CN109722403B - 一种利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法 - Google Patents
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Abstract
为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种工程菌株，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌。本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.1所示的质粒、如SEQ ID NO.2所示的质粒和如SEQ ID NO.3所示的质粒。本公开还提供了该方法制备得到的工程菌、上述工程菌株和工程菌的用途以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
Description
技术领域
本公开涉及生物工程领域，具体地，涉及一种工程菌株、一种制备工程菌的方法、该方法制备得到的工程菌、上述工程菌株和工程菌的用途以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。
背景技术
金合欢烯可加氢转化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料。金合欢烯具有不含硫、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的生物基化学品。例如，CN101553558A描述了在大肠杆菌中利用含有葡萄糖的培养基通过MEV途径生成金合欢烯。
通过微生物法生产金合欢烯需要解决的一个重要问题是葡萄糖的来源问题。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上，是一种重要的葡萄糖来源。具体地，纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键联结而成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。例如，棉花的纤维素含量接近100％。纤维素通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起。例如一般木材中，纤维素占40～50％，还有10～30％的半纤维素和20～30％的木质素。
纤维素只有在降解为葡萄糖以后，才能被微生物工程菌作为碳源利用。在实际生产中，作为纤维素的来源的原材料主要包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸等，这些原材料中纤维素往往形成一种具有高度结晶区的超分子稳定结构，同时其周围紧密镶嵌着半纤维素和木质素，从而形成复杂稳定的结构，其使得纤维素很难直接被微生物直接利用。目前，通常对作为纤维素的来源的原材料先进行预处理和酶解，在将得到的含有单糖的产物送入发酵过程。例如，已有的预处理方法主要有稀酸处理、热液处理、蒸汽爆破、有机溶剂处理、低温氨浸处理、碱液处理、碱性过氧化氢处理和生物法处理等。又例如，已有的酶解包括纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶的酶解。
然而，在研究过程中发现，纤维素水解产生含有单糖的产物如果用于金合欢烯的发酵生产，存在着产率低下的缺陷。
发明内容
本公开的目的之一是提高利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种工程菌株，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌。
另一方面，本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.1所示的pMevT质粒、如SEQ ID NO.2所示的pMBIS质粒和如SEQ ID NO.3所示的pFII质粒。
另一方面，本公开还提供了上述方法制备得到的工程菌。
另一方面，本公开还提供了上述工程菌株或上述方法制备得到的工程菌在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。
再一方面，本公开还提供了一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种如上所述的工程菌株或工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。
利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯存在着产率低下的原因可能在于菌株本身的抗逆性较差或合成能力较差，通过选取合适的载体、代谢通路、基因排布顺序和启动子组合应用以平衡代谢通路，能显著地提高工程菌的抗逆性。因此，本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本公开涉及到的生物保藏信息包括：分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichiacoli；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2017年10月16日；保藏编号为：CGMCC NO.14817。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面，本公开提供了一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌。大肠杆菌是指大肠埃希氏菌Escherichia coli。
其中，保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌是在根据制备工程菌的方法制备工程菌的过程中，出乎意料地得到的一个具有较高活性的克隆，由此得到了具有效果更好的工程菌株。
本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.1所示的pMevT质粒、如SEQ ID NO.2所示的pMBIS质粒和如SEQ ID NO.3所示的pFII质粒。
可选地，其中，所述工程菌为大肠杆菌。
可选地，其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。
