CN109721643A - 一种prrsv-1病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种PRRSV‑1病毒样颗粒，其包括：PRRSV LV株结构蛋白GP5；PRRSV LV株基质蛋白M；所述病毒样颗粒的表达PRRSV LV基质蛋白M以及共表达PRRSV LV结构蛋白GP5。本发明实施例还提供制备所述PRRSV‑1病毒样颗粒的方法，其包括以下步骤：分别克隆PRRSV LV株中表达GP5蛋白和基质蛋白M的基因；将表达GP5蛋白和基质蛋白M的基因克隆至杆状病毒穿梭载体上，获得重组杆状病毒穿梭载体；将所述重组杆状病毒穿梭载体转化至DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒基因组。该方法适合于进行大规模的放大制备抗欧洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征疫苗，安全性高，具有良好的开发与应用前景。

Description

一种PRRSV-1病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本发明实施例涉及生物制药技术领域，具体涉及一种PRRSV-1病毒样颗、制备方法及其应用。

背景技术

目前，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是养猪行业重要的病毒性传染病之一。被感染的猪群主要表现为母猪的繁殖障碍、仔猪的呼吸障碍及断奶仔猪高死亡率等，感染后康复猪群往往处于隐性感染状态，并可长期排毒。PRRSV在全球养猪行业中普遍存在，给全球养猪行业带来巨大的经济损失，同时也给食品安全增加了一定的风险。

PRRSV为单股正链RNA病毒，基因组全长约15kb，与核衣壳缠绕在一起。11个开放阅读框(ORFs)共编码24种不同的蛋白质，其中ORF1a和ORF1b共编码16种非结构蛋白，主要在病毒基因组的转录和翻译过程中发挥调节作用；剩余的基因编码8种结构蛋白作用于病毒的进入、组装、出芽等过程。ORF2-4共编码4个糖基化次要结构蛋白GP2a、E、GP3、GP4，是病毒感染与组装过程中必不可少的成分；ORF5a编码的非糖基化次要结构蛋白GP5a，在病毒的感染与组装过程中并非必须，但会影响病毒的复制水平；ORF5编码糖基化蛋白GP5是PRRSV的主要囊膜结构蛋白之一，也是病毒的主要中和抗原表位的聚集区；ORF6编码的非糖基化蛋白M，与GP5蛋白通过二硫键形成异源二聚体，是形成病毒粒子最基本的结构；ORF7编码的非糖基化核衣壳蛋白N蛋白可形成同源二聚体，携带病毒基因组入核，与细胞的转录因子互作。

PRRSV分为以LV株为代表的欧洲型(PRRSV-1)和以VR-2332株为代表的美洲型(PRRSV-2)两种基因型，其相似度仅为54％-67％。由于PRRSV的突变与重组速度非常快，根据ORF5的系统发育进化分析我们可知，平均变异速度为10^-2/site/year，不断出现的重组新毒株对我国境内主要流行的高致病性PRRSV感染机制的研究也带来了更大的挑战。

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)由病毒的单分子结构蛋白高度有序的组装在一起形成，能够有效激活B细胞免疫应答。VLPs具有特殊的微粒结构非常容易被抗原递呈细胞所摄取，且自身具有良好的佐剂功能，从而能更加有效的激活固有免疫和适应性免疫应答，具有良好的应用前景。

综上所述，由于PRRSV病毒突变速度较快，现有的VLPs疫苗不能满足实际的需要，制备过程复杂，无法大规模生产，并且无法应对病毒的突变速度，亟待研发对于PRRSV-1病毒样颗粒制备方法及该病毒样颗粒的应用。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种PRRSV-1病毒样颗粒，以解决现有技术中制备病毒样颗粒过程复杂，无法大规模生产以及无法满足现有疫苗对病毒样颗需求问题。

本发明实施例另一方面提供PRRSV-1病毒样颗粒制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：

一种PRRSV-1病毒样颗粒，其特征在于包括：

PRRSV LV结构蛋白GP5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

PRRSV LV基质蛋白M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述病毒样颗粒表面同时包含PRRSV LV基质蛋白M以及PRRSVLV结构蛋白GP5。

优选的，所述PRRSV LV结构蛋白GP5的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，所述PRRSV LV基质蛋白M的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明实施例还提供猪繁殖和呼吸障碍综合症疫苗，其包括上述所述的PRRSV-1病毒样颗粒和佐剂。

