CN109718373B - 近红外光下可解聚的纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种近红外光下可解聚的纳米制剂及其制备方法和应用。该纳米制剂的制备方法包括如下步骤：将含有荧光分子的油相与含有阿霉素羟乙基淀粉偶联物的水相混合，乳化得乳液，除杂，冻干，溶解在水相中即得；所述纳米制剂中所述荧光分子的载药量大于7.5wt％。本发明提供的制备方法简单，得到的纳米制剂中纳米粒子粒径为100～1000nm，纳米制剂在近红外光照射5～15分钟过程中，粒径由100～1000纳米减小至5～80纳米，本发明提供的纳米制剂在近红外光照后，相对于不解聚的纳米粒和游离的阿霉素，展现出更好的肿瘤深部穿透效果。

Description

近红外光下可解聚的纳米制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物制剂领域，更具体地，涉及一种近红外光下可解聚的纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，纳米药物在输送化疗药物治疗肿瘤中发挥了突出的作用。例如已经上市的用于治疗实体瘤的纳米药物“Doxil”(粒径大约是100nm的阿霉素PEG脂质体)和“Abraxane”(粒径大约是130nm的紫杉醇白蛋白纳米粒)这两种纳米药物可以通过EPR效应(提高渗透与保留效应)，提高在肿瘤部位的蓄积，降低正常组织的毒副作用。然而，尽管纳米药物改善了化疗药物的长循环特性，降低了毒副作用。这些纳米药物在改善病人的生存率方面效果有限。纳米药物临床疗效有限的原因主要归咎于肿瘤血管异常，肿瘤组织间压力较高，以及肿瘤具有致密的细胞外基质。这些原因阻碍了纳米药物的深部穿透，进而制约了纳米药物的抗肿瘤作用。另一方面，更小的纳米粒表现出更好的肿瘤深部穿透效果，但是小的纳米粒子的通常长循环较差，更容易被清除。因此，一个理想的纳米药物是能够在体内循环的过程中拥有较大的粒径，使其能够有更好的长循环和肿瘤部位被动靶向效果。一旦纳米药物进入肿瘤组织，纳米药物尺寸能够变小，有助于它抵达肿瘤深部并杀伤深部肿瘤。

目前已经发展了多种策略用于纳米药物在肿瘤部位减小粒径，用于深部穿透杀伤肿瘤。例如一研究小组制备了一种MMP-2(基质金属蛋白酶-2)敏感解聚的纳米凝胶G-AuNP-DOX-PEG(金纳米凝胶-阿霉素-聚乙二醇)。在MMP-2作用下，24小时内，G-AuNP-DOX-PEG的粒径由大约200纳米减小至60纳米，体现出较好的肿瘤深部穿透效果。然而，该纳米凝胶解聚响应时间过长，蓄积在肿瘤部位的纳米凝胶容易逃逸并再次进入血液循环，从而减少肿瘤细胞对纳米凝胶的摄取；另一研究学者制备了一种共包载多西他赛的和螺吡喃的纳米粒，该纳米粒在紫外光(365nm)照射下，粒径由100纳米减小至50纳米，同时伴随多西他赛加速释放。然而，紫外光无法穿透皮肤，限制了该方法对体内实体瘤的作用。另一研究小组制备了一种肿瘤微酸环境(pH＝6.5～7.0)响应的纳米粒PEG-b-PAEMA-PAMAM/Pt(聚乙二醇-聚甲基丙烯酸乙酯-聚酰胺树状分子-铂)，该纳米粒在肿瘤组织微酸环境下粒径由80纳米减小至10纳米，体现出良好的肿瘤组织穿透效果。然而该聚合物合成过程繁琐，并且聚甲基丙烯酸乙酯具有一定毒性，不利于临床转化。因此，如何制备一种可以满足在体内快速解聚，制备方法简单且能用于肿瘤深部穿透的纳米粒，是亟待解决的难题。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种纳米制剂及其制备方法和应用。该纳米制剂在近红外光照射下能够快速解聚，制备工艺简单，解聚效率高，穿透效果好，弥补了目前不同用于肿瘤深部穿透的纳米制剂的技术缺陷。

本发明的第一目的在于提供一种纳米制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：将含有荧光分子的油相与含有阿霉素羟乙基淀粉偶联物的水相混合，乳化得乳液，除杂，冻干，溶解在水相中即得；所述纳米制剂中所述荧光分子的载药量大于7.5wt％。

