CN109700026A - 一种柑红茶提取物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种柑红茶提取物，其中包含：茶多酚、游离氨基酸、黄酮类化合物、可溶性糖、茶黄素、茶红素和茶褐素。柑红茶提取物具有较强的抗氧化、抑制细胞增殖和迁移的活性，可以用于制备PI3K信号通路抑制剂或MMPs信号通路抑制剂。

Description

一种柑红茶提取物

技术领域

本发明涉及食品领域，特别是一种柑红茶提取物。

背景技术

柑茶具有悠久的历史文化，由柑橘和茶结合而成。早在四五千年前的新石器时代就有柑橘的种植，在元代有记载新会栽种柑橘，明代的李时珍在《本草纲目》中对新会柑皮非常赞赏，“柑皮纹粗，黄而厚，内多白膜，其味辛甘……以广中(新会)采者为胜。”明清时期，新会柑列为贡品。加之新会优越的种植柑橘的自然条件，使新会柑成为的优质柑。茶的记载最早在《神农本草经》，“神农尝百草，日遇七十二毒，得茶而解之”。最初的柑茶以柑普茶为主，相传为清朝的罗天池首创，而后又出现柑红茶、柑绿茶、柑白茶等。目前，茶叶市场上具有竞争优势的是柑茶中的柑普茶，柑普茶中的小青柑，因其易于接受的果香、醇厚饱满的汤色、更具设计感的包装以及保健功效，倍受广大消费者的喜爱。柑红茶(citrusreticulate peel black tea,CRPBT)是由柑橘皮和红茶结合而成的一种新产品，目前已有相关专利报道。

柑红茶的成分与功能研究主要是基于其组分柑皮和红茶的研究，许多研究发现柑皮中的主要成分橙皮苷在消化系统、心血管系统、呼吸系统、抗氧化抗疲劳等方面具有一定的调节和保护作用；红茶中的功能成分包括茶多酚、茶氨酸、茶黄素、茶红素和可溶性糖等，其保健作用主要有抗氧化、降脂减肥、降血糖、降血压等。

虽然柑皮和红茶的研究比较多，但是目前没有关于柑红茶的成分与生物活性的系统研究。

发明内容

针对以上现有技术存在的问题和不足，本发明制备得到了柑红茶的提取物，并系统研究了其生物活性。

本申请提供了一种柑红茶提取物，其特征在于该提取物按重量份包含：茶多酚10-30份、游离氨基酸0.1-3份、黄酮类化合物0.1-4份、可溶性糖0.1-2份、茶黄素0.1-1份、茶红素0.1-2份和茶褐素0.1-10份。

具体的，该提取物按重量份包含：茶多酚25-30份、游离氨基酸2-3份、黄酮类化合物2-4份、可溶性糖1-2份、茶黄素0.1-0.2份、茶红素1-2份和茶褐素5-8份。

本申请提供了一种柑红茶提取物，其特征在于该提取物按重量份包含：表没食子儿茶素EGC 10-16份，没食子儿茶素C 2-5份，表儿茶素EC 5-8份，表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 2-4份，没食子儿茶素没食子酸酯GCG 2-4份，表儿茶素没食子酸酯ECG 6-11份，儿茶素没食子酸酯CG 2-5；3,5,6,7,8,3,4-七多甲氧基黄酮0.1-1份，5-去甲川陈皮素0.1-1份，异甜橙黄酮0.1-1份，甜橙黄酮0.1-1份，川陈皮素5-10份，橘皮素2-4份；咖啡碱40-70份，没食子酸2-6份。

具体的，该提取物按重量份包含：表没食子儿茶素EGC 12-16份，没食子儿茶素C3-5份，表儿茶素EC 6-8份，表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 2-4份，没食子儿茶素没食子酸酯GCG 2-4份，表儿茶素没食子酸酯ECG 8-11份，儿茶素没食子酸酯CG 2-5；3,5,6,7,8,3,4-七多甲氧基黄酮0.1-1份，5-去甲川陈皮素0.1-1份，异甜橙黄酮0.1-1份，甜橙黄酮0.1-1份，川陈皮素6-10份，橘皮素2-4份；咖啡碱55-70份，没食子酸4-6份。

