTT TTT TTT TTTTTT TTT TTT TT-3’,其连接臂序列与上述Acrydite-DNA序列互补)溶解,在室温下孵育1小时。之后将MUC1核酸适配体溶液加入到上述西林瓶中,30℃条件下,孵育30min,即可得到MUC1核酸适配体介导的还原敏感性PMAA载药纳米水凝胶。
实施例2还原敏感性PMAA纳米水凝胶降解性能考察
首先称取DNA-PMAA纳米水凝胶12mg分散溶解于40mL PBS pH 7.4缓冲液中,然后量取上述溶液6份,每份6mL于西林瓶中。分别为六个西林瓶编号1、2、3、4、5、6。然后分别向编号为1、2、3、4、5、6的西林瓶中加入还原剂DTT 3mg、5mg、8mg、10mg、15mg、20mg。分散溶解后,于37℃水浴锅中,每5min取样100μL,使用紫外分光光度计UV-2700检测其透光率T%,实验结果见图4。
实施例3 PMAA纳米水凝胶表面连接互补DNA链后荧光检测实验
本实验利用DNA荧光染料SYBR结合单链DNA显粉红色荧光,结合双链DNA显绿色荧光的原理分别对单链DNA修饰的PMAA纳米水凝胶以及与凝胶表面DNA互补的T-DNA(序列为5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3’)结合后的水凝胶微球进行验证。首先称取单链DNA共价修饰的PMAA纳米水凝胶3份,每份3mg,分别加入140μL PBS pH7.4缓冲液,并命名为:A组、B组、C组。然后向A组、B组分别加入20μL PBS缓冲液,向C组中加入20μL0.05mM与凝胶表面DNA互补的T-DNA,之后继续A组加入20μL PBS缓冲液,分别向B组、C组加入20μL稀释了250倍的SYBR染料。30℃条件下,共同孵育30min。在紫外灯下观察A组、B组、C组的荧光颜色,其中对照实验A组不显色,B组显粉红色荧光,C组显亮绿色荧光。由此,说明通过碱基互补配对的方式可以将核酸适配体连接在DNA-PMAA纳米水凝胶的表面,实验结果见图5。
实施例4 DNA-PMAA载药纳米水凝胶的累计药物释放动力学研究
称取DNA-PMAA载药纳米水凝胶9mg,分散在9mL(pH 7.4PBS)缓冲溶液中,超声分散10min,均等的分成三份,每份3mL于截留分子量为3500透析袋中。然后将透析袋放入含有60mL(pH 7.4PBS)缓冲溶液的烧杯中,随后向溶液中加入还原剂(DTT or GSH,10mM),然后用保鲜膜将烧杯封口置于37℃恒温水浴震荡器中。开始计时,并在预先设定的时间点(0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、6.0h、7.0h、8.0h、10h、12h、16h、20h、24h)取样60μL,同时补加60μL缓冲溶液。使用紫外分光光度计UV-2700检测溶液在λ485nm波长处的吸光度值A。根据阿霉素标准曲线计算释放的药量。实验结果见图6。同理,将PBS pH 7.4缓冲溶液替换为醋酸-醋酸钠pH 5.0缓冲溶液,研究其在pH 5.0缓冲溶液条件下的累计药物释放动力学,实验结果见图7。
由实验结果可以看出,在不含还原剂的PBS pH 7.4缓冲溶液以及醋酸-醋酸钠pH5.0缓冲溶液中阿霉素的释放速度均较慢,32h累计药物释放分别为26wt%和12.4wt%,均没有出现药物突释的现象,表现出较好的稳定性。与此同时,在含有还原剂谷胱甘肽的PBSpH 7.4缓冲溶液及醋酸-醋酸钠pH 5.0缓冲溶液中阿霉素的释放速度均较快,32h累计药物释放分别为75.5wt%和64.5wt%。在含有还原剂二硫苏糖醇的PBS pH 7.4缓冲溶液及醋酸-醋酸钠pH5.0缓冲溶液中阿霉素的释放速度同样较快,32h累计药物释放分别为62.3wt%和56.4wt%。由此可见,该还原响应的载药纳米水凝胶微球具有良好的还原刺激性释放性能,在还原性条件下药物的释放速度均可以显著加快,有利于药物在肿瘤细胞内的快速释放。
实施例5 MUC1核酸适配体介导的还原敏感载药纳米水凝胶的细胞细胞毒性检测
收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100μL,铺板使待测细胞调密度至8000-9000个/孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。在5%CO2,37℃条件下孵育至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),细胞贴壁生长24后加药(药物浓度进行10倍梯度稀释,最高作用浓度为100μM,最低浓度为0.01μM),每组设4个复孔,在5%CO2,37℃条件下孵育48小时,用pH7.4PBS缓冲液冲洗3遍后于倒置显微镜下观察。每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL,即0.5%MTT),继续培养4h。之后离心后弃去培养液,小心用pH 7.4PBS缓冲液冲洗3遍后,再加入含MTT的培养液。终止培养,小心吸去孔内培养液,每孔加入100μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。然后分别计算出不同剂型的药物对MCF-7及MCF-10A细胞48h的IC50值,再根据公式(5-1)计算药物的选择指数。其实验结果见表2,表3。