使用上述制备方法制得的纳米制剂可以在近红外光照射下能够快速解聚成小纳米粒子，在近红外光照射5～15min时间内，粒径发生快速减小，由100-1000nm减小至5-50nm，有利于该纳米制剂在制成纳米药物时抵达肿瘤深部并杀伤深部肿瘤，提高药物的有效性。其中，本发明中近红外光波长优选为790nm-900nm，功率为0.5w/cm²～3w/cm²。

在本发明一个优选实施方式中，所述纳米制剂中所述荧光分子的载药量为8wt％～40wt％，优选为10～25wt％，进一步优选为10～20wt％。

在本发明一个优选实施方式中，含有荧光分子的油相与含有阿霉素羟乙基淀粉偶联物的水相的体积比大于10:100，优选为(12～30):100，进一步优选为(15～25):100。

在本发明一个优选实施方式中，荧光分子为吲哚菁绿、异硫氰酸、DIR中的一种或者多种，优选为吲哚菁绿。

其中，油相中溶剂可以为氯仿和/或甲醇，优选为氯仿和甲醇，所述氯仿和甲醇的体积比优选为1:(1～5)，进一步优选为1:4。

在本发明一个优选实施方式中，所述含有荧光分子的油相中荧光分子的浓度为1～10mg/mL，优选为1～5mg/mL。

在本发明一个优选实施方式中，阿霉素羟乙基淀粉偶联物由以3,3’-二硫代二丙酸作为连接臂，通过酯键和酰胺键阿霉素侧联至羟乙基淀粉上形成。

其中，阿霉素羟乙基淀粉偶联物具有如式(I)的结构：

其中，R为H或CH₂CH₂OH。

在本发明一个优选实施方式中，上述阿霉素羟乙基淀粉偶联物中阿霉素的取代度为2～20％，优选为5～10％，进一步优选为5～7％。

其中，上述阿霉素羟乙基淀粉偶联物中羟乙基淀粉分子量优选为25～480kDa，羟乙基取代度优选为0.4～0.6。优选地是，所述阿霉素羟乙基淀粉偶联物中羟乙基淀粉分子量为40～50kDa，羟乙基取代度为0.5。

在本发明一个优选实施方式中，本发明的阿霉素羟乙基淀粉偶联物的制备方法包括如下步骤：

(1)将羟乙基淀粉与3,3’-二硫代二丙酸在二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶存在的条件下反应生成羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯；

(2)将步骤(1)获得的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯与阿霉素在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺存在的条件下反应生成上述阿霉素羟乙基淀粉偶联物。

其中，羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯制备具体包括以下步骤，即步骤(1)具体优选包括以下步骤：

1)溶解3,3’-二硫代二丙酸单酯：用无水二甲亚砜溶解3,3’-二硫代二丙酸单酯，随后加入二环己基碳二亚胺和2,4-二甲氨基吡啶，进行羧基活化反应，在室温下搅拌2～4小时后得到端羧基活化的3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液；

2)溶解羟乙基淀粉：氦气保护条件下，在50～70℃下将羟乙基淀粉充分溶解于无水二甲亚砜中，得到羟乙基淀粉的二甲亚砜溶液；

3)酯化反应：将步骤1)得到的端羧基活化的3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液与步骤2)得到的羟乙基淀粉的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40～80℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物；

(4)纯化：将上述共聚物混合物使用去离子水溶液进行共透析1-5天，除去未反应的二环己基碳二亚胺和2,4-二甲氨基吡啶、3,3’-二硫代二丙酸单酯以及DMSO溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体在温度为-20～-25℃条件冷冻3～5h，然后放入温度为-40～-60℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯共聚物冻干粉；即为羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯。

在本发明一个优选实施方式中，上述步骤(2)具体优选包括以下步骤：

1)端羧基活化的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯：用无水二甲亚砜溶解步骤(1)得到的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯，加入1-羟基苯并三氮唑和N-N’-二环己基碳二亚胺，进行羧基活化反应，在室温下搅拌2～4小时后得到端羧基活化的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液；

2)溶解阿霉素：氦气保护条件下，常温下将阿霉素充分溶解于无水二甲亚砜中，得到阿霉素的二甲亚砜溶液；

3)酰化反应：将步骤1)得到的端羧基活化的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液与步骤2)得到的阿霉素的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40～80℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物；