本发明实施例还提供制备所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其包括以下步骤：

分别克隆PRRSV LV株中表达GP5蛋白和基质蛋白M的基因；

将表达GP5蛋白和基质蛋白M的基因克隆至杆状病毒穿梭载体上，获得重组杆状病毒穿梭载体；

将所述重组杆状毒穿梭病载体转化至DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒基因组；

将所述重组杆状病毒基因组转染SF9细胞，获得重组杆状病毒；

将所述重组杆状病毒感染High Five细胞，获得所述PRRSV-1病毒样颗粒。

优选的，所述克隆PRRSV LV株中表达GP5蛋白基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述表达基质蛋白M的基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述M的基因的引物上游扩增引物中添加如SEQ ID NO.5所示的syn21序列；

所述M的基因的引物下游扩增引物中添加如SEQ ID NO.6所示的Flag序列。

本发明实施例提供的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，还包括对所述PRRSV-1病毒样颗粒采用蔗糖垫超速离心法和蔗糖密度梯度离心法纯化步骤。

优选的，所述重组杆状病毒培养，获得第三代重组杆状病毒，并感染High Five细胞。

本发明首先扩增出PRRSV-1的GP5基因和M基因，将两个基因分别克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac Dual中的两个表达盒内获得重组穿梭质粒pFBD-GP5-M，进行酶切鉴定；将重组穿梭质粒pFBD-GP5-M转化至DH10Bac感受态细胞中，经蓝白斑筛选获得阳性单菌落，采用碱裂解法提取重组杆粒rBD-GP5-M，并以PCR方法进行鉴定；将重组杆粒rBD-GP5-M转染贴壁生长的SF9细胞，待细胞出现明显病变时，收集培养上清，获得第一代重组杆状病毒。IFA结果显示GP5和M蛋白均在SF9细胞内表达；Western Blot结果显示SF9细胞表达的GP5和M蛋白大小与理论值一致。测定第三代重组杆状病毒滴度，按照MOI为4接种悬浮培养的HighFive细胞，48h后收集培养上清，经20％蔗糖垫超速离心浓缩和蔗糖密度梯度离心进行纯化，Western Blot结果显示可与PRRSV-1GP5蛋白抗体产生特异性反应，与理论值相符；磷钨酸负染电镜观察可见直径约为50～70nm的球形病毒样颗粒，与天然的PRRSV-1高度相似。将纯化的PRRSV-1免疫小鼠后能刺激机体产生较高的PRRSV-1抗体，可作为良好的免疫原。将本发明操作简单，悬浮培养High Five细胞要求低，易于进行大规模放大生产，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例的重组穿梭质粒pFBD-GP5-M构建示意图。其中，将GP5蛋白基因克隆至Pp10启动子下游，M蛋白基因克隆至PpH启动子下游。

图2为本发明实施例的酶切鉴定重组穿梭质粒pFBD-GP5-M电泳图，其中，泳道1为重组穿梭质粒pFBD-GP5-M；泳道2为限制性核酸内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切产物；泳道M为DNA Marker。

图3A-3D为本发明实施例的IFA验证GP5蛋白和M蛋白在SF9细胞中的表达情况的激光共聚焦图。图3A图显示GP5蛋白的被标记为红色；图3B图显示M蛋白被标记为绿色；图3C图是被DAPI染色的细胞核；图3D为merge图，可见GP5蛋白和M蛋白均表达在SF9细胞的细胞膜上，且存在共定位。

图4为本发明实施例的Western Blot鉴定蛋白表达图，其中，泳道1为待检样品；泳道2为阴性对照；A部分是GP5蛋白与Anti-GP5抗体反应显示出的特异性条带；B部分是M蛋白与Anti-Flag抗体反应显示出的特异性条带。

图5为本发明实施例的GP5蛋白和M蛋白的电泳图，其中，泳道1、2、3分别是在24h、48h、72h制备的蛋白样品；泳道4为阴性对照；A图将NC膜与Anti-GP5抗体进行反应，显示GP5蛋白表达的时序性；B图将NC膜与Anti-Flag抗体进行反应，显示M蛋白表达的时序性。

图6为本发明实施例制备的PRRSV-1VLPs透射电镜照片，其中，图中圆形颗粒即为PRRSV-1病毒样颗粒，棒状颗粒为重组杆状病毒。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1表达结构蛋白GP5和基质蛋白的M基因序列引物的设计

基于已经公布的PRRSV LV株(GenBank登录号:M96262.2)囊膜结构蛋白GP5和及基质蛋白M的表达基因的核苷酸序列，并分别设计引物用于基因扩增；在基质蛋白M基因的上游扩增引物中添加syn21序列如SEQ ID NO.5所示，下游扩增引物中添加Flag序列，如SEQID NO.6所示；扩增引物由吉林库美生物科技有限公司合成。各基因扩增引物序列和编号如下：

