CN109709331A - Gdf15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。本发明发现了GDF15的含量变化对肝癌的状态具有明显的相关性，通过提供能够准确检测GDF15含量的试剂盒，辅助诊断肝癌的存在、分期和转移。

Description

GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途

技术领域

本发明属于肿瘤的诊断领域，涉及GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。

背景技术

人们谈癌色变。21世纪以来，恶性肿瘤对人类健康的威胁已日趋严重。其致死率仅次于心脑血管疾病，位居第三。肿瘤患者死亡率高的主要原因是不能早期诊断，早期诊断与早期治疗是防治肿瘤与降低死亡率的最有效方法。

随着肿瘤细胞的发生，肿瘤患者体内某些蛋白质会发生变化，或产生新的与肿瘤关联的异常蛋白。这些能反应肿瘤存在的化学类物质人们总称为肿瘤标志物。肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中由于基因的表达水平的变化而生成或减少的抗原和其他生物活性物质，有的不存在于正常成人组织而仅见于肿瘤组织，有的在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量。也就是说，肿瘤标志物的存在或量变可以提示肿瘤的性质，所以肿瘤标志物的检测对肿瘤的临床治疗具有巨大的参考意义，可以应用于肿瘤的早期诊断、分期监测肿瘤进程和实时评价药物的治疗效果(ASCO，1996)。为了满足肿瘤的临床诊断和治疗的需求，对肿瘤标志物的研究及对应检测方式的开发发亟待加速。

目前，用于临床诊断的肿瘤标志物包括癌胚抗原、酶、激素、糖蛋白、癌基因和细胞表面肿瘤抗原等6大类。美国FDA批准了以下血清肿瘤标志物用于肿瘤的辅助诊断：甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特异性抗原(fPSA,tPSA)，甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)，β人绒毛膜促性腺激素(HCGb)，和人附睾分泌蛋白4(HE4)。另外其他常用于临床诊断的肿瘤标志物还包括神经原特异性烯醇化酶(NSE)，降钙素(PCT)，铁结合蛋白(Ferritin)，β2－微球蛋白(beta 2-Microglobin)，胃蛋白酶原(Pepsinogen1,2)，和催乳素(Prolactin)等。这些肿瘤标志物大多缺乏灵敏度和特异性，制约了其在肿瘤诊断中的广泛应用。对于肝癌，甲胎蛋白和超声波检查是普遍采用的诊断高危病人的方式，并且确实显著提高了肝癌病人的生存率，但灵敏度比较低；肿瘤抗原CA-125有更高的灵敏度，但却缺乏特异性。同样地，用于乳腺癌检测的血液肿瘤标志物CA15-3因灵敏度低在早期诊断中几乎没用。因此，肿瘤的早期诊断、以及良性和恶性肿瘤的区分仍然是一个临床难题，需要新的技术和方法来发现新的肿瘤标志物和提高肿瘤标志物检测的灵敏度和可信度。

GDF15是TGF-B超家族BMP亚家族中的一员，GDF15也被称为巨噬细胞抑制因子1，前列腺衍生因子，胎盘骨形态形成蛋白，胎盘转化生长因子等。GDF15广泛分布于哺乳动物组织，GDF15在胎盘中相对高表达，乳腺，前列腺上皮细胞，肺，肝，胃肠道，胰腺，肾脏中低表达。静息细胞中GDF15的表达水平通常较低，GDF15的表达会补多种细胞应激信号所激活，如缺氧，炎症，短波长光照，急性组织损伤，肿瘤发生等。GDF15是一个重要的心血管保护因子。作为新的标记物，GDF15水平与多种心血管疾病的诊断、危险分层和预后判断有密切关系。在黑色素瘤，胃癌，结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，乳腺癌，头颈鳞癌中均可见GDF15表达水平增高的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，提供一种GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。

优选地，GDF15为包含SEQ ID NO：2的多肽片段或SEQ ID NO：2中一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。

优选地，GDF15为包含SEQ ID NO：3的多肽片段。

根据本发明的另一个方面，提供一种用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于，包括：反向蛋白芯片酶标板，用于包被来自待测样品的破碎的微量组织或细胞；检测抗体，其为生物素化抗GDF15的单克隆抗体或者基因工程抗体；GDF15标准品，其为包含SEQID NO:2的多肽片段或SEQ ID NO:2中的一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。