4)纯化：将上述共聚物混合物使用去离子水溶液进行共透析1-5天，除去1-羟基苯并三氮唑、N-N’-二环己基碳二亚胺，羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯以及DMSO溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体在温度为-20～-25℃条件冷冻3～5h，然后放入温度为-40～-60℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的阿霉素羟乙基淀粉偶联物冻干粉，即为阿霉素羟乙基淀粉偶联物。

进一步地，透析过程中，透析袋分子量为3500Da～24000Da，冷冻温度优选为-20℃，冷冻时间优选为4h；冷冻干燥温度优选为-50℃。

在本发明一个优选实施方式中，“溶解在水相中”具体为将冻干得到的纳米粒溶解在水相溶剂中，控制纳米粒的浓度为0.001～10mg/mL，即得本发明更优选的纳米制剂。

其中，可以使用旋转蒸发仪快速蒸干乳液中的有机溶剂，得到包载荧光分子的阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米粒水相溶液，并将该水相溶液透析1～3d，除去未包载的荧光分子，以实现除去乳液中溶剂和杂质的目的。其中，上述水相溶剂可以为去离子水、生理盐水、PBS缓冲液、胎牛血清蛋白溶液、小鼠血清蛋白溶液中的一种或者几种，优选为去离子水。其中，纳米粒的浓度优选为0.1～1mg/mL。

其中，本发明的含有阿霉素羟乙基淀粉偶联物的水相中的水相溶剂也可以为去离子水、生理盐水、PBS缓冲液、胎牛血清蛋白溶液、小鼠血清蛋白溶液中的一种或者几种，优选为去离子水。

其中，乳化优选在冰浴条件下超声乳化。

本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的纳米制剂。

由上述制备方法得到的纳米制剂中纳米粒子的粒径在100～1000纳米之间，在近红外光照射下，可以解聚得到的小粒径纳米粒5～80纳米，具有肿瘤深部穿透的效果。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法或由上述制备方法得到的纳米制剂在制备用于穿透肿瘤深部的药物中的应用。

本发明的纳米制剂可以适用于所有肿瘤的深部穿透，尤其适用于肝癌，更适用于H22肿瘤细胞。

本发明提供的制备方法简单，得到的纳米制剂中纳米粒子粒径为100～1000nm，纳米制剂在近红外光照射5～15分钟过程中，粒径由100～1000纳米减小至5～80纳米，本发明提供的纳米制剂在近红外光照后，相对于不解聚的纳米粒和游离的阿霉素，展现出更好的肿瘤深部穿透效果。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的阿霉素羟乙基淀粉偶联物的红外图；

图2为本发明实施例1制备的阿霉素羟乙基淀粉偶联物的核磁共振氢图；

图3为本发明实施例2制备的吲哚菁绿载药量12.5％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒的电镜图和粒径分布图；

图4为本发明实施例3制备的吲哚菁绿载药量17.1％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒的电镜图和粒径分布图；

图5为本发明实施例4制备的吲哚菁绿载药量19.4％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒的电镜图和粒径分布图；

图6为本发明实验例1中利用载药量12.5％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒近红外光照射解聚后，在H22细胞球上的穿透效果图；

图7为本发明实验例2中利用载药量12.5％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒在H22荷瘤小鼠肿瘤组织中穿透效果图；

图8为本发明实验例2中各组别在H22小鼠皮下瘤的穿透效果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例，用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。

本发明中使用的原料组分均可市购获得，本发明实施例所用试剂均为化学纯。

实施例1

本实施例提供了一种阿霉素羟乙基淀粉偶联物，其中，羟乙基淀粉分子量为40kDa，所述的羟乙基取代度为0.5。该阿霉素羟乙基淀粉偶联物的制备方法包括如下步骤：

(1)溶解3,3’-二硫代二丙酸单酯：用无水二甲亚砜溶解3,3’-二硫代二丙酸单酯，随后加入二环己基碳二亚胺和2,4-二甲氨基吡啶，进行羧基活化反应，在室温下搅拌2小时后得到端羧基活化的3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液。

