CN109705292A - 一种检测硫氰酸根的有机硅高分子荧光探针及其合成和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测硫氰酸根的有机硅高分子荧光探针，其结构式为。本发明的荧光探针由双酚芴、MM^NH2、甲醛、4‑溴‑1,8‑萘酐、甲硫醇钠等原料合成，原料易得、合成步骤简单、收率高。本发明的荧光探针本身发射硫甲基萘酰亚胺的荧光，加入硫氰酸根之后，特异性识别硫氰酸根，探针中的硫甲基被氧化为二硫键，荧光减弱。检测条件为：激发波长为405nm，检测波长为530 nm。

Description

一种检测硫氰酸根的有机硅高分子荧光探针及其合成和应用

技术领域

本发明属于有机高分子荧光探针领域，具体涉及一种检测细胞中硫氰酸根的荧光探针及其合成方法。

背景技术

硅，作为地壳中蕴藏的第二大种类元素，近年来得到了广泛的关注。由于Si以及Si-O特殊的物理化学性质，具有较好的绝缘性，耐老化性、生物相容性等优点，在生物医疗、交通运输、电力电气、建筑、纺织等行业得到广泛应用。有机硅高分子有许多优越的性能。常见的有机硅高分子材料主要包含硅油、硅橡胶、硅树脂，它们具有耐高低温、电气绝缘、防潮、耐老化以及良好的生理惰性等，为其它基于碳材料的高分子材料所不能比拟与替代。所以，开发新的有机硅合成策略，对于丰富有机硅的发展方向，对推动有机硅产业链具有十分重要的意义。

大多数阴离子对生命系统有毒性作用，极少数阴离子控制着几种代谢过程。硫氰酸盐（SCN^-）是一种这样的阴离子，其通常以30-100 mM的含量存在于血液中，而在唾液和牛奶中可达到0.5-1.6 mM，并且充当抗微生物剂。可在H₂O₂存在下氧化硫氰酸盐，其具有杀菌或抑菌活性。而缺乏它会导致囊性纤维化和其他与炎症相关的疾病。另外，SCN^-能在没有任何催化剂的帮助下，减少次氯酸根。正常人血浆中的SCN^-水平在10至140 mM之间变化。SCN抗氧化剂的不足就无法充分提供对OCl^-的保护，使炎性疾病恶化并使人易患与MPO活性相关的疾病。因此，选择能够准确有效监测人体内SCN^-含量的工具异常重要，可帮助研究生命系统中SCN^-运输的机制。

众所周知，传统的用于检测硫氰酸根的方法有离子质谱法、电感藕合等离子体原子发射光谱法和电化学方法等。但是这些方法大多分析时间长,所需要的仪器价格昂贵且不易于操作。而与这些方法相比,荧光探针则拥有选择特异性好、灵敏度高、即时检测和响应迅速等众多优势。这些优点使得其在化学、生物医学等学科领域都有着较为广泛的应用，尤其是在生物医学领域，荧光探针不仅可以用于体外分析还可以用于活体的影像学研究。

近年来,能特异性检测硫氰酸根的小分子荧光探针被大量报道。然而，其中许多探针水溶性差、灵敏度低、pH的变化对检测的效果影响较大，另有一些探针生物毒性大、细胞膜渗透能力差，这些缺陷很大程度上影响了探针的应用。因此发展稳定灵敏的硫氰酸根检测探针具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于聚硅氧烷的检测硫氰酸根的有机高分子荧光探针。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测细胞中硫氰酸根的荧光探针，简称为V1，结构式如式（I）所示：

式（I）。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）双酚芴、MM^NH2、多聚甲醛在乙醇中加热反应得化合物A：

；

（2）4-溴-1,8-萘酐与甲硫醇钠于乙醇中反应，分离、提纯得化合物B：

；

（3）化合物A与化合物B在乙醇中加热反应，分离提纯得到化合物，即为探针V1：

。

步骤（1）中，所述物料双酚芴、MM^NH2、多聚甲醛中甲醛单体的物质的量比为1：1.5：1。

步骤（1）中，所述反应温度为110 ℃，反应时间为24 h。

步骤（2）中，所述物料4-溴-1,8-萘酐与甲硫醇钠的物质的量比为1：1.5。

步骤（2）中，所述反应时间为24 h。

步骤（2）中，所述分体提纯过程为：反应结束后，向反应液加入水，得到黄色沉淀，过滤后干燥得到黄色固体，柱层析提纯，洗脱液为甲醇：二氯甲烷（V/V）=1：10。

步骤（3）中，所述化合物A与化合物B的物质的量比为1：10。

步骤（3）中，所述反应温度为50 ℃；反应时间为24 h。

步骤（3）中，所述分体提纯过程为将反应液过滤，将过滤后的液体旋蒸，真空干燥得到固体，即为V1。

一种上述荧光探针在检测生物内硫氰酸根的应用。

所述应用为荧光检测，激发波长为405 nm，检测波长为530 nm。

所述应用中，探针的荧光强度随着硫氰酸根浓度增加荧光强度减弱。

本发明的作用机理：

。

本发明所述检测硫氰酸根的荧光探针V1，探针本身发射硫甲基萘酰亚胺的荧光，加入硫氰酸根之后，探针中的硫甲基被亲核取代为硫氰根，荧光减弱。检测条件为：激发波长为405 nm，检测波长为530 nm。

本发明的有益效果为：

本发明所述的检测硫氰酸根的荧光探针V1能特异性识别硫氰酸根，并以荧光减弱的方式实现在细胞中对硫氰酸根的识别。

附图说明

图1是探针V1的氢谱；

图2是探针V1对不同阴离子的选择性，其中，激发波长为405 nm，探针的浓度为10 µM，选择性阴离子的浓度为0.1 mM，1-12加入的阴离子分别为：氯化钠、醋酸钠、硫化钠、碳酸氢钠、硫氰酸钠、次氯酸钠、亚硝酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硫酸钠、碳酸钠、PBS。