优选地，GDF15标准品为包含SEQ ID NO：3的多肽片段。

优选地，多肽片段的纯度大于95％。

优选地，检测抗体为生物素化抗GDF15的单克隆抗体，浓度为0.1mg/L。

优选地，检测抗体为基因工程抗体scFv、Fab、Fab′和/或F(ab′)2。

优选地，标准品包被在采用聚苯乙烯制作的酶标板上。

优选地，待测样品取自人类血液。

本发明通过系统的筛选得出能够可靠地反映肝癌状态的标志物，基于GDF15在肝癌样品中的平均表达水平远远高于健康样品及其与肿瘤的恶性程度的相关性，以GDF15作为检测目标，据此对肝癌进行的预测、诊断、分期、监测等均能达到较高的灵敏度、特异度和精确度。本发明对GDF15标准品进行氨基酸序列编辑，采用由此得到的重组蛋白作为检测GDF15的标准品，使标准品具有良好的稳定性、亲合力和溶解性，更加容易包被在酶标板上，其与特异性抗体的结合能力更强。使用本发明提供的标准品校准测定样品中的GDF15的浓度标准曲线，能够准确地实现GDF15的定量检测。

附图说明

图1为实施例1中肝癌标志物的筛选流程图；

图2为实施例1中训练组的17种因子的ROC曲线图；

图3为实施例1中17种因子的交叉验证示意图；

图4为实施例1中训练组的6种因子的ROC曲线图；

图5为实施例1中6种因子的交叉验证示意图；

图6为实施例2中反向蛋白芯片分别检测β2-微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白的点样分布及点样结果示意图；

图7为实施例2的肝癌样品和健康样品中的GDF15含量对比图；

图8为不同GDF15标准品检测样本中的GDF15的效果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

GDF15的表达水平可以通过直接或间接的手段反映，如化学发光法、时间分辨免疫法和免疫印迹法等，实施例1～4将以抗原抗体反应为原理，通过ELISA法和吸光度测试配合测定GDF15的浓度。

实施例1肝癌标志物的筛选

本实施例的实验志愿者包括癌症患者、其他癌症患者和健康人群，肝癌标志物的筛选流程参照图1所示。基于ELISA法，使来自实验志愿者提供的血清样品充分接触包被有针对274个血清标记物的抗体的抗体芯片，对抗体芯片测试结果进行人工神经网络分析。设置78个肝癌样本、40个其它癌症样本以及80个健康样本，对抗体芯片提供的数据进行归一化处理。采用相关标准品得出目标因子的标准品曲线，根据标准品曲线测定蛋白浓度。由此发现，有21种因子在肝癌样本中的含量明显有别于在其他癌症样本和健康样本中的含量。根据P值<0.01的要求，从中选择符合该要求的17种因子进行统计建模。这17个因子是AFP,GDF15,CEACAM1,MMP9,GP73,B2M,IGFBP3,ACRP30,Ferritin,Axl,LYVE-1,Fas,DKK-1,HGF,IL8,FGF9,Nidogen1。综合筛选出的17个因子，分别采用逻辑回归(LR)、线性判别分析(LDA)、随机森林(RF)和支持向量机(SVM)4组模型评价选中因子的灵敏度，特异度及准确率。

本实施例采用了留一交叉验证筛选方法(leave-one-out cross-validationapproach)：每一回合把样本N分成训练组N-1和预测组1，就会得到N个模型,用N个模型最终的预测组的分类准确率的平均数作为此下分类样本的性能指标。此筛选方法的优点是每一回合中几乎所有的样本皆用于训练模型，因此最接近原始样本的分布，这样评估所得的结果比较可靠；实验过程中没有随机因素会影响实验数据，确保实验过程是可以被复制的。从训练组得出模型，再采用预测组进行验证。从图2可以看出根据上述4种模型采集关于训练组的17种因子的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下的面积接近1，准确率高。我们继续减少模型的因子数量来测试，从16种因子到2种因子，观察到β2微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白这6种因子的准确率与17种因子相当，6种因子的ROC曲线(如图4所示)下的面积也接近1，17种因子和6种因子交叉验证的精确度和KAPPA值如图3、5所示。对比表1和表2提供的数据，表格中的灵敏度、特异度和精确度都很接近1，说明受试样本中17种因子和6种因子的检测结果能够正确地识别区分肝癌的患者与非患者，据此对实验者进行肝癌状态的诊断具有较高的可靠性。

表1 17种因子模型的性能评估

表2 6种因子模型的性能评估

实施例2反向蛋白芯片验证6种因子的检测效果

反向蛋白芯片的操作步骤如下：

样品处理：对实验者提供的血清样品采用适当缓冲液及连续稀释处理。

标准品制备：将β2-微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白这6种因子重组蛋白配制成浓度为100g/ml(原液)，按照各个因子标准曲线的起始浓度按照不同1/3倍数稀释5次，设置空白对照。