其中，由如SEQ ID NO.1所示的pMevT质粒、如SEQ ID NO.2所示的pMBIS质粒和如SEQ ID NO.3所示的pFII质粒三者组成的重组质粒使得所述工程菌中能够具有异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)、金合欢烯焦磷酸合成酶(ispA)和金合欢烯合成酶(FG)的表达，并且能够具有组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶的表达；并且这种特定组合的重组质粒能够使得工程菌中各种代谢酶的表达量构成了高效的平衡代谢通路，由此提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
其中，所述组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶包括乙酰乙酰基CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶(E12)、磷酸甲羟戊酸激酶(E8)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)；所述乙酰乙酰基CoA硫解酶为atoB酶；所述HMG-CoA合酶为HMGS酶，所述HMG-CoA还原酶为HMGR酶。
其中，本公开中所涉及到的各种酶的物种来源、氨基酸序列和核苷酸编码序列可以为已知的选择。例如，异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)是指编号为EC 5.3.3.2的酶，其来源及序列可以为已知的物种来源和序列(包括人工序列)。表1中给出了本公开中所涉及到的各种酶的参考信息，但本公开中所涉及到的各种酶的选取和使用并不局限于表1中的信息。
表1
| 酶的名称 | 酶学编号 | 参考编码序列 |
| 异戊烯焦磷酸异构酶(IDI) | EC 5.3.3.2 | SEQ ID NO.2中7197-744位 |
| 金合欢烯焦磷酸合成酶(ispA) | EC 2.5.1.10 | SEQ ID NO.2中7767-8666位 |
| 金合欢烯合成酶(FG) | EC 4.2.3.47 | SEQ ID NO.3中5069-6792位 |
| atoB酶 | EC 2.3.1.9 | SEQ ID NO.1中1320-2503位 |
| HMGS酶 | EC 2.3.3.10 | SEQ ID NO.1中2519-3993位 |
| HMGR酶 | EC 1.1.1.34 | SEQ ID NO.1中4009-7145位 |
| 甲羟戊酸激酶(E12) | EC 2.7.1.36 | SEQ ID NO.2中3535-4565位 |
| 磷酸甲羟戊酸激酶(E8) | EC 2.7.4.2 | SEQ ID NO.2中4588-5943位 |
| 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1) | EC 4.1.1.33 | SEQ ID NO.2中5975-7164位 |
另一方面，本公开还提供了如上所述的方法制备得到的工程菌。
另一方面，本公开还提供了如上所述的工程菌株或如上所述的工程菌在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。
另一方面，本公开还提供了一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种如上所述的工程菌株或如上所述的工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。
可选地，其中，所述含有纤维素的原料包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸中的至少一种。
可选地，其中，将含有纤维素的原料进行水解处理的步骤包括：S1、将含有纤维素的固态原料先后进行酸预处理和碱预处理，或者先后进行碱预处理和酸预处理，得到预处理后的固态物料；S2、将所述预处理后的固态物料进行酶促水解。
可选地，其中，所述酸预处理为甲酸处理和/或稀硫酸处理；所述甲酸处理的条件包括：温度为40～100℃，时间为1～10小时，相对每千克预处理的固体物料，甲酸溶液的体积为5～50升，所述甲酸溶液含有70～95wt％的甲酸和0～2wt％的HCl；所述稀硫酸处理的条件包括：温度为80～150℃，时间为5分钟～2小时，相对每千克预处理的固体物料，稀硫酸溶液的体积为5～50升，所述稀硫酸溶液含有0.5～10wt％的稀硫酸。
可选地，其中，所述碱预处理为氨水处理和/或氢氧化钠处理；所述氨水处理的条件包括：温度为40～80℃，时间为2～24小时，相对每千克预处理的固体物料，氨水的体积为2～20升，所述氨水含有10-25wt％的NH3；所述氢氧化钠处理的条件包括：温度为60～120℃，时间为1～12小时，相对每千克预处理的固体物料，氢氧化钠水溶液的体积为5～50升，所述氢氧化钠水溶液含有0.5～10wt％的氢氧化钠。
可选地，其中，所述酶促水解的条件包括：温度30～70℃，时间3～72h，pH为4.0～6.0，每千克预处理后的固态物料，缓冲液的体积为5～100升，酶促水解所用的缓冲液含有0.01～1mol/L柠檬酸缓冲液和/或0.01～1mol/L的乙酸缓冲液，酶促水解所用的酶为纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～500U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～250U。
可选地，其中，发酵培养的条件包括：温度为16～35℃，时间为3～120h，相对每升所述液态发酵原料，萃取剂的用量为50～1000mL，所述工程菌或工程菌株的接种量为(10～300)×107个；所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷或煤油；每升所述液态发酵原料中，以单糖的量计算，所述含有单糖的水解产物的含量为0.01～0.9千克。
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
本实施例用于说明纤维素酶解液的制备。
称取粒径为20～80目的玉米秸秆100g，加入1.5L甲酸溶液(含有88wt％的甲酸和1wt％的HCl)置于处理罐中。在65℃恒温水浴中反应3h后将反应浆液固液分离。对固体组分再进行氨水处理，处理条件为：氨水浓度15wt％、每千克固体组分所用的氨水的体积为8升、处理温度60℃和反应时间16h。反应结束后将物料固液分离，固体组分用蒸馏水洗涤至pH 6～7，烘干，得到预处理后的固态物料。
将所述预处理后的固态物料进行酶促水解，酶解条件包括：温度为50℃、每千克预处理后的固态物料所用缓冲液的体积为20升、缓冲液为pH为4.8的柠檬酸缓冲液(0.15mol/L)、酶促水解所用的酶为纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料30U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料60U。酶解24h后将反应浆液取出，在沸水浴中灭酶10min后进行抽滤。抽滤所得液体组分利用HPLC分析检测，所得纤维素酶解液葡萄糖浓度为38.2g/L。
