CN109705007B - 一种用于二泛素合成的新型辅基连接臂及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及一种用于二泛素合成的新型辅基连接臂及其合成方法和应用,属于蛋白合成技术领域。
背景技术
蛋白质是生物体中广泛存在的一类大分子,还直接参与了生命体的生理过程。特别在人体中,蛋白质几乎参与了所有的生理过程。然而人体内仅仅25000种蛋白质,不能完全承担人体各种各样的生理反应。因此蛋白的翻译后修饰就成为了在另一个层面调控蛋白功能和生物结构多样性的手段。
蛋白质常见的翻译后修饰包括有糖基化、磷酸化、脂基化、酰基化、泛素化等,其中最为特殊的就是泛素化修饰。泛素化修饰能够广泛存在于真核生物体的几乎所有组织中,所以被称为泛素。泛素本身是一种小型调节蛋白,分子量为8.5kDa。泛素(Ubiquitin)在细胞内功能是通过泛素-蛋白酶体途径用于调节转录调节、DNA损伤修复、细胞周期。细胞外泛素同样具有多种功能,包括调节免疫反应,抗炎和神经保护活性,以及调节造血细胞的生长和凋亡。深入研究泛素化的功能与调节机制对于研究生命活动与寻找疾病相关治疗的药物靶标具有十分重要的意义。因此要想阐明泛素介导的细胞途径是需要足够量且性质均一的泛素化底物蛋白和泛素链。
在前人设计的Cysteine-Aminoethylation反应中高效实现了蛋白质赖氨酸侧链定点甲基化修饰,却无法直接用于泛素化修饰组蛋白的获取。因此我们在β-氨基氮原子上引入含有能够用于NCL反应结构单元的可移除辅基Aux-linker,从而能够采用Cysteine-Aminoethylation反应获取泛素化修饰组蛋白。
下面是获取泛素化组蛋白的方法:
文章(Nature Chemical Biology,2010,6(4):270-272)报道了酶促泛素化法,一般用于泛素在跨膜DNA合成中的作用进行定量和结构性理解。虽然能够合成,但是量对于生物化学和生物物理学的研究来说过少。
文章(Current Opinion in Chemical Biology,2015,28:57-65)报道了全合成的策略,但是由于二硫键将反应条件限制为非还原性反应,因此其他还原性反应的合成策略受到了限制。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足,提供了一种用于二泛素合成的新型辅基连接臂及其合成方法和应用。本发明辅基连接臂通过Cyseine-Aminoethylation偶联装载到底物泛素上,再通过NCL与另一个泛素偶联,最后脱除辅基即可获得基于表达泛素单元的泛素链。该方法的辅基介导合成二泛素,并且可以获取各种泛素化底物以及困难泛素链的合成。
本发明用于二泛素合成的新型辅基连接臂(Aux-linker),其结构式如下:
本发明用于二泛素合成的新型辅基连接臂的合成方法,首先以苯乙烯为原料合成1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷,然后通过反应在1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷上连接Acm保护基,最后通过恶唑烷酮开环反应制得Aux-linker。合成路线如下:
本发明用于二泛素合成的新型辅基连接臂的合成方法,具体包括如下步骤:
步骤1:化合物I(3-溴-2-氧代四氢-1,3-恶唑)的合成
将2-氧代四氢-1,3-恶唑与水混合后室温下搅拌反应,反应25分钟后加入溴,同时加入氢氧化钠溶液将pH值调为偏碱性,5分钟后,滤出沉淀物,用水洗涤,室温下真空干燥,得到化合物I;
步骤1中,2-氧代四氢-1,3-恶唑与溴的摩尔比为1:1。
步骤1中,加入氢氧化钠溶液将pH值调为8.6。
步骤2:化合物II(1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷)的合成
将化合物I加入含有有机物I的苯悬浮液中,60℃下加入新蒸馏的苯乙烯的苯溶液,搅拌5分钟后蒸发混合物,过滤并干燥,得到化合物II;
步骤2中,苯乙烯、化合物I和有机物I的摩尔比为20:20:1。
步骤2中,所述有机物I为2,2'-二氰基-2,2'-氮丙烷。
步骤2中,所述有机溶剂为石油醚。
步骤3:化合物III(N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺)的合成