表2药物对MCF-7细胞48h细胞增殖抑制作用
由表2可知,空白PMAA微球对MCF-7细胞几乎无细胞毒作用,其IC50>100μM。游离Dox对MCF-7细胞48h的IC50值为2.16μM。不含靶向配体载药微球(Dox-PMAA)对MCF-7细胞48h的IC50值为6.42μM,MUC1核酸适配体介导载药微球(MUC1-Dox-PMAA)对MCF-7细胞48h的IC50值为2.46μM。首先,可以明显的看出PMAA载体为一种生物相容性良好的高分子材料,对细胞的生长没有抑制作用。其次,靶向药物MUC1-Dox-PMAA对MCF-7细胞抑制效率明显好于与非靶向药物Dox-PMAA,而此时非靶向药物Dox-PMAA对MCF-7细胞的抑制效率明显低于游离Dox,这是由于载药后的Dox-PMAA必须在进入肿瘤细胞后,响应肿瘤细胞内的特殊环境降解释放出药物,并且Dox的作用靶点存在与细胞核中,因此Dox-PMAA从进入、降解、释放、转运至细胞核相对游离药用时较长。MUC1-Dox-PMAA对MCF-7细胞的抑制效率与游离药物Free-Dox相当,说明通过MUC1S2.2核酸适配体Aptamer对PMAA载体修饰后能够显著提高其进入MCF-7细胞的能力。
表3药物对MCF-A10细胞48h细胞增殖抑制作用
由表3可知,空白药物载体PMAA对正常乳腺细胞MCF-10A无细胞毒作用(IC50>100μM)。游离药物Free-Dox对MCF-10A细胞48h的IC50值为31.17μM,非靶向药物Dox-PMAA对MCF-10A细胞48h的IC50值为29.11μM,靶向药物MUC1-Dox-PMAA对MCF-10A细胞48h的IC50值为35.23μM。由于正常乳腺细胞表面含有较少量的MUC1粘蛋白,因此其对MCF-10A细胞的生长抑制效率与游离Dox及非靶向药物Dox-PMAA相当。
根据药物选择性计算公式(5-1),利用不同药物剂型对MCF-7、MCF-10A的IC50值,计算各药物剂型的对肿瘤细胞和正常细胞的选择指数。上述三种不同盐酸阿霉素剂型对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞的选择指数分别为:游离药物Free-Dox为8.04、非靶向药物Dox-PMAA为5.44;靶向药物MUC1-Dox-PMAA为17.63。根据以上数据可知MUC1-Dox-PMAA的选择指数为游离药物的2.19倍,为非靶向药物包合物的3.24倍。因此,表面通过MUC1S2.2核酸适配体对PMAA药物载体修饰后可以显著的提高其对乳腺癌细胞的靶向性。
实施例6激光共聚焦显微镜检测载药MUC1-Dox-PMAA对肿瘤细胞的靶向选择性
取对数生长期的细胞,以合适细胞密度接种于96孔板内,100μL/well,培养于37℃,5%CO2的培养箱内。细胞贴壁后,加入药物10μL/孔(每孔药物终浓度为10μM),继续培养24h后,用pH 7.4PBS缓冲液洗涤3×5min,4%多聚甲醛固定细胞15min。用pH 7.4PBS缓冲液洗涤3×5min。对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。通透10min,用pH7.4PBS缓冲液洗涤3×5min。使用Hoechst 33342进行染色,染色时以1:1000比例进行稀释染色试剂,染色10min,用pH 7.4PBS缓冲液洗涤3×5min,于激光共聚焦显微镜下观察,拍照。实验结果见图8,图9。
由图8可以明显的看出使用MUC1-Dox-PMAA药物载体进行给药时,乳腺癌细胞核内药物的荧光强度明显强于使用Dox-PMAA药物载体进行给药时的荧光强度。当使用MUC1-Dox-PMAA药物载体对乳腺癌细胞(MCF-7)及正常乳腺细胞(MCF-10A)给药时,发现MCF-7细胞核内药物的荧光强度与MCF-10A细胞核内药物的荧光强度差别更加显著,而使用MUC1-Dox-PMAA及Dox-PMAA药物载体对MCF-10A给药时,MCF-10A细胞核内药物的荧光强度差别不明显。从图9药物荧光定量数据来看中,当使用MUC1-Dox-PMAA药物载体对乳腺癌细胞(MCF-7)及正常乳腺细胞(MCF-10A)给药时,药物进入MCF-7细胞核的药量是MCF-10A的4.8倍。以上数据表面,MUC1-Dox-PMAA给药系统对乳腺癌细胞具有非常好的靶向选择性,使用该载体对乳腺癌进行治疗具有非常好的应用前景。
序列表
<110> 沈阳药科大学