实施例2
本实施例用于说明质粒的序列结构。本实施例中用到的可商购载体包括pBAD33载体、pACYDCDuet-1载体、pBBR1MCS-4载体和pet-28a载体。
按照上述载体的使用说明书采用PCR克隆、全基因合成、限制性内切酶酶切和连接等分子生物学操作，构建1套MVA代谢路径的质粒，具体包括pMevT质粒、pMBIS质粒和pFII质粒，再构建1个用于替换pFII质粒的质粒，即pFG质粒，接着构建1个用于替换pMevT质粒的pMevT-1质粒。上述质粒的序列信息具体如表2所示。
表2
实施例3
本实施例用于说明工程菌株的构建过程。
实验组工程菌株F1的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入表2中所述pMevT质粒、pMBIS质粒和pFII质粒。该菌株可通过MVA代谢路径合成金合欢烯，具有优化后的高效的平衡代谢通路。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的9个克隆，分别为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8和F1-9。
对照组工程菌株DF1的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入表2中所述pMevT质粒、pMBIS质粒和pFG质粒。该菌株可通过MVA代谢路径合成金合欢烯，但没有进行平衡代谢通路的优化。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为DF1-1、DF1-2和DF1-3。
实施例4
本实施例用于说明利用纤维素制备金合欢烯的方法。
将实施例1得到的纤维素酶解液作为含有单糖的水解产物，用于制备液态发酵原料。每升所述液态发酵原料含有100mL实施例1得到的纤维素酶解液以及10g蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl和余量的水。液态发酵原料灭菌后待用。
在上述液态发酵原料中添加抗生素(氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度为30mg/mL)，然后分别接种实施例3得到的15个克隆，接种密度为200×107个/L。在37℃下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加终浓度为200mg/L的IPTG、终浓度为1g/L的L-阿拉伯糖和20mL正癸烷，在30℃下进行诱导表达以发酵合成金合欢烯。诱导24h后取1mL发酵液和100μl萃取层(正癸烷)分别进行细胞密度和金合欢烯浓度的检测。结果如表3所示。
表3
| 编号 | 工程菌克隆 | 发酵液细胞密度(OD<sub>600</sub>) | 萃取层金合欢烯浓度(g/L) |
| 1 | F1-1 | 16.25 | 3.24 |
| 2 | F1-2 | 16.03 | 3.15 |
| 3 | F1-3 | 15.69 | 3.08 |
| 4 | F1-4 | 16.37 | 3.13 |
| 5 | F1-5 | 15.86 | 3.05 |
| 6 | F1-6 | 16.34 | 3.19 |
| 7 | F1-7 | 17.62 | 3.83 |
| 8 | F1-8 | 15.83 | 3.08 |
| 9 | F1-9 | 16.53 | 3.15 |
| 10 | DF1-1 | 4.26 | 0.023 |
| 11 | DF1-2 | 3.95 | 0.030 |
| 12 | DF1-3 | 4.67 | 0.025 |
根据表3的数据可见，就发酵产物中的金合欢烯含量而言，实验组工程菌株F1的9个克隆F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8和F1-9均显著高于对照组工程菌株DF1的3个克隆DF1-1、DF1-2和DF1-3，并且实验组工程菌株F1的9个克隆中，F1-7具有最高的发酵产物中的金合欢烯含量，将其选定为最优菌株进行保藏，保藏编号为：CGMCCNO.14817。由此可见，表2中所述pMevT质粒、pMBIS质粒和pFII质粒的共同转化能够显著地提高利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率，并且更优选地，保藏编号为：CGMCCNO.14817的工程菌株具有更加突出的优异转化效果。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院
<120> 一种利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
<130> 7821RIPP
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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agatcaaccg tcatcagaca gactttggaa gaggacggag ttgtcccaac tacagcagat 5160
attatatata aggatgaaac tgcctcagaa ccacattttt tgagatctaa cgtggctatc 5220
attctgggaa aagcatcagt tattggtctt ttgcttctga tcaaccttta tgttttcaca 5280
gataagttaa atgctacaat actaaacacg gtatattttg actctacaat ttactcgtta 5340
ccaaatttta tcaattataa agatattggc aatctcagca atcaagtgat catttccgtg 5400
ttgccaaagc aatattatac tccgctgaaa aaataccatc agatcgaaga ttctgttcta 5460
cttatcattg attccgttag caatgctatt cgggaccaat ttatcagcaa gttacttttt 5520
tttgcatttg cagttagtat ttccatcaat gtctacttac tgaatgctgc aaaaattcac 5580
acaggataca tgaacttcca accacaatca aataagatcg atgatcttgt tgttcagcaa 5640
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tatgctttga gttcccagga cgagcctatc cgtcctttat cgaatttagt ggaacttatg 5820