将化合物II溶于含有乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液的混合溶剂中,然后加入N-(巯基甲基)-乙酰胺(AcmSH)并用NaOH溶液将反应体系的pH调节至碱性,室温下搅拌反应6-8小时;反应完成后,真空蒸发除去部分溶剂中的乙腈,再用有机溶剂萃取,将合并的萃取液用饱和NaCl溶液洗涤,减压浓缩并干燥,最后通过液相色谱纯化,得到化合物III;
步骤3中,化合物II与N-(巯基甲基)-乙酰胺(AcmSH)的摩尔比为1:1。
步骤3中,乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液的混合溶剂中乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液的体积比为3:2;反应体系的pH值调至12。
步骤3中,所述有机溶剂是CH2Cl2。
步骤3中,液相色谱纯化时所用溶剂是由CH2Cl2与MeOH按体积比20:1的比例混合构成。
步骤4:化合物IV(2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵)的合成
先将卤化氢溶液置于冰浴下搅拌降温至0℃,再将化合物III溶解在室温下的卤化氢溶液中,溶解后加入反应体系,撤除冰浴,在室温下搅拌反应20h,反应结束后将反应液加入有机溶剂中,生成乳黄色沉淀,得到粗产物,进一步通过半制备RP-HPLC纯化,然后在50℃减压蒸发,得到纯的目标产物—化合物IV。
步骤4中,化合物III与溴化氢的摩尔比为1:9,此处的溴化氢是指步骤4加入的溴化氢的总量。
步骤4中,所述卤化氢溶液为溴化氢溶液,质量浓度为31%。
步骤4中,所述有机溶剂为乙醚。
本发明辅基连接臂的应用,是通过Cyseine-Aminoethylation反应偶联装载到底物泛素上,再通过NCL与另一个泛素偶联,最后脱除辅基连接臂即可获得基于表达泛素单元的泛素链。该方法的辅基介导高效合成二泛素,并且可以获取各种泛素化底物以及困难泛素链的合成。
反应过程示意如下:
CAAL-Strategy:
本发明的有益效果体现在:
本发明设计了一种新型功能化辅基Aux-linker的合成方法,不仅适用于各种泛素化底物以及困难泛素链的合成,而且辅基介导合成二泛素。在小分子-半胱氨酸偶联、蛋白片段间自然化学连接中,新型辅基介导形成的非天然异肽键与天然异肽键相似度高,只相差一个原子,扰动较小。因此这样的泛素化蛋白及泛素链的合成方法十分高效且能广泛应用。
附图说明
图1是化合物1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷氢谱-CDCl3的氢谱图。
图2是化合物1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷碳谱-CDCl3的碳谱图。
图3是化合物N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺氢谱-CDCl3的氢谱图。
图4是化合物N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺碳谱-CDCl3的碳谱图。
图5是化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵氢谱-D2O的氢谱图。
图6是化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵碳谱-D2O的碳谱图。
图7是化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵的高分辨质谱图。
图8是新型辅基连接臂装载到UbK27C的质谱图。
图9是新型辅基连接臂装载到UbK27C脱除Acm的质谱图。
图10是运用新型辅基连接臂得到Ub(1-76)K27NCL产物的质谱图。
图11是运用新型辅基连接臂得到Ub(1-76)K27-Diub-终产物的质谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明,这些描述只是为了进一步说明本发明的特征及优点,而不是对发明权利要求的限制。
实施例1:
1、将2-氧代四氢-1,3-恶唑(17.42g,0.2mol)加入圆底烧瓶中,加入200ml水进行搅拌,搅拌25分钟后加入溴(31.96g,0.2mol),并同时加入6MNaOH溶液调节溶液的pH值至8.6,反应10分钟后,滤出沉淀物,用水洗涤,室温下真空干燥,用二氯甲烷萃取水层,干燥萃取物,蒸发干燥,得到产物3-溴-2-氧代四氢-1,3-恶唑(21.58g,收率65%)。
