CN109706114A - 一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，属于干细胞领域，包括如下步骤：步骤1、分离牛睾丸支持细胞；步骤2、培养牛睾丸支持细胞；步骤3、将编码Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4四种转录因子转入牛睾丸支持细胞中，产生多能性干细胞。与现有技术相比，本发明充分利用了牛睾丸支持细胞差异贴壁的特点，培养出了形态均一的牛睾丸支持细胞。由于牛睾丸支持细胞来自于肉用犊牛具有较高的重编程能力。以牛睾丸支持细胞代替牛成体成纤维细胞、间充质干细胞等作为来源细胞制备诱导多能干细胞，不仅细胞获取简便而且重编程率高。

Description

一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体地涉及一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是由内细胞团(Inner cell mass，ICM)分离而来的一种具有可分化为三胚层各种类型细胞的多能性干细胞。小鼠、大鼠和人的ESCs的建立、体外培养以及分子方面的研究已经取得了显著进展。但对于大家畜特别是牛ESCs，科研人员在小鼠ESCs的基础上尝试多种体外分离培养的方法，但由于种间差异较大，体外培养基的成分不确定，获取卵细胞来源不便等因素，真正的牛ESCs还未见报道。自1996年7月5日，克隆羊多莉诞生，核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术风靡全球，科学家们发现，这项技术可以将高度分化的体细胞重编程为与ESCs高度相似的多能干细胞。然而，由于核移植对细胞重编程的不确定性，因此即使产生后代也会有畸形，核移植子代寿命会远远短于自然生产的后代等问题，且核移植操作繁琐，周期长，效率低，费时费力。

近年来，一类可替代ESCs的细胞问世，诱导多能性干细胞(induced PluripotentStem Cells，iPSCs)是一类与ESCs的形态、生长方式以及生物学特点极其相似的一类多能性细胞。iPSCs技术是将四种特定的转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4利用慢病载体导入终末分化的体细胞中，过表达这四种基因后，将体细胞在ESCs的培养条件下获得形态类似ESCs的克隆。目前，已有几篇用牛成纤维细胞(Bovine embryonic fibroblast,BEF)作为牛iPSCs的来源细胞的报道，但重编程效率低，多能性不完全并且体外分化能力差。

支持细胞(Sertoli Cells，SCs)是存在于睾丸曲细精管基底膜的终末分化的体细胞，细胞核呈不规则形状，有序排列于基膜上。在精子发生过程中起到了为各级生精细胞提供发育微环境和营养的重要作用。在体外与各类干细胞共培养的过程当中，人们发现SCs对间充质干细胞、神经干细胞等成体干细胞的培养有促进和支持作用，对体外神经细胞的修复和轴突再生也有良好的效果。目前，利用二步酶消化法获取SCs已经有相关报道。也有研究表明，利用某些特定的因子将小鼠睾丸SCs可诱导为神经干细胞。由此可见支持细胞在未来的临床应用中会受到广泛的关注。根据其增殖快、形态均一、免疫排斥反应小及细胞纯度高等良好特性，可以考虑采用SCs作为iPSCs的供体细胞来源，以获得更加优质且多能性和诱导效率更高的iPSCs。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，解决了现有牛诱导多能干细胞的诱导效率低以及细胞的多能性不完全等问题。

为达到上述目的，本发明提供了一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、分离牛睾丸支持细胞：

将从屠宰场取回的肉用牛睾丸，在无菌条件下充分分解后加5倍体积DMEM培养基并吹打，吹散成单个曲细精管，静置5min后弃上清，重复5次以去除睾丸间质细胞，至上层液体澄清后加5倍体积的含50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ及1mg/mL胶原酶Ⅳ的消化液Ⅰ，32℃恒温摇床孵育60min，转速140rpm；用含10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤去上清，随后加5倍体积含1mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL透明质酸酶、50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶IV的消化液Ⅱ，32℃恒温摇床孵育30min，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤后加DMEM培养基重悬；用40μm细胞过滤网进行过滤，收集滤液并离心洗涤，弃上清后以1mL的DMEM培养基重悬，2h后，牛睾丸支持细胞进行差异贴壁，得到牛睾丸支持细胞；

步骤2、培养牛睾丸支持细胞；

步骤3、将编码Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子转入牛睾丸支持细胞中，产生多能性干细胞。

进一步，所述步骤1中肉用牛睾丸为肉用犊牛睾丸。

进一步，所述步骤2中培养牛睾丸支持细胞过程如下：将牛睾丸支持细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行原代培养，每2天换液1次，一周后消化传代。

进一步，所述步骤3中多能性干细胞产生过程如下：在逆转录病毒载体中插入Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子，获得重组质粒，将重组质粒与病毒包装载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒，并将携带编码Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子的慢病毒转入牛睾丸支持细胞中产生多能性干细胞。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：

第一，本发明充分利用了牛睾丸支持细胞差异贴壁的特点，培养出了形态均一的牛睾丸支持细胞。

第二，由于牛睾丸支持细胞来自于肉用犊牛具有较高的重编程能力。

第三，以牛睾丸支持细胞代替牛成体成纤维细胞、间充质干细胞等作为来源细胞制备诱导多能干细胞，不仅细胞获取简便而且重编程率高。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明示意性实施例及其说明用于理解本发明，并不构成本发明的不当限定，在附图中：