gagaaagaac aattaaagaa catgaataat actgaggttt cgaatcttgt cgtcaacggt 5880
aaactgccat tatattcctt agagaaaaaa ttagaggaca caactcgtgc ggttttagtt 5940
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ttcagaaatt atgattatga tcgcgttttt ggagcttgct gtgaaaatgt catcggctat 6060
atgccaatac cagttggtgt aattggtcca ttaattattg atggaacatc ttatcacata 6120
ccaatggcaa ccacggaagg ttgtttagtg gcttcagcta tgcgtggttg caaagccatc 6180
aatgctggtg gtggtgcaac aactgtttta accaaagatg gtatgactag aggcccagtc 6240
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ggacaaaatt caattaaaaa agcttttaat tctacatcaa ggtttgcacg tttgcaacat 6360
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gaatatggtt gggaagatat ggaagttgtc tccgtatctg gtaactattg tactgataag 6540
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gtcgaaagtt ccaactgtat aactttgatg aaggaagttg atggtgattt aaggatctct 6840
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gctaggcaat tagctagaat aatcgcgtgt gctgtcttgg ctggtgaact gtctctgtgc 7020
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ttataatgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 7200
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gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 7380
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aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 7680
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 7740
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttggggca aactattaac tggcgaacta 7800
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ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 7920
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gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 8040
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ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 8520
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gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 8760
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cgacatggaa gccatcacag acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct 9240
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agctgtccct cctgttcagc tactgacggg gtggtgcgta acggcaaaag caccgccgga 10140
catcagcgct agcggagtgt atactggctt actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg 10200
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caggatatat tccgcttcct cgctcactga ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg 10320
agcggaaatg gcttacgaac ggggcggaga tttcctggaa gatgccagga agatacttaa 10380
cagggaagtg agagggccgc ggcaaagccg tttttccata ggctccgccc ccctgacaag 10440
catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 10500
caggcgtttc cccctggcgg ctccctcgtg cgctctcctg ttcctgcctt tcggtttacc 10560
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gtaggcagtt cgctccaagc tggactgtat gcacgaaccc cccgttcagt ccgaccgctg 10680
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggaa agacatgcaa aagcaccact 10740