2、将3-溴-2-氧代四氢-1,3-恶唑(16.6g,0.1mol)加入2,2'-二氰基-2,2'-氮丙烷(0.821g,5mmol)的100mL的苯悬浮液中。在60℃下,随后在5分钟内加入新鲜蒸馏的苯乙烯(10.4g,0.1mol)的苯(20mL)溶液。搅拌5分钟后,蒸发混合物,将残余物与石油醚(50mL)一起搅拌,过滤,然后干燥,得到化合物1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-恶唑-3-基)-1-苯基乙烷(25.7g,95%收率)。
3、将化合物1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-恶唑-3-基)-1-苯基乙烷(10.8g,40mmol)溶于含有乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液(V乙腈:Vbuffer=3:2)的混合溶剂(100mL)中,然后溶解在N-(巯基甲基)-乙酰胺(AcmSH,4.21g,40mmol)加入到溶液中并用2.0M NaOH溶液将反应pH调节至12,将混合物在室温下搅拌6-8小时。反应完成后,将大部分溶剂中的乙腈真空蒸发。将混合物用CH2Cl2(3×100mL)萃取,将合并的有机萃取液用饱和NaCl溶液(3×300mL)洗涤,然后用Na2SO4干燥并减压浓缩。通过液相色谱(CH2Cl2/MeOH,20:1)纯化混合物,得到所需化合物N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺(7.98g,67.8%产率),为粘性油状液体。
4、将66ml浓度为31%的溴化氢溶液在冰浴下搅拌降温至0℃,将5.89gN-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺(20mmol)溶解在4ml浓度为31%的溴化氢溶液中,加入反应体系,撤除冰浴,在室温下反应20h;反应结束后暂停搅拌,加入预冷的乙醚(200mL)生成乳黄色沉淀,得到化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵(2.57克,38.8%yiled,约75%的纯度,可用于下一个半胱氨酸烷基化反应)。2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵可进一步通过半制备RP-HPLC纯化,然后在50℃减压蒸发,得到纯的2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵(1.92g)。
实施例2:
取110mg冻干的UbK27C粉末(最终浓度:10mg/ml)溶解于脱气的12.32mL烷基化缓冲液(6M盐酸胍,1M HEPES,10mM D/L-蛋氨酸,pH=8.5)加入27.8mgTCEP。将泛素在室温下还原20分钟。然后加入332mg 2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵(溶解在DMF中;终浓度20mM)并将反应pH重新调节至8.5。在室温下搅拌5小时后,向该混合物中加入另外的18.5mgTCEP和249mg2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵(20mM)。并使反应在室温下再进行5小时。随后,用2.5mg~3.75mg过量的DTT(终浓度150-200mM)淬灭反应,并通过半制备型RP-HPLC纯化,得到烷基化产物(UbK27C+Aux)(90.6mg,产率80%)。
实施例3:
先配置反应buffer(6M Gn-HCl,0.2M Na2HPO4,pH=7.2(超声脱气,过膜)),将实例4中43mg冻干蛋白样品用5mL反应buffer溶解,加入43mgPdCl2(5equiv)(PdCl2用反应buffer超声溶解),调节pH=7.2,监测反应,约20minAcm基团可完全移除(步骤1中未反应的原料与Acm移除产物有位移,可分离)。
反应完成后,加入45mg过量DTT(60equiv)猝灭反应,使其充分与Pd络合,沉淀完全后,高速离心分离,过膜后半制备分离。收集纯化后的溶液,并冻干,得到目标产物36.25gUb(1-76)K27C+Aux-Acm移除。产率85%。
实施例4:
将12mgUb(1-76)-NHNH2(1.5μmol,1.5equiv)溶于1mL连接缓冲液(6M Gn-HCl,200mMNaH2PO4,pH=3.0)在冰浴(-10℃)中预冷。然后逐滴加入10μL的1M NaNO2(10μmol,10equiv),并将反应在-10℃孵育30分钟以使酰肼完全转化为酰基叠氮化物。随后加入6.8mg MPAA(40μmol,40equiv),并将pH调节至5.0,持续5分钟以产生硫酯肽。最后,加入8mgUb(1-76)K27C+Aux-Acm(1μmol,1equiv),并将pH调节至6.5后引发连接。通过RP-HPLC监测反应。收集纯化后的溶液,并冻干,得到目标产物9.5mg Ub(1-76)K27NCL产物,产率:60%。
实施例5:
取上述35mg NCL产物,用10ml 6M盐酸胍溶液溶解,后加至0.4M TCEP,2M吗啡啉的储备液中(溶液澄清,蛋白终浓度约3-4mg/ml),pH=8.5,室温搅拌12h,HPLC监测反应。反应完全后,纯水透析,除去水溶性盐,浓缩(或者冻干),HPLC分离。收集纯化后的溶液,并冻干,得到目标产物26.0mgUb(1-76)K27-Diub-终产物,产率:75%。
图1是化合物1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷氢谱-CDCl3的氢谱图。图2是化合物1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-唑-3-基)-1-苯基乙烷碳谱-CDCl3的碳谱图。通过图1的7.5-7.0ppm和图2的120-130ppm处我们可以看出这是一个苯环。图1中,5.5-5.0ppm是连接在CH-Br上的氢,4.5-4.25ppm之间的是恶唑烷酮内CH2-N上的氢,3.0-3.5ppm和4.0ppm处的是恶唑烷酮上CH2-O的两个氢,3.5-3.75ppm处两个峰是Br-CH-CH2-N的靠近N处的碳上的两个氢。通过图2的160ppm处我们可以知道恶唑烷酮上的C=O。图2的40-50ppm和60-70ppm处是恶唑烷酮的碳。
图3是化合物N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺氢谱-CDCl3的氢谱图。图4是化合物N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺碳谱-CDCl3的碳谱图。通过图3的7.5-7.0ppm和图4的120-130ppm处我们知道这是一个苯环。通过图3的6.5ppm处且积分出0.93判断这是Acm保护基上的-NH,2.0-1.75处的峰积分出2.93判断-COCH3上的3给氢,3.25ppm处积分的一个氢和3.75ppm处的积分的两个氢是S-CH-CH2-N的靠近N处的碳上的两个氢,3.70-2.25ppm处的两组峰是是恶唑烷酮上CH2-O的两个氢的峰。通过图4的60-70ppm处判断这是恶唑烷酮恶唑烷酮上CH2-O的碳原子。通过图4的45.37ppm处可以判断这是与Acm处连接的碳原子。
图5是化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵氢谱-D2O的氢谱图。图6是化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵碳谱-D2O的碳谱图。图7是化合物2-((乙酰氨基甲基)硫基)-N-(2-溴乙基)-2-苯基乙-1-铵的高分辨质谱图。通过图5、图6、图7,首先看出分子量正确,图7的高分辨质谱显示的分子量已经精确到小数点后4位数,图7出现的两个极高的且对应的峰分别是因为Br的同位素在自然界的比例为1:1。图5的7.5-7.0ppm的5个氢可以看出苯环。图5的3.75-3.5ppm积分得到的个数可以看出-CH2-Br的两个氢。
图8是新型辅基连接臂装载到UbK27C的质谱图。图8的质谱图中,首先确定计算的得到UbK27C分子量m*为8790.3。由m/z-z=m*计算判断获得了UbK27+Aux。
图9是新型辅基连接臂装载到UbK27C脱除Acm的质谱图。图9的质谱图中,首先确定计算的得到UbK27C+Aux-Acm分子量m*为8719.06。由m/z-z=m*计算判断得到了UbK27C+Aux-Acm。
图10是运用新型辅基连接臂得到Ub(1-76)K27NCL产物的质谱图。图10的质谱图中,首先确定计算的得到Ub(1-76)K27NCL产物分子量m*为17265.87。由m/z-z=m*计算判断得到了Ub(1-76)K27NCL产物。