膜片制备：将稀释的血清样品，标准品，阳性对照及空白对照点样到膜片。800cw-Streptavidin作为阳对照，含有1％BSA的PBS缓冲液作为阴性对照。点样后，将膜片自然干燥并储存于-80℃。膜片检测：将玻片平衡至室温后，用封闭缓冲液孵育30分钟；加入生物素标记抗体溶液孵育2个小时；加入1×800cw-conjugated streptavidin(用blockingbuffer稀释8000倍)，室温孵育2h；洗涤后由Genepix 4000B激光扫描仪在532nm下进行扫描。

采用ImageQuant LAS4000化学发光成像分析系统扫描

1)扫描仪器：ImageQuant LAS4000Scanner

2)品牌：美国GE公司(GE Healthcare Corporate)

3)产地：USA

4)扫描参数：high resolution

采用仪器自带分析软件提取数据，采用IBM SPSS分析软件来进行数据分析。

通过数据分析如图6，得知6个因子具有显著性差异(P<0.05)。

针对肝细胞癌患者与健康人的血清样本中的β2-微球蛋白进行了检测。如图7所示，肝细胞癌患者血清样品中的GDF15蛋白的平均表达水平远远高于健康组。通过数据分析，得知GDF15蛋白具有显著性差异(P<0.05)。

试剂来源信息：

名称	公司	检测抗体	抗原起始浓度
				IGFBP3	raybiotech	102-17505	200000pg/ml
GDF15	raybiotech	144-00185	2000pg/ml
				β2M	raybiotech	DS-MB-00113	10000pg/ml
OPN	raybiotech	119-15527	1000000pg/ml
				GP73	raybiotech	130-10311	10000pg/ml
AFP	raybiotech	DS-MB-00070	1000pg/ml

实施例3稳定的GDF15标准品的制备

GDF15是由308个氨基酸组成的蛋白，其全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，包含2个外显子和1个内含子。GDF15蛋白前体含29个氨基酸的信号肽，在蛋白水解过程中N末端的信号肽序列被切除，以二硫键连接成二聚体剪切后分泌到细胞外介质中。使用GDF15标准品校准可以测定GDF15浓度的标准曲线，获取GDF15标准品的来源可以是肿瘤病人的血样，也可以是基因重组表达，GDF15标准品可选自纯度大于95％的：GDF15蛋白、重组GDF15蛋白、包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的全长或片段或其与其他基团相偶联的复合物以及其他衍生物。选择溶解度大的GDF15标准品有利于实验数据的获取。GDF15浓度的标准曲线通过使用已知浓度的GDF15标准品，用ELISA方法测定的浓度和吸光度测定值的对应曲线。

大量的研究发现，由于原核重组表达的蛋白缺乏糖基化，其稳定性较天然蛋白更差。而且，在纯化重组蛋白过程中得到不溶的包涵体，不易与特异性抗体结合。目前，在市面上流通的GDF15校准品普遍存在稳定性不佳的问题。

然而，本发明人经过抗原表位设计实验，发现突变了SEQ ID NO:2序列中一个或者两个氨基酸得到的多肽片段，其肽链结构相对稳定，有利于其与GDF15特异性抗体的结合。此外，突变了的多肽片段具有更好的亲合力，比重组蛋白的更容易包被在酶标板上。如图6所示，采用标准品GDF15重组蛋白抗原的第一梯度STD1扫描孔出现弥散现象，导致后续计算误差增大。因此制备测试GDF15蛋白指标的酶免试剂盒，必须选择适合的标准品。

本实施例选取了SEQ ID NO:1的第30位氨基酸至第46位氨基酸的序列(SEQ IDNO:2)，并使SEQ ID NO:2的第12位脯氨酸(Pro)突变为极性氨基酸赖氨酸(Lys)，得到的的氨基酸序列是LSLAEASRASFKGPSEL，标记为SEQ ID NO:3，由上海吉尔生化合成。

实施例4定量检测肝癌标志物的试剂盒

定量检测肝癌标志物的试剂盒，试剂盒的组成如下：

1.ELISA酶标板：采用吸附性能好，空白值低，批次稳定的聚苯乙烯板包被捕获抗体，预先用封闭液处理。

2.检测抗体：针对β2-微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白的特异性抗体，可选自单克隆抗体或其抗原结合片段，例如scFv、Fab、Fab′和F(ab′)2。本实施例的检测抗体稀释浓度为0.1mg/L。