如前所述的柑红茶提取物的用途，其特征在于用于制备抗氧化的产品。

如前所述的柑红茶提取物的用途，其特征在于用于制备PI3K信号通路抑制剂或MMPs信号通路抑制剂。

如前所述的用途，其特征在于MMPs为MMP-2和/或MMP-9。

如前所述的用途，其中所述的抑制剂为试剂。

如前所述的用途，其特征在于试剂为检测试剂或体外诊断试剂。

如前所述的柑红茶提取物的用途，其特征在于用于制备预防或治疗肝癌或肝癌转移的药物。

所述的柑红茶提取物的制备方法为：称取柑红茶，粉碎为粗粉，加入煮沸蒸馏水并90℃水浴浸提，趁热过滤茶汤，60℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得柑红茶冻干粉。

更具体地，其制备方法为：称取一定量的柑红茶，粉碎为粗粉，按料液比(W/V,g/mL)＝1:20加入煮沸蒸馏水并90℃水浴浸提30min，趁热过滤茶汤，重复浸提3次，合并茶汤，60℃旋转蒸发浓缩至约1/10的原体积，冷冻干燥即得柑红茶冻干粉。

本申请与现有技术相比，最大的特点及优点是，将柑红茶作为一个产品一个整体，研究其健康功能作用机制，这样可以直接反映这个产品的健康功能。

具体地：

1、我们的柑红茶的组分包括新会柑和英红九号红茶，新会柑为优质柑，而且极具地域特色，英红九号红茶为广东省农业科学院茶叶研究所选育的特色红茶，二者结合而成的柑红茶更加具有广东特色，是一种得天独厚的新产品，其健康功能价值非常值得发掘。

2、柑红茶的前处理，我们是以一个整体进行粉碎、提取、过滤、浓缩、并冻干成柑红茶冻干粉。这样处理可以有效避免因分别处理导致的品质差异和有效成分的种类及含量的不同。

3、为了便于全面地分析柑红茶的有效成分，我们不但分析了其主要的常规生化成分，而且分别检测了其中柑皮和红茶主要的单体活性成分。

3、柑红茶提取物的生物活性分析，我们不仅用MTT法检测，还用系统的体外抗氧化测评方法与Would healing实验，综合反映其生物活性。多种方法的测试有利于进一步肯定其健康功能作用。

4、我们不仅分析了柑红茶提取物与细胞增殖与凋亡相关的蛋白调控，也检测了与细胞迁移与侵袭相关的蛋白调控，多方面的蛋白调控分析有助于我们对柑红茶提取物的生物活性进行深入的挖掘和分析。

5、我们首次发现了柑红茶提取物可以作为PI3K信号通路抑制剂或MMPs信号通路抑制剂。

附图说明

图1为柑红茶外观审评图，图A为外观；图B为剥开图；图C为冲泡茶汤；图D为茶底；

图2为柑红茶提取物体外清除自由基IC50值，图A为清除DPPH自由基的IC₅₀值；图B为清除ABTS自由基的IC₅₀值；图C清除OH自由基的IC50值；

图3为柑红茶提取物抑制HepG2细胞增殖的检测，图A为HepG2细胞的24h/48h加药细胞形态；图B和图C为处理HepG2细胞24h/48h的MTT结果；

图4为柑红茶提取物抑制HepG2细胞迁移的测定，图A为抑制HepG2细胞迁移的24h/48h划痕图；图B和图C为图A的量化结果；

图5为柑红茶提取物对增殖相关蛋白的调控，该图是柑红茶对HepG2细胞中p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt蛋白调控的分析；

图6是柑红茶提取物对迁移与侵袭相关蛋白的调控，该图是柑红茶对HepG2细胞中MMP2/9、N-cadhein及Vimetin蛋白调控的分析。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1：柑红茶提取物的制备

称取一定量的柑红茶，粉碎为粗粉，按料液比(W/V,g/mL)＝1:20加入煮沸蒸馏水并90℃水浴浸提30min，趁热过滤茶汤，重复浸提3次，合并茶汤，60℃旋转蒸发浓缩至约1/10的原体积，冷冻干燥即得柑红茶冻干粉。