图11是运用新型辅基连接臂得到Ub(1-76)K27-Diub-终产物的质谱图。图11的质谱图中,首先确定计算的得到Ub(1-76)K27-Diub-终产物分子量m*为17129.66。由m/z-z=m*判断得到了Ub(1-76)K27-Diub-终产物。
Claims (10)
2.一种权利要求1所述的辅基连接臂的合成方法,其特征在于:首先以苯乙烯为原料合成1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-噁唑-3-基)-1-苯基乙烷,然后通过反应在1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-噁唑-3-基)-1-苯基乙烷上连接Acm保护基,最后通过噁唑烷酮开环反应制得Aux-linker。
3.根据权利要求2所述的合成方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:化合物I的合成
将2-氧代四氢-1,3-恶唑与水混合后室温下搅拌反应,反应25分钟后加入溴,同时加入氢氧化钠溶液将pH值调为偏碱性,5分钟后,滤出沉淀物,用水洗涤,室温下真空干燥,得到化合物I——3-溴-2-氧代四氢-1,3-噁唑;
步骤2:化合物II的合成
将化合物I加入含有有机物I——2,2'-二氰基-2,2'-氮丙烷的苯悬浮液中,60℃下加入新蒸馏的苯乙烯的苯溶液,搅拌5分钟后蒸发混合物,过滤并干燥,得到化合物II——1-溴-2-(2-氧代四氢-1,3-噁唑-3-基)-1-苯基乙烷;
步骤3:化合物III的合成
将化合物II溶于含有乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液的混合溶剂中,然后加入N-(巯基甲基)-乙酰胺并用NaOH溶液将反应体系的pH调节至碱性,室温下搅拌反应6-8小时;反应完成后,真空蒸发除去部分溶剂中的乙腈,再用有机溶剂萃取,将合并的萃取液用饱和NaCl溶液洗涤,减压浓缩并干燥,最后通过液相色谱纯化,得到化合物III——N-(((2-(2-氧代恶唑烷-3-基)-1-苯乙基)硫基)甲基)乙酰胺;
步骤4:目标产物的合成
先将溴化氢溶液置于冰浴下搅拌降温至0℃,再将化合物III溶解在溴化氢溶液中,撤除冰浴,在室温下搅拌反应20h,反应结束后将反应液加入有机溶剂中,生成乳黄色沉淀,得到粗产物,进一步通过半制备RP-HPLC纯化,然后在50℃减压蒸发,得到纯的目标产物—化合物IV。
4.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于:
步骤1中,2-氧代四氢-1,3-恶唑与溴的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于:
步骤2中,所述有机物I为2,2'-二氰基-2,2'-氮丙烷;苯乙烯、化合物I和有机物I的摩尔比为20:20:1。
6.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于:
步骤3中,化合物II与N-(巯基甲基)-乙酰胺的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于:
步骤3中,乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液的混合溶剂中乙腈和0.2M KCl-NaOH缓冲液的体积比为3:2;反应体系的pH值调至12。
8.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于:
步骤3中,液相色谱纯化时所用溶剂是由CH2Cl2与MeOH按体积比20:1的比例混合构成。
9.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于:
步骤4中,化合物III与溴化氢的摩尔比为1:9。
10.一种权利要求1所述的辅基连接臂的应用,其特征在于:
是通过Cyseine-Aminoethylation反应偶联装载到底物泛素上,再通过NCL与另一个泛素偶联,最后脱除辅基连接臂即可获得基于表达泛素单元的泛素链。
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GR01 | Patent grant | ||
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