CN109700766A - 一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统及制备方法，方法包括以下步骤：a、将含NHS活性酯的光疗剂与同时含氨基和马来酰亚胺基团的功能化聚乙二醇在pH7.0‑8.0缓冲液中反应30‑60分钟；b、将步骤a中所得物质过凝胶柱纯化，并立即投入含巯基基团的RGD多肽，避光反应1小时；c、将步骤b中反应所得产物过凝胶柱纯化后，得到整合素受体靶向的聚乙二醇纳米递药系统。本发明中的纳米递药系统能够实现高肿瘤渗透性，主要是由于聚乙二醇纳米递药系统粒径小，具有良好的肿瘤穿透性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统及制备方法。
背景技术
癌症是危害人类健康的重大疾病，且发病率逐年上升。尽管在过去的几十年里，癌症的治疗取得了一些实质性的进展，但是化疗药物的抗肿瘤效果仍然不尽人意，其中肿瘤耐药性的产生是制约临床肿瘤治疗的主要障碍。
肿瘤组织结构复杂，其内部一系列物理、生理屏障导致化疗药物很难穿透肿瘤并到达肿瘤组织内部，使肿瘤细胞长时间经受亚致死剂量的药物刺激，这是肿瘤产生耐药性的重要原因之一。因此，输送足够剂量的药物至肿瘤内部不仅是减少肿瘤耐药发生的需要，也是提高抗肿瘤效果的关键所在。
肿瘤血管生长迅速，形成不成熟、渗漏性比正常血管大、间质液压升高。纳米药物必须穿过血管壁与组织基质才能到达肿瘤细胞，而只有将足量的药物传递至肿瘤深处才有可能根除肿瘤防止复发。临床数据已经证实了高渗透长滞留（EPR）效应的存在，即大分子药物能够借助EPR效应到达肿瘤并滞留其中不被清除而发挥药效。与粒径大的纳米药物相比，粒径较小的纳米药物能够更快速的进入肿瘤细胞并更有效的传递药物，这是因为小粒径纳米药物的肿瘤穿透性能更好。
整合素（Integrin）是细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互黏附，并介导细胞与 ECM 之间的双向信号传导。整合素在多种肿瘤表面有高表达，如脑胶质瘤U87MG细胞系、人卵巢癌SKOV3细胞系。此外，整合素在肿瘤新生血管内皮细胞中表达量也很高，对肿瘤血管生成起着重要作用。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽（Arg-Gly-Asp，RGD）可为半数以上的整合素受体识别，因此，以RGD为靶头借助其与肿瘤细胞表面整合素受体的特异性结合可实现肿瘤主动靶向。
因此，为了防止肿瘤耐药性的产生，我们亟待找到切实可行的增加药物递送至实体瘤并达到治疗浓度的新方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统及制备方法，该递药系统具有提高药物向实体瘤递送的效率并使其在肿瘤细胞内的浓度达到治疗浓度，从而防止临床肿瘤治疗中耐药性的产生。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（一）是：一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，包括以下特征步骤：
a、将含NHS活性酯的光疗剂与同时含氨基与马来酰亚胺基团的功能化聚乙二醇在pH7.0-8.0缓冲液中反应30-60分钟；
b、将步骤a中所得物质过凝胶柱纯化，并立即投入含巯基基团的RGD多肽，避光反应1小时；
c、将步骤b中反应所得产物过凝胶柱纯化后，得到整合素受体靶向的聚乙二醇纳米递药系统。
进一步的，所述光疗剂与功能化的聚乙二醇的物质的量比为10:1-2:1。
进一步的，所述功能化聚乙二醇是线型或多臂聚乙二醇。
进一步的，所述功能化聚乙二醇包括Mal-PEG-NH2、4-arm PEG，2 arm-NH2，2 arm-Mal或8-arm PEG，4 arm-NH2，4 arm-Mal。
进一步的，所述光疗剂包括IRDye700-NHS或IRDye800-NHS。
进一步的，RGD多肽与功能化的聚乙二醇的物质的量比为10:1-4:1。