实施例2：检测和实验方法：

1.柑红茶生化成分及儿茶素、橙皮苷、咖啡碱单体成分检测

茶多酚含量：GB/T 31740.2-2015《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；游离氨基酸含量：GB/T 8314-2013《茶游离氨基酸总量的测定》；可溶性糖含量：蒽酮-硫酸比色法；茶黄素、茶红素、茶褐素总量测定：系统比色法。

色谱柱：phenomenex C18柱(150×4.6mm，5μm)；检测波长280nm；检测温度28℃；流动相A：含0.5％乙酸、1％乙腈和2％甲醇的水溶液，流动相B：含0.5％乙酸、10％乙腈和20％甲醇的水溶液；洗脱步骤：在30min内，A相由72.5％到20％，B相由27.5％到80％，30min后在5min内，A相由20％恢复到72.5％，B相由80％恢复到27.5％，流速1.0ml/min，进样量10μl。以外标法按峰面积进行定量。

2.柑红茶提取物的体外抗氧化能力测评

第一、柑红茶提取物清除DPPH自由基能力的测定

(1)DPPH溶液的配制

配制0.1mM浓度的DPPH无水乙醇的溶液

准确称取19.72mg DPPH，用无水乙醇溶解定容至500ml，备用。

(2)样品测定

柑红茶冻干粉用去离子水溶解，分别配制梯度浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml，并以茶汤浓度1/5的VC水溶液作为对照。取DPPH溶液2ml，与1ml不同浓度溶液混合，充分混匀后，室温，暗室放置30min，517nm处测吸光度。以2/3的乙醇溶液调零。以超纯水代替各样品溶液做空白对照。

(3)数据计算公式

I％＝(Ablank-Asimple)/Ablank×100

第二、柑红茶提取物清除OH自由基能力的测定

(1)溶液的配制

FeSO₄溶液(1.8mmol/ml)：称取FeSO₄晶体0.2736g，用水定容于100ml容量瓶中，使用时稀释9倍；

H₂O₂(0.3％)：取30％的过氧化氢溶液1.00ml，用水定容于100ml容量瓶中；

水杨酸-乙醇(1.8mmol/ml)：称取水杨酸固体0.2486g，用无水乙醇定容于100ml容量瓶中，使用时稀释9倍。

(2)样品的测定

柑红茶冻干粉用去离子水溶解，分别配制浓度梯度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml，并以茶汤浓度1/5的VC水溶液作为对照。向试管中加入待测溶液1.00ml(空白管用蒸馏水代替)，FeSO₄溶液2.00ml，水杨酸-乙醇1.50ml，最后加H₂O₂(0.3％)0.10ml启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min，在波长510nm下测量各自的吸光度值.

(3)数据计算公式

羟基自由基清除率计算公式为：

D＝[(A0-As)/A0]×100％

式中，A0为空白管的吸光度，As为加入自由基清除剂后的吸光度

第三柑红茶提取物清除ABTS自由基能力的测定

(1)ABTS自由基储存液的配制

14mmol/L ABTS溶液：准确称取76.82mg ABTS(548.68)，用超纯水溶解，定容至10ml，备用。

4.9mmol/L过硫酸钾溶液：准确称取13.25mg过硫酸钾(270.32),用超纯水溶解，定容至10ml，备用。

将上述2种溶液等体积混合，即得终浓度的混合液。

配制终浓度为7mmol/L ABTS和2.45mmol/L过硫酸钾的混合液，室温避光条件下静置过夜(12h)，制得ABTS自由基储存液，使用时用水稀释至734nm处吸光度为0.70+0.02的应用液。

(2)样品测定

柑红茶冻干粉用去离子水溶解，分别配制浓度梯度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml，并以茶汤浓度1/5的VC水溶液作为对照。把100μl待测液加入3ml ABTS应用液，充分混合，室温下避光反应6min后测定其在734nm处的吸光度(10min内吸光度稳定，以高纯水调零，空白管用高纯水代替测试样品溶液；对照管高纯水代替ABTS工作液。计算公式：I％＝(Ablank-(Asimple-A对照))/Ablank×100(此实验对照皆为0)。

