CN109709259B - 一种玉叶金花的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉叶金花的鉴别方法。通过显微镜观察，根据显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性分析；采用《中国药典》2015年版通则进行玉叶金花水分、总灰分和浸出物的测定。本申请创造性采用了叶表皮制片方法，利用显微鉴别法观察玉叶金花叶表观特征和粉末特征，根据其特征有效和准确的鉴定玉叶金花；建立了专属性强、稳定可靠的薄层色谱方法鉴定玉叶金花，关键在于供试品和对照品药材溶液制备和薄层色谱展开，最终将供试品与对照药材色谱进行比较，从而鉴定玉叶金花真伪，鉴定结果准确率高。

Description

一种玉叶金花的鉴别方法

技术领域

本发明属于中药鉴定技术领域，尤其涉及一种玉叶金花的鉴别方法。

背景技术

玉叶金花，别称白纸扇、白蝴蝶、百花茶、蝴蝶藤、黄蜂藤等，原植物拉丁学名：MussaendaPubescensAit.f.，为茜草科玉叶金花属攀援灌木。玉叶金花是贵州省常用民间药物，也为苗族常用药。其入药部位为玉叶金花MussaendaPubescensAit.f.的干燥地上部位。玉叶金花味甘、微苦，性凉，具有清热解毒，祛风利湿的功能，可用于感冒，中暑，肠炎，肾炎水肿，咽喉肿痛，支气管炎。现代药理研究发现玉叶金花具有终止妊娠作用、抗病毒作用、抗胆碱作用、解毒作用、抗炎、镇痛及抗菌等作用。玉叶金花常野生于丘陵山坡、灌丛、林缘、沟谷、山野、路旁等地，是一种具有观赏和药用等多种价值的植物，具有良好的使用价值，为了保障该类药材的药效和用药安全，建立完善的真伪鉴定方法至关重要。《湖南省中药材标准》（2009年版）和《广西省中药材标准》（1990年版）虽收载了玉叶金花，鉴定方法多为理化鉴定，有待进一步完善。走访发现玉叶金花是贵州省常用民间药物，也为苗族常用药物，当地民间习以玉叶金花地上部分入药，但是贵州省无相关玉叶金花的标准记载，也没有相关玉叶金花的具体鉴定方法，阻止了贵州省民族药发展。

据报道玉叶金花含有多种化学成分，包括β-谷甾醇、β-谷甾醇-D葡萄糖苷、乌苏酸、咖啡酸、对-羟基桂皮酸、阿魏酸、山栀子苷甲酯、玉叶金花苷酸甲酯、单萜类化合物和三萜类化合物。因此本研究基于其化学成分类群的基础上，建立薄层色谱鉴别方法，此外还建立了显微鉴别方法，对其叶上下表皮和药材粉末进行真伪鉴定，两种方法结合能有效鉴别玉叶金花真伪，能为玉叶金花的质量控制提供参考依据。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种玉叶金花的鉴别方法。本申请创造性采用了显微法和薄层色谱法，给出了玉叶金花有效的定性鉴定方法，通过该方法能够对玉叶金花供试品进行客观鉴定，鉴定结果准确率高。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种玉叶金花的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.3～0.7g，加乙酸乙酯4～6ml，超声处理18～23min，滤过，取滤液作为供试品溶液；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.3～0.7g，加乙酸乙酯4～6ml，超声处理18～23min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各2～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定。

在步骤（1）中，所述玉叶金花叶表皮制片有如下三种方法：

①第一种是直接将干燥的叶片放入水中浸泡，使其变软，撕取叶上下表皮置于载玻片上，直接水装封片或加水合氯醛溶液加热透化，再加稀甘油封片，在显微镜下观察，拍照记录实验结果；

②第二种方法是直接取干燥的玉叶金花叶片，置于磨刀石（或具有磨刀石相当作用的其他工具）上从一侧开始磨（取上、下表皮分别从相反方向磨），直至将叶肉等组织磨去，撕取透明的叶表皮置于载玻片上，直接水装封片或加水合氯醛溶液加热透化，再加稀甘油封片，在显微镜下观察，拍照记录实验结果；

③第三种方法是将叶片放入水中浸泡，变软后，将其用双面胶固定于具有弧形面便于手握住易操作的固体上，然后用刀片徒手切片，将表皮切下置于载玻片上，直接水装封片或加水合氯醛溶液加热透化，再加稀甘油封片，在显微镜下观察，拍照记录实验结果。上述给出的玉叶金花叶表皮制片方法克服了干燥叶片不易取表皮细胞的难点。