图3是探针V1与硫氰酸根作用的滴定实验，其中激发波长为405 nm，探针的浓度为10 µM；

图4是探针V1本身的浓度滴定，其中激发波长为405 nm，探针的浓度由0-10 µM；

图5是探针V1的外源性硫氰酸根细胞成像测试。探针浓度为10 μM，硫氰酸根浓度为0.1mM，激发波长为405 nm。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 化合物探针V1的合成

（1）化合物A的合成

先将2.3g双酚芴溶于20 mL乙醇中，再将0.75 g多聚甲醛溶于20 mL甲苯中。在250 mL茄型烧瓶中，加入MM^NH2 2 g，溶于100 mL乙醇中，再加入配置好的甲醛溶液与双酚芴溶液，110℃加热搅拌回流24 h。旋蒸、干燥得到化合物A。

（2）化合物B的合成

将2.77 g 4-溴-1,8-萘酐溶于50 mL乙醇中，再将3 g甲硫醇钠溶于50 mL乙醇中，再一同加入250 mL茄型反应瓶中，室温反应搅拌24 h。反应结束后，向反应瓶中加入100 mL水，得到黄色沉淀，过滤后干燥得到黄色固体，柱层析法提纯，洗脱液为甲醇：二氯甲烷（V/V）=1：10，得到纯净化合物B。

（3）化合物探针V1的合成

将0.224 g B溶解于50 mL乙醇中，在将1.324g A加入50 mL乙醇中，再一同加入250 mL茄型烧瓶中，50℃加热搅拌回流24 h。过滤，将过滤后的液体旋蒸，真空干燥得到固体，即为化合物V1，其核磁氢谱如图1。

实施例2 化合物V1荧光探针对不同阴离子的选择性

配制5 mL浓度为1 mM的氯化钠、醋酸钠、硫化钠、碳酸氢钠、硫氰酸钠、次氯酸钠、亚硝酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硫酸钠、碳酸钠的PBS水溶液（pH=7.4）及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针V1母液作为备用。

分别加入10 μL探针母液、225 μL DMSO和10当量的氯化钠、醋酸钠、硫化钠、碳酸氢钠、硫氰酸钠、次氯酸钠、亚硝酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硫酸钠、碳酸钠溶液，用磷酸缓冲液PBS定容至3 mL，摇匀，30 min后，进行荧光检测（λ_ex =405 nm, λ_em =530 nm），建立添加各离子溶液后的荧光强度柱状图，如图2所示。由图2可以发现，其他离子对化合物V1的荧光影响很小，而硫氰酸根的加入使化合物V1的荧光显著减弱。

实施例3 不同浓度的硫氰酸根对探针V1的荧光滴定检测

配制10 mL浓度为10 mM硫氰酸根的水溶液及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针V1母液作为备用。

配制探针浓度为10 μM，分别与不同浓度的硫氰酸根（5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100μM）相互作用，并进行荧光检测（λ_ex = 405 nm，λ_em = 530 nm），计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与硫氰酸根浓度标准曲线。如图3所示，随着硫氰酸根浓度的增加，反应体系荧光强度逐渐降低，当硫氰酸根浓度达到100 μM时，反应体系荧光强度达到最低状态。

实施例4 探针V1本身的浓度滴定。

配制1 mM实施例1所得探针V1溶液，分别配制探针浓度为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10μM的PBS水溶液，分别进行荧光检测（λ_ex = 405 nm, λ_em = 530 nm），以检测波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，制作图4。由图4可知，随着探针V1浓度增加，荧光强度逐渐增强。

实施例5 探针V1的外源性硫氰酸根原位检测细胞成像测试

配制1 mM实施例1所得探针V1溶液待用。

将10 μL的探针母液分别加入4盘Hela细胞中孵育20 min。再将10 μL，50 μL，100μL硫氰酸根离子分别加入，孵育5 min；待培养结束后，用荧光显微镜在单光子模式下拍摄这四组条件下培养的Hela细胞荧光照片，发现细胞中的荧光随着硫氰酸根的加入逐渐减弱。

Claims (7)

1.一种检测细胞中硫氰酸根的荧光探针，结构式如式（）所示：

式（I）。

2.一种上述荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）双酚芴、MM^NH2、多聚甲醛在乙醇中加热反应得化合物A：

；

（2）4-溴-1,8-萘酐与甲硫醇钠于乙醇中反应，分离、提纯得化合物B：

；

（3）化合物A与化合物B在乙醇中加热反应，分离提纯得到化合物，即为检测细胞中硫氰酸根的荧光探针：

。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所述物料双酚芴、MM^NH2、多聚甲醛中甲醛单体的物质的量比为1：1.5：1；

步骤（2）中所述物料4-溴-1,8-萘酐与甲硫醇钠的物质的量比为1：1.5；

步骤（3）中所述化合物A与化合物B的物质的量比为1：10。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述反应温度为110 ℃，反应时间为24 h；

步骤（2）中，所述反应时间为24 h；

步骤（3）中，所述反应温度为50 ℃；反应时间为24 h。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中所述分体提纯过程为：反应结束后，向反应液加入水，得到黄色沉淀，过滤后干燥得到黄色固体，柱层析提纯，洗脱液为甲醇：二氯甲烷（V/V）=1：10；步骤（3）中所述分体提纯过程为将反应液过滤，将过滤后的液体旋蒸，真空干燥得到固体，即为检测细胞中硫氰酸根的荧光探针。

6.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测生物内硫氰酸根的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为荧光检测，激发波长为405 nm，检测波长为530 nm。