(1)GP5基因的扩增引物序列为：

SEQ ID NO.1：

pGP5-F:5’-CTCGAGATGAGATGTTCTCACAAATTG-3’；

SEQ ID NO.2：pGP5-R:5’-GGTACCCTAGGCCTCCCATTGCTC-3’；其中，扩增产物5’端酶切位点为XhoⅠ，3’端酶切位点为KpnⅠ。

(2)M基因的扩增引物为：

SEQ ID NO.3：

pM-F:5’-GGATCCAACTTAAAAAAAAAAATCAAAATGGGAGGCCTAGACGA-3’；

SEQ ID NO.4：

pM-R:5’-AAGCTTCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCCGGCCATACTTGACGAGGTTA-3’；

其中，扩增产物5’端酶切位点为BamHⅠ，3’端酶切位点为HindⅢ。

实施例2GP5基因与M基因的扩增与克隆

取200μL的PRRSV病毒液，使用总RNA提取试剂盒提取病毒液中总RNA，并反转录为cDNA。以该cDNA为模板，分别以实施例1中pGP5-F/pGP5-R和pM-F/pM-R为引物，按照基因合成报告单使用说明设置反应条件，PCR扩增GP5基因和M基因。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分离、纯化，将7μL纯化后的PCR产物与1μLpMD-19T Simple载体、1μL T4DNA连接酶、1μL Buffer混合均匀，25℃孵育10min，孵育结束后加入到50μL刚刚融化的Trans5α感受态细胞中，冰浴20min，42℃热激60s，立即冰浴5min，随后37℃活化5min，均匀的涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养平板上，37℃倒置培养12h，挑取单个菌落至含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养12h，使用Axygen质粒小量提取试剂盒提取质粒，并分别命名为19T-GP5质粒和19T-M质粒，使用双酶切的方法对质粒进行酶切鉴定。

将酶切鉴定正确的质粒进行基因测序。GP5基因测序序列如SEQ ID NO.7所示；M基因测序序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例3重组穿梭质粒的构建

重组穿梭质粒pFBD-GP5-M构建示意图如图1所示，使用限制性核酸内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切19T-GP5质粒和载体质粒，将GP5基因克隆至pFastBac Dual载体的Pp10启动子下游，构建重组质粒pFBD-GP5；限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切19T-M质粒和重组质粒pFBD-GP5，将M基因克隆至PpH启动子下游，构建重组穿梭质粒pFBD-GP5-M，并进行酶切鉴定，酶切鉴定重组穿梭质粒pFBD-GP5-M电泳图如图2所示，重组质粒构建与提取方法与实施例2中相同。

实施例4重组杆状病毒穿梭载体构建

取1ng的重组穿梭质粒pFBD-GP5-M加入到刚刚冰上融化的DH10Bac感受态细胞中，轻轻混匀冰浴20min，42℃热激45s，立即冰浴5min，使用无抗生素的SOC培养基37℃震荡活化4h，取80μL均匀涂布在含卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、X-Gal(100μg/mL)、IPTG(40μg/mL)的LB蓝白斑筛选平板上，37℃倒置培养48h，挑取白色菌落进行PCR鉴定，将含有目的条带的菌液采用三线法在上述LB蓝白斑筛选平板上划线，37℃倒置培养36h后，挑取白色菌落进行PCR鉴定，选取仅含有目的条带的菌液进行扩大培养，碱裂解法提取重组杆状病毒穿梭载体质粒，命名为重组杆粒rBD-GP5-M，获得重组杆状病毒基因组。

实施例5重组杆状病毒的拯救

重组杆状病毒基因组转染SF9细胞，获得重组杆状病毒。将SF9细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁且汇合度达50％以上时，使用双无Grace昆虫细胞培养基替换原有培养基(SF900Ⅱ)。取8μLⅡ转染试剂加入到100μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀；另将3μg的重组杆粒rBD-GP5-M加入到100μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀；将稀释的重组杆粒加入到稀释后的转染试剂中，混合均匀，室温孵育20min，将混合物均匀的滴加到6孔板中。4h后弃掉转染混合物，换为添加青霉素(0.1mg/ml)、链霉素(0.1mg/ml)、10％(V:V)FBS的Ⅱ完全培养基。27℃继续培养，持续观察直至出现病毒感染征象。

待细胞出现脱落或裂解时，收集培养上清，离心去掉上清中的大分子物质，使用0.22μm低蛋白结合滤器过滤，滤出液即为第一代重组杆状病毒命名为rBDV-GP5-M。重组杆状病毒盲传至第三代，采用酶联免疫斑点实验测定第三代重组杆状病毒滴度。