在步骤（1）中，所述玉叶金花药材粉末制片方法为：将玉叶金花药材粉碎，取适量粉末于载玻片上，加蒸馏水制片观察，如有观察不清楚的结构，再制备透化片，透化片的制备方法：将适量玉叶金花粉末置于载玻片上，加水合氯醛溶液适量，加热透化，再加稀甘油，封片，置于显微镜下观察，拍照记录结果。

进一步地，在步骤（1），所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见。

进一步地，在步骤（1），所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由2～9个细胞组成，表面光滑，基部直径10～35μm；导管主为具缘纹孔，直径20～90μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径15～70μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径12～50μm。

进一步地，在步骤a，所述超声处理的频率为30～50kHz，功率为230～280 W，时间为10～30 min。

进一步地，在步骤b，所述玉叶金花对照药材选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502。

进一步地，在步骤c，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材。

进一步地，所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=8.5～10:1.5～3:1.5～4混合均匀制成。

进一步地，在步骤c，未提及的具体薄层色谱鉴定方法按照《中国药典》2015年版四部通则薄层色谱法进行测定。

进一步地，在步骤c，所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

本申请中，玉叶金花水分、总灰分和浸出物的定量测定采用《中国药典》2015年版通则相关方法进行测定；水分的测定方法：取过二号筛的待测样品粉末2g，精密称定，按照《中国药典》2015年版通则0832水分测定法的烘干法进行测定，玉叶金花中水分含量不超过15.0%；总灰分的测定方法：取待测样品粉末2g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，允许误差为0.01g，按照《中国药典》2015年版通则2302灰分测定法进行测定，玉叶金花总灰分含量不超过8.0%；浸出物的测定方法：取取过二号筛的待测样品粉末2g，精密称定，置于100ml的锥形瓶中，精密加乙醇50ml，按照《中国药典》2015年版四部通则2201浸出物测定法中醇溶性浸出物测定法热浸法进行测定，玉叶金花醇溶性浸出物不少于5.0%。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

本申请创造性采用了叶表皮制片方法，利用显微鉴别法观察玉叶金花叶表观特征和粉末特征，根据其特征有效和准确的鉴定玉叶金花；建立了专属性强、稳定可靠的薄层色谱方法鉴定玉叶金花，关键在于供试品和对照品药材溶液制备和薄层色谱展开，最终将供试品与对照药材色谱进行比较，从而鉴定玉叶金花真伪，鉴定结果准确率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1为玉叶金花叶上表皮细胞显微结构图；

图2为玉叶金花叶下表皮细胞显微结构图；

图3为玉叶金花药材粉末显微结构图；

图4为玉叶金花薄层色谱鉴别系统适用性试验图；

图5为不同厂家薄层板对玉叶金花的展开效果图；

图6为玉叶金花不同展开湿度鉴别效果图；

图7为玉叶金花不同展开温度效果图；

图8为供试品溶液稳定性考察TLC图；

图9为批次玉叶金花薄鉴别谱图；

附图中：1-玉叶金花药材；2-玉叶金花药材；3-玉叶金花药材；4-对照药材；10-溶液配制当天；11-溶液放置1天；12-溶液放置2天；13-溶液放置3天；14-对照药材；31-叶表皮细胞；32-导管；33-石细胞；34-纤维；35-非腺毛；51-第一批次玉叶金花样品；52-第二批次玉叶金花样品；53-第三批次玉叶金花样品；54-第四批次玉叶金花样品；55-第五批次玉叶金花样品；56-第六批次玉叶金花样品；57-第七批次玉叶金花样品；58-第八批次玉叶金花样品；59-第九批次玉叶金花样品；60-第十批次玉叶金花样品；61-第十一批次玉叶金花样品；62-第十二批次玉叶金花样品；63-第十三批次玉叶金花样品；64-对照药材。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种玉叶金花的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见；所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由2个细胞组成，表面光滑，基部直径10μm；导管主为具缘纹孔，直径20μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径15μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径12μm；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.3g，加乙酸乙酯4ml，超声处理18min，滤过，取滤液作为供试品溶液；所述超声处理的频率为30kHz，功率为230 W，时间为10 min；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.3g，加乙酸乙酯4ml，超声处理18min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；所述玉叶金花对照药材选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定；在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材；所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=8.5:1.5:1.5混合均匀制成；未提及的具体薄层色谱鉴定方法按照《中国药典》2015年版四部通则薄层色谱法进行测定；所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