(2)溶解羟乙基淀粉：氦气保护条件下，在50℃下将羟乙基淀粉充分溶解于无水二甲亚砜中，得到羟乙基淀粉的二甲亚砜溶液。

(3)酯化反应：将步骤(1)得到的羧基活化的3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液与步骤(2)得到的羟乙基淀粉的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40℃条件下发生酯化反应24h，纯化后得到共聚物混合物。

(4)纯化：将上述共聚物混合物使用去离子水溶液进行共透析1-5天，除去未反应的二环己基碳二亚胺和2,4-二甲氨基吡啶、3,3’-二硫代二丙酸单酯以及DMSO溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体在温度为-25℃条件冷冻3h，然后放入温度为-60℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯共聚物冻干粉，即为羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯。

(5)端羧基活化的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯：用无水二甲亚砜溶解羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯，随后加入1-羟基苯并三氮唑和N-N’-二环己基碳二亚胺，进行羧基活化反应，在室温下搅拌2～4小时后得到端羧基活化的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯。

(6)溶解阿霉素：氦气保护条件下，常温下将阿霉素充分溶解于无水二甲亚砜中，得到阿霉素的二甲亚砜溶液。

(7)酰化反应：将步骤(5)得到的羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯溶液与步骤(6)得到的阿霉素的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物。

(8)纯化：将步骤(7)得到的共聚物混合物使用去离子水溶液进行共透析1-5天，除去1-羟基苯并三氮唑、N-N’-二环己基碳二亚胺，羟乙基淀粉-3,3’-二硫代二丙酸单酯以及DMSO溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体在温度为-25℃条件冷冻3h，然后放入温度为-60℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的阿霉素羟乙基淀粉偶联物冻干粉；即为阿霉素羟乙基淀粉偶联物。

采用红外光谱和核磁共振氢谱确认实施例制备的阿霉素羟乙基淀粉偶联物的化学结构。

图1和图2为本发明实施例1制备的阿霉素羟乙基淀粉偶联物的红外光谱和核磁共振氢谱图。由图1可知，与羟乙基淀粉的红外光谱相比，阿霉素羟乙基淀粉偶联物的红外吸收在1575cm^-1和1286cm^-1出现了新的吸收峰，分别归属于阿霉素芳环骨架的伸缩振动峰和反应生成的酰胺键中C-N伸缩振动峰。这些新出现的吸收峰证明阿霉素被成功的偶联至羟乙基淀粉上。

由图2可知，与羟乙基淀粉的核磁谱图相比，阿霉素羟乙基淀粉偶联物在1.0～1.4ppm和7.6～8.0ppm处出现了新的峰，分别对应于阿霉素的甲基氢的峰和阿霉素芳香氢的峰。根据核磁共振波谱图确认了本实施例1制备的阿霉素羟乙基淀粉偶联物化学结构的正确。

采用紫外分光光度法检测阿霉素羟乙基淀粉偶联物中的阿霉素的载药量。阿霉素羟乙基淀粉偶联物称重测得质量W₁，通过紫外分光光度法测得阿霉素羟乙基淀粉偶联物中阿霉素的质量W₂，载药量采用公式W₁(％)＝W₂/W₁×100％

实施例1计算为5.5wt％。

实施例2

本实施例提供了一种吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂，制备方法如下：

(1)将吲哚菁绿溶解于氯仿与甲醇共混(体积比为1:4)的有机溶剂，得到吲哚菁绿浓度为1mg/mL的油相，将实施例1得到的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物溶解在水中得到水相；

(2)将油相与水相以体积比15:100共混，共混后在冰浴条件下超声乳化，得到超声后的乳液；

(3)利用旋转蒸发仪快速挥干有机溶剂，得到包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米粒；

(4)将包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒透析1-3天，除去未包载的吲哚菁绿，剩余的包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒冻干得到纳米粒干粉。

(5)将纳米粒溶解在去离子水中，控制纳米粒的浓度为0.1mg/mL，得到吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂。

本实施例提供的纳米制剂中吲哚菁绿的载药量为12.5wt％，该纳米制剂在近红外(近红外光波长为808nm，功率为1w/cm²)光照射5min时间内，粒径发生快速减小，由125.2nm减小至8.7nm。

图3为本实施例载药量12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂近红外光照前和近红外光照后的电镜图和粒径分布图，可以看到，在近红外光照前，纳米制剂为125.2纳米大小的球形纳米粒，近红外光照后，纳米粒解聚为8.7纳米大小的纳米粒，验证了近红外光照解聚策略的可行性。