实施例6Western Blot鉴定GP5蛋白和M蛋白的表达

将实施例5中剩余的细胞中加入适量的裂解液，冰上裂解15min后，制备蛋白样品。蛋白样品经12％SDS-PAGE，半干法将蛋白转印至NC膜上，5％脱脂乳室温封闭1h，分别使用Anti-GP5和Anti-Flag抗体室温孵育2h，TBST清洗NC膜8min×3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG室温孵育1h，TBST清洗NC膜10min×3次，将化学发光液ECL均匀的滴加在NC膜上，使用Amersham Imager 600进行曝光。GP5蛋白和是M蛋白的Western Blot鉴定蛋白表达图如图4所示。

实施例7IFA鉴定GP5蛋白和M蛋白的表达

接种SF9细胞至12孔板，27℃继续培养12h后，加入第三代重组杆状病毒，27℃继续培养48h，弃掉培养基，PBS清洗细胞一次，4％多聚甲醛室温固定10min，0.25％Trion X-100透化10min，1％BSA封闭1h；加入一抗(Anti-GP5和Anti-Flag混合抗体)，室温孵育2h；加入相应的FITC标记山羊抗兔或Cy3标记山羊抗属的二抗，室温孵育1h，荧光显微镜下观察荧光信号，表达情况的激光共聚焦图如图3A-3D所示，每步操作结束后均需要使用PBS清洗3次，每次5min。

实施例8GP5蛋白和M蛋白的表达分析

重组杆状病毒rBV-GP5-M以MOI＝4，接种悬浮培养密度为2.5×10⁶cells/mL，存活率95％以上的High Five细胞，分别于24h、48h、72h收集培养上清，BCA法测定蛋白浓度，定量并制备蛋白样品，Western Blot分析蛋白表达量最高的时间段，GP5蛋白和M蛋白的表达时序性的电泳图如图5所示。

实施例9纯化PRRSV VLP并进行透射电镜观察

按照实施例8中的结果，优选的按4MOI的重组杆状病毒感染High Five细胞48h。3500rpm/min，4℃离心20min，取上清，0.45μm低蛋白结合滤器过滤，20％(M:V)蔗糖垫35000rpm，4℃离心2h，使用2mL PBS重悬沉淀，进行20-40-60％(M:V)蔗糖密度梯度离心，缓慢取出40-60％蔗糖层之间的乳白色环状部分，使用PBS稀释至40mL，35 000rpm/min，4℃离心2h，去掉蔗糖，使用适量PBS重悬沉淀，获得PRRSV-1病毒样颗粒(PRRSV-1VLPs)，对其进行1％磷钨酸负染，透射电镜观察PRRSV VLPs的结构，PRRSV-1VLPs透射电镜照片图如图6所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种PRRSV-1病毒样颗粒，其特征在于包括：

PRRSV LV结构蛋白GP5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

PRRSV LV基质蛋白M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述病毒样颗粒表面同时包含PRRSV LV基质蛋白M以及PRRSV LV结构蛋白GP5。

2.如权利要求1所述的PRRSV-1病毒样颗粒，其特征在于，

所述PRRSV LV结构蛋白GP5的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.如权利要求1所述的PRRSV-1病毒样颗粒，其特征在于，

所述PRRSV LV基质蛋白M的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.猪繁殖和呼吸障碍综合症疫苗，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的PRRSV-1病毒样颗粒和佐剂。

5.制备权利要求1所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其特征在于包括以下步骤：

分别克隆PRRSV LV株中表达GP5蛋白和基质蛋白M的基因；

将表达GP5蛋白和基质蛋白M的基因克隆至杆状病毒穿梭载体上，获得重组杆状病毒穿梭载体；

将所述重组杆状毒穿梭病载体转化至DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒基因组；

将所述重组杆状病毒基因组转染SF9细胞，获得重组杆状病毒；

将所述重组杆状病毒感染High Five细胞，获得所述PRRSV-1病毒样颗粒。

6.如权利要求5所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其特征在于，

所述克隆PRRSV LV株中表达GP5蛋白基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求5所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其特征在于，

所述表达基质蛋白M的基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.如权利要求7所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其特征在于，

所述M的基因的引物上游扩增引物中添加如SEQ ID NO.5所示的syn21序列；

所述M的基因的引物下游扩增引物中添加如SEQ ID NO.6所示的Flag序列。

9.如权利要求5所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其特征在于还包括对所述PRRSV-1病毒样颗粒采用蔗糖垫超速离心法和蔗糖密度梯度离心法纯化步骤。

10.如权利要求5所述的PRRSV-1病毒样颗粒的方法，其特征在于，

所述重组杆状病毒培养，获得第三代重组杆状病毒，并感染High Five细胞。