实施例2

一种玉叶金花的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见；所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由9个细胞组成，表面光滑，基部直径35μm；导管主为具缘纹孔，直径90μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径70μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径50μm；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.7g，加乙酸乙酯6ml，超声处理23min，滤过，取滤液作为供试品溶液；所述超声处理的频率为50kHz，功率为280 W，时间为30 min；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.7g，加乙酸乙酯6ml，超声处理23min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；所述玉叶金花对照药材选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定；在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材；所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=10:3:4混合均匀制成；未提及的具体薄层色谱鉴定方法按照《中国药典》2015年版四部通则薄层色谱法进行测定；所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

实施例3

一种玉叶金花的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见；所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由3个细胞组成，表面光滑，基部直径15μm；导管主为具缘纹孔，直径30μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径20μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径20μm；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.4g，加乙酸乙酯4.5ml，超声处理19min，滤过，取滤液作为供试品溶液；所述超声处理的频率为35kHz，功率为240 W，时间为15 min；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.4g，加乙酸乙酯4.5ml，超声处理19min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；所述玉叶金花对照药材选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定；在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材；所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=9:2:2混合均匀制成；未提及的具体薄层色谱鉴定方法按照《中国药典》2015年版四部通则薄层色谱法进行测定；所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

实施例4

一种玉叶金花的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见；所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由8个细胞组成，表面光滑，基部直径30μm；导管主为具缘纹孔，直径80μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径60μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径40μm；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.6g，加乙酸乙酯5.5ml，超声处理22min，滤过，取滤液作为供试品溶液；所述超声处理的频率为45kHz，功率为270 W，时间为25min；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.6g，加乙酸乙酯5.5ml，超声处理22min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；所述玉叶金花对照药材选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各9μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定；在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材；所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=9.5:2.5:3.5混合均匀制成；未提及的具体薄层色谱鉴定方法按照《中国药典》2015年版四部通则薄层色谱法进行测定；所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

实施例5

一种玉叶金花的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见；所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由5个细胞组成，表面光滑，基部直径25μm；导管主为具缘纹孔，直径50μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径45μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径30μm；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.5g，加乙酸乙酯5ml，超声处理20min，滤过，取滤液作为供试品溶液；所述超声处理的频率为40kHz，功率为250 W，时间为20 min；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.5g，加乙酸乙酯5ml，超声处理20min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；所述玉叶金花对照药材选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定；在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材；所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=9.3:2.3:3混合均匀制成；未提及的具体薄层色谱鉴定方法按照《中国药典》2015年版四部通则薄层色谱法进行测定；所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

为了进一步说明本发明能够达到所述技术效果，做以下实验：

一、仪器与试验材料

1、仪器：奥林巴斯CX41简易偏光显微镜及明美S60显微成像系统；REPROSTAR3薄层数码成像系统，购自瑞士CAMAG；WP-ΜP-II-20实验室超纯水机，购自四川沃特尔水处理设备有限公司；镊子、载玻片、盖玻片、酒精灯；EL204电子天平，购自瑞士METTLER；DK-98-Ⅱ型水浴锅，购自天津泰斯特有限公司。

2、化学试剂：硫酸、甲醇、乙醇、三氯甲烷、甲酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯；青岛海洋硅胶G板，购自青岛海洋化工厂分厂；烟台黄海江友硅胶G板，购自烟台黄海江友化工厂；青岛鼎康硅胶G板，购自青岛鼎康化工厂。

3、药材：玉叶金花对照药材，拉丁名为：MussaendaPubescensAit.f.，为茜草科植物玉叶金花MussaendaPubescens Ait.f.的干燥地上部分，选自中国食品药品检定研究院，批号为：121404-201502。第一至第十三批次玉叶金花待测样品来自贵州和广州，具体信息如表1所示。

表1玉叶金花待测样品信息表

经过对13批次玉叶金花的性状进行鉴别和文献调研，该药材的性状鉴别特征归纳总结如下：本品茎呈圆柱形，直径3～10mm；表面棕色或棕褐色，具细纵皱纹、点状皮孔及叶柄痕，质坚硬，不易折断，断面黄白色或淡黄绿色，髓部明显，白色；叶对生或轮生，多缩皱、破碎，完整叶片展平后呈卵状矩圆形，顶端渐尖，基部楔形，上面近无毛或被疏毛，下面密被短柔毛，有时稍疏；气微，味淡。