(3)数据计算公式

I％＝(Ablank-(Asimple-A对照))/Ablank×100(此实验对照皆为0)。

3.MTT实验和Wound healing实验

第一MTT实验

(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁴个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液；

(2)于37℃5％CO₂培养过夜，待次日细胞贴壁后，吸去孔内培养液，模型孔和药物孔分别加入给定浓度的酒精100μl，对照孔每孔加入100μl无FBS培养基作为对照组，调零孔每孔加入100μl无FBS培养基作为调零组，每组均设4～6个复孔(平行孔)，用PBS填充其他空白孔。细胞放入培养箱(37℃5％CO₂)培养24h(或其他指定时间)；

(3)吸去孔内培养液，药物孔加入不同浓度柑红茶100μl/孔，对照孔、模型孔和调零孔加入无FBS培养基100μl/孔，细胞放入培养箱(37℃5％CO₂)培养24h(或其他指定时间)；

(4)培养结束，每孔加入10/15μl MTT(5mg/ml)，培养3～4h；

(5)终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μl MDSO，37℃温箱孵育10min或摇床低速振荡10min；

(6)用酶标仪在490nm波长下测OD值，按下式计算细胞活性。

细胞活性(％)＝(给药组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100％

第二Wound healing实验

先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。制备密度为1.5×10⁵的细胞悬液，每孔2ml均匀的接种于6孔板，培养液含10％胎牛血清，置于培养箱中培养过夜，使形成单层贴壁细胞。细胞贴壁后，用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入浓度梯度的柑红茶，Control组加入无血清培养基。每组设置三个重复试验。放入37度5％CO₂培养箱，培养。按0、24、48小时取样，拍照。

4.Western blot免疫印迹法分析柑红茶提取物抑制HepG2的细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的蛋白机制

第一细胞总蛋白的提取

(1)细胞的预处理：由37℃CO₂培养箱中取出于6cm直径的细胞培养皿中培养的HepG2细胞，(细胞数约为8×10⁵个/4ml培养液)，吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS洗细胞表面3-4次，以去除培养基中的血清及死细胞，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。将洗涤后细胞直接冻存于-80℃冰箱，待提取蛋白质。此方法可保存细胞至少两周。(注：如果需要，当用PBS洗涤细胞后，不必-80℃冰箱冻存，可直接进行步骤2)

(2)加入含PMSF的裂解液：由-80℃冰箱中取出细胞培养皿，将其置于冰上，向上述各培养皿中加300μl含PMSF的细胞裂解液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。

(3)冰浴10min(通常冰浴时间为30-60min)，期间晃动培养皿，使其作用均匀。

(4)用Tip头集中蛋白提取液，将其收集入冰上预冷的1.5ml Ep管中，4℃离心，13200rmp×20min。

(5)将上清液小心移入预冷的0.5ml离心管中(为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用)，-80℃保存备用。

第二细胞总蛋白含量的测定(BCA法)

(1)需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋白。

(2)按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液200μl(A：B＝50：1)。有6个样品，加上6个标准蛋白和空白对照，3个复孔。共有36个孔。则A液取10ml，B液取200μl两液混匀，加入96孔板，每孔200μl。然后加入标准蛋白25μl及样品蛋白(蛋白样品5μl+20μl去离子水，即稀释5倍)。(标准蛋白先配好浓度0，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mg/ml)。

(3)将孔板放入37℃温箱孵育30min。

(4)用酶标仪562nm处测OD值，用标准曲线法计算蛋白浓度。

(5)调整蛋白浓度后(用裂解液和4×上样缓冲液调整蛋白浓度)，98℃5min加热变性，插入冰中冷却后，于-20℃保存。

第三制备SDS-PAGE凝胶

(1)准备SDS-PAGE凝胶用玻璃槽：清洗玻璃板，将两块玻璃板(一个长板一个短板，其中一块为凹形)组合并放置于制胶架夹紧，于玻璃槽中加入去离子水验漏，确定灌制分离胶液面标志线(距样品梳子底部约0.5-1.0cm处)；

(2)配制5％浓缩胶(制2块)：去离子水4.05ml；30％丙烯酰胺1.005ml；1.0M Tris-Cl pH6.8 0.75ml；10％APS 0.06ml；10％SDS 0.06ml；TEMDE(临灌胶前再加)0.006ml；