进一步的，所述RGD包括 cRGDfK-SH或cRGDyK-SH以及cRGDfK-SH或cRGDyK-SH的前体。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（二）是：一种经由上述方法制得的高肿瘤渗透性的纳米递药系统，以功能化的聚乙二醇为载体分子，以光疗剂为药物，以RGD多肽为靶头。
本发明的有益效果是：
本发明中的纳米递药系统能够实现高肿瘤渗透性，主要是由于聚乙二醇纳米递药系统粒径小，具有良好的肿瘤穿透性，且具有肿瘤主动靶向性，能够提高药物在肿瘤的分布从而达到治疗浓度。
附图说明
下面结合附图对本发明的高肿瘤渗透性的纳米递药系统及制备方法作进一步说明。
图1 cRGDfK-PEG-IR700在NIH/3T3与U87MG细胞的摄取照片；
图2 Cys-PEG-IR700与cRGDfK-PEG-IR700对U87MG细胞的光毒性；
图3 SKOV-3肿瘤球的穿透性考察。
具体实施方式
实施例1
本实施例涉及一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统及其制备方法。
一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：
a、将含NHS活性酯的光疗剂（B）（美国LI-COR公司出品）与同时含氨基和马来酰亚胺基团的功能化聚乙二醇（A）(美国Creative PEGWorks公司出品)在pH7.0-8.0缓冲液中反应30分钟。其中光疗剂（B）的NHS活性酯与功能化的聚乙二醇（A）的氨基的物质的量比为10:1。可以作为优选的是：功能化聚乙二醇（A）是线型或多臂聚乙二醇。进一步的，功能化聚乙二醇（A）可以包括Mal-PEG-NH2、4-arm PEG，2 arm-NH2，2 arm-Mal或8-arm PEG，4 arm-NH2， 4arm-Mal中的任一物质。光疗剂（B）包括IRDye700-NHS或IRDye800-NHS中任一物质。
b、将步骤a中所得物质过凝胶柱纯化，并立即投入含巯基基团的RGD多肽（C）（美国Peptides International公司出品），避光反应1小时。在本实施例中可以作为优选的是：RGD多肽（C）的巯基与功能化聚乙二醇（A）的马来酰亚胺基团的物质的量比为10:1。RGD（C）包括 cRGDfK-SH或cRGDyK-SH以及cRGDfK-SH或cRGDyK-SH的前体。
c、将步骤b中反应所得产物过凝胶柱纯化后，得到整合素受体靶向的聚乙二醇（A）纳米递药系统。
经由上述步骤制得的高肿瘤渗透性的纳米递药系统，以功能化的聚乙二醇（A）为载体分子，以光疗剂（B）为药物，以RGD多肽（C）为靶头。
实施例２
本实施例涉及一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统及其制备方法。
一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：
a、将含NHS活性酯的光疗剂（B）与同时含氨基和马来酰亚胺基团的功能化聚乙二醇（A）在pH7.0-8.0缓冲液中反应60分钟。其中光疗剂（B）的NHS活性酯与功能化的聚乙二醇（A）的氨基的物质的量比为2:1。可以作为优选的是：功能化聚乙二醇（A）是线型或多臂聚乙二醇。进一步的，功能化聚乙二醇（A）可以包括Mal-PEG-NH2、4-arm PEG，2 arm-NH2，2 arm-Mal或8-arm PEG，4 arm-NH2， 4 arm-Mal中的任一物质。光疗剂（B）包括IRDye700-NHS或IRDye800-NHS中任一物质。
b、将步骤a中所得物质过凝胶柱纯化，并立即投入含巯基基团的RGD多肽（C），避光反应1小时。在本实施例中可以作为优选的是：RGD多肽（C）的巯基与功能化聚乙二醇（A）的马来酰亚胺基团的物质的量比为4:1。RGD包括 cRGDfK-SH或cRGDyK-SH以及cRGDfK-SH或cRGDyK-SH的前体。
c、将步骤b中反应所得产物过凝胶柱纯化后，得到整合素受体靶向的聚乙二醇（A）纳米递药系统。
验证例