二、鉴别方法

对13批次玉叶金花待测样品分别进行了叶表皮、粉末的显微鉴别和薄层色谱鉴别试验。

1、显微鉴别

本品叶表面显微：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见。下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见。玉叶金花叶上表皮细胞显微结构如图1所示，玉叶金花叶下表皮细胞显微结构如图2所示。

玉叶金花药材粉末显微结构：粉末灰白色或灰绿色；非腺毛众多，由2～9个细胞组成，表面光滑，基部直径10～35μm；导管主为具缘纹孔，直径20～90μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径15～70μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径12～50μm。玉叶金花药材粉末显微结构如图3所示。

2、薄层鉴别

2.1色谱条件和系统适用性试验

根据文献调研玉叶金花所含成分，以玉叶金花对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121404-201502）作为对照品对其进行薄层鉴别。

对样品处理方法进行优化，利用甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等不同溶剂提取，并采用超声处理、回流等不同提取方法和不同提取时间进行提取，最终获得对照药材溶液的提取条件为：取玉叶金花粉末0.5g，加乙酸乙酯5mL，超声处理，滤过，取续滤液作为对照药材溶液；其中超声处理的频率为30～50kHz，功率为230～280 W，时间为10～30 min。

分别考察不同展开条件，包括三氯甲烷:甲醇的质量比=8.5:8、三氯甲烷:甲醇:水的质量比=8.5:1.5:1.5、三氯甲烷:甲醇:水的质量比=8.5:0.5:0.5，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热，然后置之外灯光365nm下检视。结果发现展开条件为展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=8.5～10:1.5～3:1.5～4混合均匀制成时展开效果较佳。最终获得供试品溶液的薄层鉴别条件为：取本品粉末0.5g，加乙酸乙酯5mL，超声处理，滤过，取续滤液作为供试品溶液；其中超声处理的频率为30～50kHz，功率为230～280W，时间为10～30 min。另取玉叶金花对照药材0.5g，同法制得对照药材溶液。

按照薄层色谱法《中国药典》2015年版四部通则0502进行试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水的质量比=8.5:1.5:1.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃条件下加热10min，置之外灯光365nm下检视；其中硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

按照上述的方法对13批次玉叶金花样品进行分析，结果：玉叶金花薄层色谱鉴别系统适用性试验如图4所示。在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.2耐用性实验考察

2.2.1不同厂家考察

为了验证该方法的可行性，在13批次玉叶金花中随机选择3批次进行实验，考察不同厂家薄层板对展开效果的影响，分别为青岛海洋硅胶板、烟台江友黄海牌硅胶板和青岛鼎康硅胶板的展开效果，结果：不同厂家薄层板对玉叶金花的展开效果如图5所示，其中，（a）为青岛海洋硅胶G对玉叶金花的展开效果；（b）为烟台江友硅胶G对玉叶金花的展开效果；（c）为青岛鼎康硅胶G对玉叶金花的展开效果。从图5三个品牌的硅胶G板试验结果可知，三个品牌均能鉴别玉叶金花。

2.2.2不同展开湿度

为了考察相对湿度对该方法的影响，利用不同浓度硫酸调整湿度为32％、60%、72％，考察不同湿度条件下的展开效果，结果：玉叶金花不同展开湿度鉴别效果如图6所示，其中，A：相对湿度32%；B：相对湿度60％；C：相对湿度72％。由图6可知，不同湿度下色谱图的斑点清晰，均能较好的鉴别玉叶金花，说明该方法受相对湿度的影响不明显。

2.2.3不同展开温度

为了考察不同展开温度的影响，分别在10℃、20℃、30℃下展开，考察不同温度对展开的影响，结果：玉叶金花不同展开温度效果如图7所示，其中，①温度为10℃；②温度为20℃；③温度为30℃。由图7可知，不同温度下色谱图的斑点清晰，均能较好的鉴别玉叶金花，说明该方法受温度的影响不明显。

2.2.4稳定性考察

将同一批次的本品粉末于3天前、2天前、1天前、当天按上述方法制备供试品溶液，分别点于同一硅胶G板上，展开，显色，结果：供试品溶液稳定性考察TLC图如图8所示，图8中，10为当天；11为放置1天；12为放置2天；13为放置3天；14为对照药材。由图8可知，各斑点无明显差异，表明供试品溶液稳定性良好。