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gctaaactga aaggacaagt tttggtgact gcgctcctcc aagccagtta cctcggttca 10860
aagagttggt agctcagaga accttcgaaa aaccgccctg caaggcggtt ttttcgtttt 10920
cagagcaaga gattacgcgc agaccaaaac gatctcaaga agatcatctt attaatcaga 10980
taaaatattt gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg 11040
cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg 11100
cgtagaggat ctgctcatgt ttgacagctt atc 11133
<210> 2
<211> 10396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60
cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120
ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180
cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240
cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300
gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360
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cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680
taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740
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gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga 1860
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ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2100
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gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520
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gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa 2760
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tacaacaagc ctgccgtcgc tgctagtgtg tctgcgttga gaacctacct gctaataagc 3360
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ggtgctgggt tgggctcaag cgcctctatt tctgtatcac tggccttagc tatggcctac 3720
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tatactagaa ttccaaggtc tacaaaagat cttgttgctc gcgttcgtgt gttggtcacc 4020
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cgaagagaca ttactcaaga gcaaattgac agcttcaaaa agaaattgca agatgatttt 4380
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aacttgttcg ttattgatat tttctctgat gatgcctacc attctcagga ggatagcgtt 4980
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaggagg aattaaccat gtcgactctt cctatttcta gtgtttcatt 5100
ctcttcatct acgtcacctt tggtagttga tgataaagtt agcacgaaac aagatgttat 5160
ccgccatacc atgaatttca atgctagcat atggggagat caatttctta catatgatga 5220
gccagaagat ttggttatga agaaacaact tgttgaagag ctcaaagagg aagtcaagaa 5280
agagctaata acgatcaaag gttctaatga accgatgcag catgtcaagt tgttagaact 5340
tattgatgca gtccaacggc ttggcatagc ctatcatttt gaagaggaga ttgaagaagc 5400
cttgcaacat atccatgtta catatggcga gcagtgggtc gataaagaaa acctacaaag 5460
catttctctt tggttccgac tcctacgaca acaaggcttc aacgtctcat caggagtatt 5520
caaggacttt atggacgaga agggaaaatt taaggaatcc ttatgtaatg atgctcaggg 5580
aattcttgct ctgtatgaag cggcatttat gagggtggaa gatgaaacaa tactagataa 5640
tgcgctcgag ttcactaaag ttcaccttga catcatagcc aaggatcctt cttgtgactc 5700
ttccctaaga acccaaatac accaagcgtt aaagcagcca cttaggagaa ggctggcaag 5760
gatagaggcg ttgcattaca tgcctatcta ccaacaagaa acatcccaca atgaggtctt 5820