(3)配制10％SDS-PAGE分离胶：去离子水7.08ml；30％丙烯酰胺6.0ml；1.5M Tris-Cl pH8.8 4.56ml；10％APS 0.18ml；10％SDS 0.18ml；振动仪震动数秒；

(4)灌制分离胶：在通风橱加TEMED 0.012ml，立即灌胶，灌至分离胶液面标志线，立即加入无水乙醇与顶部平齐，分离胶凝固后倒掉无水乙醇；

(5)灌制浓缩胶与插样品梳：用吸水纸尽可能吸干玻璃槽中的无水乙醇，轻轻加入5％浓缩胶液(注意避免产生气泡)，插入样品梳，使液面至样品梳上标志线位置，室温凝胶约40min；

(6)取下有SDS-PAGE凝胶的玻璃板，置于密封袋中，并加入去离子水适量保持凝胶湿润，封口，于4℃冰箱中保存，备用。

第四样品变性及电泳(恒压，浓缩胶80V 10-30min，分离胶110V 60-90min)

(1)由-20℃冰箱取出调整浓度后的组织蛋白样品，37℃水浴融化，立即插入冰中(减少蛋白降解)。

(2)吸取组织蛋白样品80μl加入1.5ml EP管中，每样品管中分别加入20μl 4×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，旋涡数秒，短暂离心，98℃变性5min，立即插入冰中，快速冷却至室温，旋涡数秒，短暂离心。

(3)移液枪吸取变性蛋白液20μl，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中，样品蛋白两端分别加入5μl Marker。

(4)将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V使样品通过浓缩胶(电压约8v/cm)。当染料进入分离胶后，将电压调高到110V(约11v/cm),继续电泳约60min,使染料至分离胶底部位置，结束电泳。

第五转膜

(1)PVDF膜的预处理：剪裁与胶大小一致(8.3×6.0cm)的PVDF膜，将其浸入甲醇平衡5min以上，备用。(注意：必须保证PVDF膜完全浸于甲醇中)；

(2)转移缓冲液制备：取一瓶配制转移缓冲液的固体粉末，溶于800ml去离子水+200ml甲醇，置于4℃冰箱，备用；

(3)取与胶同样大小的滤纸与海绵，用转移缓冲液浸泡后待用；

(4)取下电泳板，将其平置(使“凹”面玻璃板在下)，小心去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1×转膜液漂洗一次。

(5)转膜：将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为黑色海绵→1层白色海绵垫片→样品胶→PVDF膜→1层滤纸→1层白色海绵垫片(注意：排除气泡)→黑色海绵，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中(黑对黑)，并放入冰盒，周围用冰或冰袋冰盒包裹(使转移缓冲液保持在4℃左右)；正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动(膜侧对红色侧)。接通电源，恒流275-300mA 60-90min，中间换一次转移电泳槽中的冰盒；小心取出转移膜，膜剪角或标记膜，在1×TBST液中漂洗两次后放入封闭液中封闭。

第六封闭、抗体孵育及曝光

(1)封闭：将转移后的膜放入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭90min(或4℃过夜)；

(2)一抗反应

①将一抗用抗体稀释液稀释1000倍，配制为一抗工作液；

②封闭结束后，回收封闭液，将膜用1×TBST漂洗2-3次至干净，剪膜，放入一抗工作液中，4℃反应过夜；

(3)洗膜

回收一抗工作液，将膜用1×TBST洗涤三次(室温下缓慢摇动洗涤)，每次5min，洗净未结合的一抗；

(4)二抗反应

①将对应的二抗用1×TBST稀释16000倍，配制为二抗工作液；

②将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中(室温、避光缓慢摇动)作用50min(不超过60min)；

(5)洗膜：用1×TBST洗膜，方法同“3”，洗去游离二抗；

(6)曝光及洗片：

①按1：1(v/v)混合ECL试剂盒中两种液体；

②将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用2min。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住PVDF膜(避免在膜的上面出现气泡)；

③在暗室中(红光下)将X光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间；

④将曝光后X光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影1min(具体曝光时间及显影时间需根据显影结果作出调整)；