2.2.5不同批次样品薄层色谱鉴别

按照上述的薄层色谱鉴别方法，对表1中的13批次样品进行测定，采用，不同批次玉叶金花薄鉴别谱图如图9所示，其中批号如表1所示， 14为上述所述的玉叶金花对照药材。由图9可知，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。13批次玉叶金花饮片均符合要求，进一步说明本方法专属性强，可有效鉴别玉叶金花。

3、水分测定

取本品过二号筛的粉末2g，精密称定，按照《中国药典》2015年版通则0832水分测定法（第二法烘干法）进行测定，玉叶金花的水分测定结果如表2所示。

由表2实验数据可知，13批次玉叶金花中水分含量范围是9.20%~14.30%，平均含量为11.95%，规定本品水分不得过15.0%。

表2玉叶金花的水分测定结果

4、总灰分的测定

取本品粉末2g，置于炽灼至恒重的坩埚中，称定重量（允许误差范围为0.01g），按照《中国药典》2015年版通则2302灰分测定法测定，玉叶金花总灰分测定结果如表3所示。

由表3实验数据可知，13批次玉叶金花药材的总灰分含量范围为5.26~7.88%，其平均含量是6.24%，规定本品总灰分不超过8.0%。

表3玉叶金花的总灰分测定结果

5、醇溶性浸出物测定

取本品过二号筛的粉末2g，精密称定，置于100ml的锥形瓶中，精密加乙醇50ml，按照《中国药典》2015年版四部通则2201浸出物测定法中醇溶性浸出物测定法热浸法测定，玉叶金花的醇溶性浸出物结果如表4所示。

由表4实验数据可知，13批次玉叶金花醇溶性浸出物范围是5.18~8.80%，平均值含量为6.62%，规定本品醇溶性浸出物不得少于5.0%。

表4玉叶金花的醇溶性浸出物测定结果

综上所述，本申请创造性采用了叶表皮制片方法，利用显微鉴别法观察玉叶金花叶表观特征和粉末特征，根据其特征有效和准确的鉴定玉叶金花；建立了专属性强、稳定可靠的薄层色谱方法鉴定玉叶金花，关键在于供试品和对照品药材溶液制备和薄层色谱展开，最终将供试品与对照药材色谱进行比较，从而鉴定玉叶金花真伪，鉴定结果准确率高。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种玉叶金花的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用显微法进行玉叶金花叶表面观和结构的鉴别；

将玉叶金花叶表皮和药材粉末分别制片，将处理后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定玉叶金花的叶表面观和药材粉末的显微结构；

（2）采用薄层色谱法进行玉叶金花的定性鉴别；

a、供试品溶液的制备：取待测样品粉末0.3～0.7g，加乙酸乙酯4～6ml，超声处理18～23min，滤过，取滤液作为供试品溶液；

b、对照药材溶液的制备：取玉叶金花对照药材0.3～0.7g，加乙酸乙酯4～6ml，超声处理18～23min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；

c、薄层色谱鉴定：分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各2～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，置于105℃下加热10min，置之外灯光365nm下检视，测定；

在步骤（1），所述玉叶金花药材粉末显微结构为：粉末是灰白色或灰绿色，非腺毛众多，由2～9个细胞组成，表面光滑，基部直径为10～35μm；导管主为具缘纹孔，直径为20～90μm，偶见螺纹导管；石细胞众多，长方形、方形及类圆形，直径为15～70μm；叶上表皮细胞类多角形，叶下表皮细胞不规则形状，垂周壁稍弯曲；纤维壁薄，具单纹孔，直径为12～50μm；

在步骤（1），所述玉叶金花叶表面观为：上表皮细胞呈类多角形，垂周壁增厚，气孔少见；下表皮细胞不规则形状，垂周壁波状弯曲；气孔为平轴式；非腺毛多见；

在步骤a，所述超声处理的频率为30～50kHz，功率为230～280 W，时间为10～30 min；

在步骤c，所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇和水按照体积比=8.5～10:1.5～3:1.5～4混合均匀制成；

在步骤c，所述硫酸乙醇溶液中硫酸和乙醇的质量比=1:9。

2.根据权利要求1所述的一种玉叶金花的鉴别方法，其特征在于：在步骤c，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点的为玉叶金花药材。

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