actgaagctt gcaaaactag attttagcgt gcttcaatca atgcacaaaa aggagcttag 5880
ccacatttgc aaatggtgga aggatttgga ccttcaaaat aagcttcctt atgttcgaga 5940
cagggtggtg gaaggctatt tttggatact atccatctat tacgagcctc aacatgctcg 6000
aacaagaatg ttcctaatga aaacatgcat gtggttagtc gttttagatg atacatttga 6060
taattatggt acttatgaag aactcgaaat ctttacacaa gctgttgaaa gatggtcaat 6120
aagctgcctg gatatgcttc cagaatacat gaaactaata tatcaagagc ttgtgaatct 6180
tcacgtggaa atggaggaat cacttgaaaa ggagggaaaa acatatcaaa ttcactatgt 6240
caaggagatg gcaaaagagt tggttcgcaa ctacttggta gaagcgagat ggctaaaaga 6300
ggggtacatg ccaactcttg aggagtacat gtctgtgtca atggtgactg gtacctatgg 6360
cttaatgata gcgagatctt atgtcggtag gggtgatatt gtcaccgagg atacctttaa 6420
atgggtgtcc tcgtatcctc ctattataaa agcttcatgt gtgattgtaa gacttatgga 6480
tgacattgtc agccacaagg aggaacaaga gagaggccat gttgcttcaa gcatcgaatg 6540
ctattctaag gaaagtggtg catcagagga ggaagcgtgt gaatatatct caggaaaagt 6600
tgaagatgca tggaaagtta taaaccgaga gtcgctcagg cctacagcgg tcccgtttcc 6660
tctacttatg cctgcaatca accttgcacg tatgtgtgaa gtcctatata gcgtcaacga 6720
tggcttcact catgctgagg gagacatgaa aagttacatg aaatcgttct tcgttcaccc 6780
tatggttgtc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat 6840
aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag 6900
gaactatatc cggat 6915
Claims (6)
1.一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌。
2.权利要求1所述的工程菌株在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。
3.一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；
(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种权利要求1所述的工程菌株，并进行发酵培养，得到培养后的物料。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
将含有纤维素的原料进行水解处理的步骤包括：
S1、将含有纤维素的固态原料先后进行酸预处理和碱预处理，或者先后进行碱预处理和酸预处理；
S2、将所述预处理后的固态物料进行酶促水解；
所述酸预处理为甲酸处理和/或稀硫酸处理；所述甲酸处理的条件包括：温度为40～100℃，时间为1～10小时，相对每千克预处理的固体物料，甲酸溶液的体积为5～50升，所述甲酸溶液含有70～95wt％的甲酸和0～2wt％的HCl；所述稀硫酸处理的条件包括：温度为80～150℃，时间为5分钟～2小时，相对每千克预处理的固体物料，稀硫酸溶液的体积为5～50升，所述稀硫酸溶液含有0.5～10wt％的稀硫酸；
所述碱预处理为氨水处理和/或氢氧化钠处理；所述氨水处理的条件包括：温度为40～80℃，时间为2～24小时，相对每千克预处理的固体物料，氨水的体积为2～20升，所述氨水含有10-25wt％的NH3；所述氢氧化钠处理的条件包括：温度为60～120℃，时间为1～12小时，相对每千克预处理的固体物料，氢氧化钠水溶液的体积为5～50升，所述氢氧化钠水溶液含有0.5～10wt％的氢氧化钠；
所述酶促水解的条件包括：温度30～70℃，时间3～72h，pH为4.0～6.0，每千克预处理后的固态物料，缓冲液的体积为5～100升，酶促水解所用的缓冲液含有0.01～1mol/L柠檬酸缓冲液和/或0.01～1mol/L的乙酸缓冲液，酶促水解所用的酶为纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～500U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～250U。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，发酵培养的条件包括：温度为16～35℃，时间为3～120h，相对每升所述液态发酵原料，萃取剂的用量为50～1000mL，所述工程菌或工程菌株的接种量为(10～300)×107个；所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷或煤油；每升所述液态发酵原料中，以单糖的量计算，所述含有单糖的水解产物的含量为0.01～0.9千克。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述含有纤维素的原料包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸中的至少一种。
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| Metabolic engineeringof Escherichia coli for a-farneseneproduction;Chonglong Wang等;《Metabolic Engineering》;20110901;第13卷;648-655页 * |
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