将Mal-PEG-NH2溶解于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，按照IR700/PEG物质的量比5:1迅速加入IR700-NHS，避光反应30至60分钟后，用凝胶脱盐柱纯化。与此同时，按照RGD/PEG物质的量比5:1立即投入cRGDfK-SH，继续避光反应1小时，用凝胶脱盐柱纯化即得cRGDfK-PEG-IR700。
取对数生长期的小鼠胚胎成纤维NIH/3T3细胞（美国标准生物品收藏中心）与人脑胶质瘤U87MG细胞（美国标准生物品收藏中心），消化并接种于玻璃底的培养皿中，待细胞贴壁后，分别给予cRGDfK-PEG-IR700共孵育12小时后，用冷PBS洗涤3次，用Hoechst 33342染色20分钟后，置于共聚焦显微镜下观察。如图1所示，cRGDfK-PEG-IR700在U87MG细胞的摄取显著优于NIH/3T3细胞，表明，本聚乙二醇纳米递药系统具有很强的肿瘤靶向性。
另取U87MG细胞接种于细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别给予Cys-PEG-IR700与cRGDfK-PEG-IR700共孵育12小时后，换以新鲜培养基，用660nm LED灯照射20分钟后，用Calcein AM/PI染色20分钟，换以新鲜培养基，用倒置荧光显微镜观察。如图2所示，cRGDfK-PEG-IR700处理的细胞出现强烈的PI信号，而Cys-PEG-IR700处理的细胞未见红色荧光信号，表明，cRGDfK-PEG-IR700具有明显的光毒性。
另取SKOV-3细胞培养成3D肿瘤球，分别给予IR700与cRGDfK-PEG-IR700共孵育6小时，换以新鲜培养基，用激光共聚焦显微镜观察。如图3所示，IR700处理的肿瘤球未见红色荧光信号，cRGDfK-PEG-IR700处理的肿瘤球内部可观察到红色的荧光信号，表明，cRGDfK-PEG-IR700具有良好的肿瘤穿透性。
本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，包括以下特征步骤：
a、将含NHS活性酯的光疗剂与功能化聚乙二醇在pH7.0-8.0缓冲液中反应30-60分钟，所述功能化聚乙二醇同时含氨基和马来酰亚胺基团；
b、将步骤a中所得物质过凝胶柱纯化，并立即投入含巯基基团的RGD多肽，避光反应1小时；
c、将步骤b中反应所得产物过凝胶柱纯化后，得到整合素受体靶向的聚乙二醇纳米递药系统。
2.根据权利要求1所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述光疗剂与功能化的聚乙二醇的物质的量比为10:1-2:1。
3.根据权利要求1所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述功能化聚乙二醇是线型或多臂聚乙二醇。
4.根据权利要求3所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述功能化聚乙二醇包括Mal-PEG-NH2、4-arm PEG，2 arm-NH2，2 arm-Mal或8-arm PEG，4 arm-NH2，4 arm-Mal。
5.根据权利要求1所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述光疗剂包括IRDye700-NHS或IRDye800-NHS。
6.根据权利要求1所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，其特征在于：RGD多肽与功能化的聚乙二醇的物质的量比为10:1-4:1。
7.根据权利要求1所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述RGD包括 cRGDfK-SH或cRGDyK-SH以及cRGDfK-SH或cRGDyK-SH的前体。
8.一种根据权利要求1所述高肿瘤渗透性的纳米递药系统的制备方法制得的纳米递药系统，其特征在于：以功能化的聚乙二醇为载体分子，以光疗剂为药物，以RGD多肽为靶头。
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