实施例3

本实施例提供了一种吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂，制备方法如下：

(1)将吲哚菁绿溶解于氯仿与甲醇共混的有机溶剂，得到吲哚菁绿浓度为1mg/mL的油相，将实施例1得到的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物溶解在水中得到水相；

(2)将油相与水相以体积比20:100共混，共混后在冰浴条件下超声乳化，得到超声后的乳液；

(3)利用旋转蒸发仪快速挥干有机溶剂，得到包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米粒；

(4)将包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒透析1-3天，除去未包载的吲哚菁绿，剩余的包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒冻干得到纳米粒干粉。

(5)将纳米粒溶解在去离子水中，控制纳米粒的浓度为0.1mg/mL，得到吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂。

本实施例提供的纳米制剂中吲哚菁绿的载药量为17.1wt％，该纳米制剂在近红外(近红外光波长为808nm，功率为1w/cm²)光照射5min时间内，粒径发生快速减小，由423.5nm减小至21.2nm。

图4为本实施例载药量17.1wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂近红外光照前和近红外光照后的电镜图和粒径分布图，可以看到，在近红外光照前，可以看到，在近红外光照前，纳米制剂为423.1纳米大小的球形纳米粒，近红外光照后，纳米粒解聚为21.2纳米大小的纳米粒，验证了近红外光照解聚策略的可行性。

实施例4

本实施例提供了一种吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂，制备方法如下：

(1)将吲哚菁绿溶解于氯仿与甲醇共混的有机溶剂，得到吲哚菁绿浓度为1mg/mL的油相，将实施例1得到的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物溶解在水中得到水相；

(2)将油相与水相以体积比25:100共混，共混后在冰浴条件下超声乳化，得到超声后的乳液；

(3)利用旋转蒸发仪快速挥干有机溶剂，得到包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米粒；

(4)将包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒透析1-3天，除去未包载的吲哚菁绿，剩余的包载吲哚菁绿的5.5wt％阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒冻干得到纳米粒干粉。

(5)将纳米粒溶解在去离子水中，控制纳米粒的浓度为0.1mg/mL，得到吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂。

本实施例提供的纳米制剂中吲哚菁绿的载药量为19.4wt％，该纳米制剂在近红外(近红外光波长为808nm，功率为1w/cm²)光照射5min时间内，粒径发生快速减小，由521.5nm减小至78.4nm。

图5为本实施例载药量19.4wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂近红外光照前和近红外光照后的电镜图和粒径分布图，可以看到，在近红外光照前，纳米制剂为521.5纳米大小的球形纳米粒，近红外光照后，纳米粒解聚为78.4纳米大小的纳米粒，验证了近红外光照解聚策略的可行性。

对比例1

本对比例提供了一种吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂，制备方法与实施例2的相同，不同之处在于，步骤(2)中油相与水相的体积比为10:100。

本对比例提供的纳米制剂中吲哚菁绿的载药量为7.5wt％。

实验例1

本实验通过不同组别材料对H22肿瘤干细胞球的穿透实验，考察了载药量12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂(实施例2)在近红外光照前后，不解聚与解聚的状态下，对肿瘤球的穿透效果。

H22肿瘤干细胞球的具体穿透实验如下：

H22肿瘤干细胞采用3D软纤维蛋白胶进行筛选。H22细胞预先用RPMI 164培养基稀释至8×10³个/mL，将纤维蛋白原胶用T7缓冲液(pH 7.4,50mM Tris,150mM NaCl)稀释至2mg/mL，并与H22细胞悬液以1：1混匀。在预冷的96孔板中加入1μL凝血酶(0.1U/μL)，而后与50μL上述混合液吹打混匀。37℃条件下孵育15分钟后，加入200μL RPMI 1640培养基。待细胞克隆生长至第七天，将阿霉素组，阿霉素羟乙基淀粉偶联物组，7.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物组(对比例1)，7.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物组+近红外光照组，12.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物组(实施例2)，12.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物+近红外光照组用RPMI 1640培养基溶解(7.5wt％/12.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒+近红外光祖是预先将纳米粒用近红外光照射5min(808nm，1w/cm²)，控制每组中阿霉素浓度为5μg/mL。在每孔中加入200μL。孵育4h后用PBS洗3次后用4％多聚甲醛固定30min后用激光共聚焦显微镜成像。阿霉素则通过488nm、Em＝560nm的滤光片进行观察。获得的图片通过Image J软件进行分析。