图1：牛睾丸支持细胞，培养过程中牛睾丸支持细胞的形态；

图2：牛睾丸支持细胞诱导的iPSCs，诱导后两周形成与周围饲养层细胞界限明显的克隆；

图3：碱性磷酸酶染色形成的克隆表达碱性磷酸酶；

图4A：畸胎瘤切片外胚层组织结构；

图4B：畸胎瘤切片中胚层组织结构；

图4C：畸胎瘤切片内胚层组织结构。

具体实施方式

以下结合优选实施例，进一步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的优选实施方法与材料仅作示范之用。

实施例一

牛睾丸支持细胞的制备：

将从屠宰场取回的肉用犊牛睾丸进行支持细胞的原代分离，具体操作如下采用二步酶消化法制备牛睾丸曲细精管生精上皮细胞悬液：在无菌条件下将从屠宰场取回的肉用犊牛睾丸充分剥离，加5倍体积DMEM培养基并剧烈吹打，尽可能吹散成单个曲细精管，静置5min后弃上清，重复5次以去除睾丸间质细胞，至上层液体澄清后加5倍体积的含50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNAse I)及1mg/mL胶原酶Ⅳ的消化液Ⅰ，32℃恒温摇床孵育60min，转速140rpm；用含10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤去上清，随后加5倍体积含1mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL透明质酸酶、50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNAse I)、1mg/mL胶原酶IV的消化液Ⅱ，32℃恒温摇床孵育30min，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤后加DMEM培养基重悬；用40μm细胞过滤网进行过滤，收集滤液并离心洗涤，弃上清后以1mL的DMEM培养基重悬，2h后，牛睾丸支持细胞进行差异贴壁，此时弃上清培养液，更换新鲜培养基，每2天换液1次，一周左右进行传代扩大培养，详见图1。

牛睾丸支持细胞诱导重编程：

将小鼠胚胎成纤维细胞以1×10⁴的密度接种培养板种，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，待细胞贴壁，汇合至80％后，8μg/mL的丝裂霉素进行处理4h，作为饲养层留用；

在逆转录病毒载体中插入Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子，获得重组质粒，将重组质粒与病毒包装载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒，收集病毒液进行浓缩以及滴度测定。将病毒液按1：20的病毒感染复数(MOI)加入至第3-5代的牛睾丸支持细胞中，加入胚胎干细胞培养基继续培养两天后，胰酶消化并接种至饲养层，37℃、浓度为5％的CO₂条件下培养。隔日换液，倒置显微镜观察，逐渐形成类似人胚胎干细胞的细胞克隆团，详见图2。

牛睾丸支持细胞诱导的iPSCs多能性的验证：

将牛睾丸支持细胞诱导的iPSCs进行挑克隆传代留用后续实验，传代培养5天的牛睾丸支持细胞诱导的iPSCs，弃掉上清培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入浓度为4％多聚甲醛固定2min，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加入碱性磷酸酶染色液避光孵育10min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，倒置显微镜下镜检观察，细胞克隆团呈现粉紫色，而细胞克隆团周边成纤维状的饲养层细胞未着色，表明细胞克隆团中的细胞处于未分化状态，详见图3。

将牛睾丸支持细胞诱导的iPSCs吹散成单细胞注射到SCID鼠后肢皮下，3周后肉眼可见有肿瘤形成，5周后摘取畸胎瘤，畸胎瘤切片苏木精—伊红染色(HE染色)，显微镜下观察，如图4A、图4B及图4C所示。畸胎瘤切片结果表明本发明制备的牛睾丸支持细胞诱导的iPSCs细胞体内具有发育为外、中、内三个胚层组织的能力。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、分离牛睾丸支持细胞：

将从屠宰场取回的肉用牛睾丸，在无菌条件下充分分解后加5倍体积DMEM培养基并吹打，吹散成单个曲细精管，静置5min后弃上清，重复5次以去除睾丸间质细胞，至上层液体澄清后加5倍体积的含50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ及1mg/mL胶原酶Ⅳ的消化液Ⅰ，32℃恒温摇床孵育60min，转速140rpm；用含10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤去上清，随后加5倍体积含1mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL透明质酸酶、50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶IV的消化液Ⅱ，32℃恒温摇床孵育30min，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤后加DMEM培养基重悬；用40μm细胞过滤网进行过滤，收集滤液并离心洗涤，弃上清后以1mL的DMEM培养基重悬，2h后，牛睾丸支持细胞进行差异贴壁，得到牛睾丸支持细胞；

步骤2、培养牛睾丸支持细胞；

步骤3、将编码Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子转入牛睾丸支持细胞中，产生多能性干细胞。

2.根据权利要求1所述的牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤1中肉用牛睾丸为肉用犊牛睾丸。

3.根据权利要求1所述的牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤2中培养牛睾丸支持细胞过程如下：将牛睾丸支持细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行原代培养，每2天换液1次，一周后消化传代。

4.根据权利要求1所述的牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤3中多能性干细胞产生过程如下：在逆转录病毒载体中插入Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子，获得重组质粒，将重组质粒与病毒包装载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒，并将携带编码Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子的慢病毒转入牛睾丸支持细胞中产生多能性干细胞。