<120> 一种DNA固定纳米水凝胶微球及其与核酸适配体复合物的制备和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 2
gcagttgatc ctttggatac cctggttttt tttttttttt tttttttttt 50
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 3
tttttttttt tttttttttt 20
Claims (8)
1.DNA固定纳米水凝胶微球与核酸适配体的复合物,其特征在于,通过如下方法制备:
a. 取核酸适配体适量用缓冲溶液溶解,在室温10~30℃下孵育20~90分钟;
b. 将载药的纳米水凝胶微球,加入到a中的溶液中,10~30℃孵育20~90分钟,得到核酸适配体介导的具有肿瘤靶向功能的纳米制剂;
步骤a中,所述的核酸适配体为:MUC1 S2.2、A10 PMSM、AS1411、Sgc8c或CD40;
步骤b中,所述的纳米水凝胶微球通过如下方法制备:
(1)将水溶性聚合单体、丙烯类或甲基丙烯类交联剂、自由基聚合的引发剂、5’末端N-(6-羟基己基)甲基丙烯酰胺单体修饰的单链DNA Acrydite-DNA加入到反应溶剂中,搅拌完全溶解,在适当的温度下,反应一段时间即可获得单链DNA共价修饰的纳米材料;
(2)反应结束后,高速离心、弃上清,对离心后的下层固体进行洗涤及冷冻干燥;
(3)将冻干纳米材料加入到一定浓度的药物溶液中,室温下搅拌12~48 h,之后将该混合溶液进行高速离心,即可得到单链载药的DNA固定纳米水凝胶微球;
在合成核酸适配体时在其一端合成一段单链DNA作为连接臂,所述核酸适配体的连接臂DNA为与单链DNA序列完全互补的序列;
所述的水溶性聚合单体为:甲基丙烯酸、N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N,N’-双(甲基丙烯酰)胱氨酸、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯;
所述的交联剂为:N,N’-双(甲基丙烯酰)胱氨酸二甲酯、N,N’-双(丙烯酰)胱氨、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯;
所述的自由基聚合引发剂为:偶氮二异丁晴、偶氮二异庚腈、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)过硫酸铵;
所述的Acrydite-DNA结构为:
其中DNA为10~80碱基长的任意序列的单链DNA。
2.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,步骤 a中,所述的核酸适配体用量为0.1~20 OD/mL。
3.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,步骤a中,所述的核酸适配体用量为0.2~10OD/mL。
4.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,步骤 (1) 中,所述的水溶性单体的浓度为: 1~200 mg/mL;所述的交联剂的浓度为:0.1~40 mg/mL;所述Acrydite-DNA的用量为:0.1~50 OD/mL;所述的自由基聚合的引发剂浓度为:0.01~2 mg/mL。
5.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,步骤 (1) 中,所述的水溶性单体的浓度为: 2~100 mg/mL;所述的交联剂的浓度为: 0.5~20 mg/mL;所述Acrydite-DNA的用量为:0.5~30 OD/mL;所述的自由基聚合的引发剂浓度为:0.05~1 mg/mL。
6.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,步骤 (1)中,所述的反应溶剂为:去离子水、乙醇、乙腈、甲醇、环己烷或其混合溶液;反应温度为:25~90℃;反应时间为:10~90min;步骤(2)中所述的高速离心的转速为:6000~12000 r/min;所述的对离心后的下层固体进行洗涤的洗涤溶液为:去离子水、乙腈、乙醇、丙酮;步骤(3)中,所述的药物浓度为:0.2~ 10 mg/mL。
7.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,步骤 (1)中,反应温度为:50~90℃;反应时间为:15~75 min;步骤(2)中所述的高速离心的转速为:7000~10000 r/min;步骤(3)中,所述的药物浓度为:0.3 ~ 5 mg/mL。
8.权利要求1所述的DNA固定纳米水凝胶微球与核酸适配体的复合物在制备肿瘤靶向制剂中的应用。
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