图6为本发明载药量7.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂近红外光照前和近红外光照后的电镜图和粒径分布图，可以看到，在近红外光照前，纳米制剂为234.2纳米大小的球形纳米粒，光照后为221.6纳米大小的球形纳米粒，粒径并无较大变化。而载药量12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂近红外光照前和近红外光照后粒径由125.2纳米减小为8.7纳米。解聚现象明显。

图7为本发明不同组别在H22肿瘤干细胞球上的穿透效果。从图7中的(A)和(B)可以看到，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂在近红外光照射后，取得了显著的肿瘤深部穿透效果，肿瘤球内部及外部都有较强的阿霉素荧光，效果远强于近红外光照前没有解聚的，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂。7.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂在近红外光照射下不会发生解聚，没有体现出好的肿瘤深部穿透效果。

实验例2

建立了H22小鼠肝癌皮下瘤模型，考察了实施例2得到的12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂近红外光照后的肿瘤组织穿透效果。具体步骤如下：

实验药物的配置：阿霉素，阿霉素羟乙基淀粉偶联物，7.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米粒稀释至PBS水溶液中，控制所有的阿霉素浓度为0.5mg/mL。

随机将荷H22肝癌癌皮下瘤的小鼠分为六组，分别为A组，B组，C、D、E、F组，每组3只。分别注射阿霉素PBS溶液，阿霉素羟乙基淀粉偶联物PBS溶液，7.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒PBS溶液，7.5wt％吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物纳米粒PBS溶液，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物PBS溶液，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物PBS溶液200μL。1小时后，D组与F组分别用近红外光(808nm，1w/cm²)照射10min，4小时后，处死所有的老鼠，取出皮下瘤，冷冻切片，复染FITC偶联的血管标记物CD31，并用激光共聚焦显微镜检测阿霉素及FITC的荧光分布。FITC通过Ex＝488nm、Em＝520nm的滤光片进行观察，而阿霉素则通过Ex＝488nm、Em＝560nm的滤光片观察，获得的图片则用Image J软件进行分析。

图8为本发明不同组别在H22小鼠皮下瘤的穿透效果。从图8中A和B图可以看到，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂在近红外光照射后，取得了显著的肿瘤深部穿透效果，在距离血管200μm处可以观察到较强阿霉素荧光。远强于近红外光照前没有解聚的，12.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂。7.5wt％的吲哚菁绿-阿霉素羟乙基淀粉偶联物的纳米制剂在近红外光照射下不会发生解聚，材料均分布在血管周围，没有体现出好的肿瘤深部穿透效果。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种近红外光下可解聚的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将含有荧光分子的油相与含有阿霉素羟乙基淀粉偶联物的水相混合，乳化得乳液，除杂，冻干，溶解在水相中即得；所述纳米制剂中所述荧光分子的载药量为12.5～25wt％；

所述荧光分子为吲哚菁绿；

所述阿霉素羟乙基淀粉偶联物具有如式(I)的结构：

其中，R为H或CH₂CH₂OH。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相与水相的体积比为(15～25):100。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述油相中溶剂为氯仿和甲醇，所述氯仿和甲醇的体积比为1:(1～5)。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述含有荧光分子的油相中荧光分子的浓度为1～10mg/mL。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含有荧光分子的油相中荧光分子的浓度为1～5mg/mL。

6.根据权利要求1至2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述阿霉素羟乙基淀粉偶联物中阿霉素的取代度为2～20％；

和/或，所述阿霉素羟乙基淀粉偶联物中羟乙基淀粉分子量为25～480kDa，羟乙基取代度为0.4～0.6。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述阿霉素羟乙基淀粉偶联物中羟乙基淀粉分子量为40～50kDa，羟乙基取代度为0.5。

8.根据权利要求1至2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶解在水相中具体为将冻干得到的纳米粒溶解在水相溶剂中，控制纳米粒的浓度为0.001～10mg/mL，即得所述纳米制剂。

9.权利要求1至8中任一项所述的制备方法得到的纳米制剂。

10.权利要求9所述的纳米制剂在制备用于穿透肿瘤深部的药物中的应用。

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