3.洗涤液：含0.1％Tween 20的20X浓缩洗涤液。

4.标准品，包括：β2-微球蛋白标准品、IGFBP3蛋白标准品、GP73蛋白标准品、GDF15蛋白标准品、OPN蛋白标准品和AFP蛋白标准品，其中GDF15蛋白标准品为含95％纯度的SEQID NO：3多肽片段标准品抗原干粉。

5.稀释液A:用于稀释样本的15ml 5X浓缩稀释液(0.02mol/LpH7.4的PBS，0.05％Tween-20)

6稀释液B:用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml 5X浓缩稀释液7.200μl300X浓缩HRP-链亲和素溶液。

8.底物：12ml TMB溶液。

9.终止液：8ml浓度为0.2M的硫酸溶液。

10.目标检测蛋白：血浆或血清中的β2-微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白，指存在于血液中的非细胞内和细胞表面的上述6种蛋白，它们可单独游离存在，也可以与其他血液中的细胞外蛋白相结合的形式存在。

本实施例提供的定量检测肝癌标志物的试剂盒的使用方式如下：

(1)加入用稀释液梯度稀释的标准品与待检测的血清样品，每个样品做两个重复，每孔加100μl，37℃反应40分钟；

(2)配置1×洗涤液于洗板机上洗板5次共10分钟；

(3)将稀释液B加入生物素化的检测抗体和HRP-链亲和素混匀，加入微孔板中孵育40分钟；

(4)再次洗涤并加入底物反应10分钟，加入终止液显色，于酶标板上读数，根据读数计算标准曲线，可以得出读数与标准品之间的线性关系，将样品的OD值代入线性公式得出样品的含量。

上述整个过程不超过2个小时。

对比实施例

作为与实施例4的对照，设置一个试剂盒，以纯度为95％的SEQ ID NO：1重组蛋白标准品抗原干粉作为GDF15标准品，其余设置和操作步骤均与实施例2一致。取来自健康组实验志愿者和来自肝癌组实验志愿者提供的血清样本，利用实施例4和本对比实施例的试剂盒进行检测。结果表明两种试剂盒都能够通过对β2-微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白的检测而显著区分健康组和肝癌组，具体地，GDF15蛋白检测结果如图8所示。

本发明以GDF15作为肝癌标志物，设计了一种能够准确定量地检测GDF15的抗体芯片试剂盒，为肝癌的预测、诊断、分期、监测提供了一种可靠、便捷的方法。除了作为肝癌标志物，GDF15可通过优化用于检测如肺癌、胃癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、淋巴癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、白血病、恶性黑素瘤、肉瘤、肾癌、胆癌等肿瘤。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 广州瑞博奥生物科技有限公司

<120> GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu

1 5 10 15

Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu

20 25 30

Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser

35 40 45

Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu

50 55 60

Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu

65 70 75 80

Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly

85 90 95

Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu

100 105 110

Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser

115 120 125

Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln

130 135 140

Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser

145 150 155 160

Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala

165 170 175

Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg

180 185 190

Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly

210 215 220

Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys

225 230 235 240

Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln

245 250 255

Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro

260 265 270

Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr

275 280 285

Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp

290 295 300

Cys His Cys Ile

305

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu

1 5 10 15

Leu

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Glu

1 5 10 15

Leu

Claims (10)

1.一种GDF15在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述GDF15为包含SEQ ID NO：2的多肽片段或SEQ ID NO：2中一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述GDF15为包含SEQ ID NO：3的多肽片段。

4.一种用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于，包括：

反向蛋白芯片，用于包被来自待测样品的破碎的微量组织或细胞；

检测抗体，其为生物素化抗GDF15的单克隆抗体或者基因工程抗体；

GDF15标准品，其为包含SEQ ID NO:2的多肽片段或SEQ ID NO:2中的一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。

5.如权利要求4所述用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于：所述GDF15标准品为包含SEQ ID NO：3的多肽片段。

6.如权利要求4所述用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于：所述多肽片段的纯度大于95％。

7.如权利要求4所述用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于：所述检测抗体为生物素化抗GDF15的单克隆抗体，浓度为0.1mg/L。

8.如权利要求4所述用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于：所述检测抗体为基因工程抗体scFv、Fab、Fab′和/或F(ab′)2。

9.如权利要求4所述用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于：所述标准品包被在采用聚苯乙烯制作的酶标板上。

10.如权利要求4所述用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于：所述待测样品取自人类血液。