曝光可根据实验条件选择适宜方法。

实施例3：实验结果

表1柑红茶提取物常规生化成分及含量(％)

通过该项分析可以看出，柑红茶提取物主要包含：茶多酚、游离氨基酸、黄酮类化合物、可溶性糖、茶黄素、茶红素和茶褐素。

柑红茶提取物主要包含：茶多酚、游离氨基酸、黄酮类化合物、可溶性糖、茶黄素、茶红素和茶褐素。其重量份分别为：茶多酚10-30份、游离氨基酸0.1-3份、黄酮类化合物0.1-4份、可溶性糖0.1-2份、茶黄素0.1-1份、茶红素0.1-2份和茶褐素0.1-8份。

表2柑红茶的儿茶素、黄酮类、咖啡碱及没食子酸成分及含量(mg/g)

此表中的简写分别代表如下含义：儿茶素(catechin,C)、表儿茶素(epicatechin,EC)、没食子儿茶素(gallocatechin,GC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、儿茶素没食子酸酯(catechin gallate,CG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)及表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)。

柑红茶提取物按重量份主要包含：表没食子儿茶素10-16份EGC，没食子儿茶素C2-5份，表儿茶素EC 5-8份，表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 2-4份，没食子儿茶素没食子酸酯GCG 2-4份，表儿茶素没食子酸酯EC G6-11份；3,5,6,7,8,3,4-七多甲氧基黄酮0.1-1份，5-去甲川陈皮素0.1-1份，异甜橙黄酮0.1-1份，甜橙黄酮0.1-1份，川陈皮素5-10份，橘皮素2-4份；咖啡碱40-70份，没食子酸2-6份。

图2为柑红茶提取物体外清除自由基IC₅₀值，图A为清除DPPH自由基的IC₅₀值；图B为清除ABTS自由基的IC₅₀值；图C清除OH自由基的IC₅₀值；以此可以看出，柑红茶提取物具有较强的抗氧化活性。

图3为柑红茶提取物抑制HepG2细胞增殖的检测，图A为HepG2细胞的24h/48h加药细胞形态；图B和图C为处理HepG2细胞24h/48h的MTT结果；柑红茶提取物可以抑制HepG2细胞增殖，且呈浓度依赖。

图4为柑红茶提取物抑制HepG2细胞迁移的测定，图A为抑制HepG2细胞迁移的24h/48h划痕图；图B和图C为图A的量化结果；柑红茶提取物可以抑制HepG2细胞迁移，且呈浓度依赖。

图5为柑红茶提取物对增殖相关蛋白的调控，该图是柑红茶提取物对HepG2细胞中p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt蛋白调控的分析；柑红茶提取物可以抑制p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt信号通路。

图6是柑红茶提取物对迁移与侵袭相关蛋白的调控，该图是柑红茶提取物对HepG2细胞中MMP2/9、N-cadhein及Vimetin蛋白调控的分析。柑红茶提取物可以抑制p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt信号通路，抑制HepG2细胞中MMP2/9、N-cadhein及Vimetin蛋白的表达。

以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代，虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

Claims (10)

1.一种柑红茶提取物，其特征在于该提取物按重量份包含：茶多酚10-30份、游离氨基酸0.1-3份、黄酮类化合物0.1-4份、可溶性糖0.1-2份、茶黄素0.1-1份、茶红素0.1-2份和茶褐素0.1-10份。

2.如权利要求1所述的红茶提取物，其特征在于该提取物按重量份包含：茶多酚25-30份、游离氨基酸2-3份、黄酮类化合物2-4份、可溶性糖1-2份、茶黄素0.1-0.2份、茶红素1-2份和茶褐素5-8份。

3.一种柑红茶提取物，其特征在于该提取物按重量份包含：表没食子儿茶素EGC 10-16份，没食子儿茶素C 2-5份，表儿茶素EC 5-8份，表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 2-4份，没食子儿茶素没食子酸酯GCG 2-4份，表儿茶素没食子酸酯ECG 6-11份，儿茶素没食子酸酯CG2-5；3,5,6,7,8,3,4-七多甲氧基黄酮0.1-1份，5-去甲川陈皮素0.1-1份，异甜橙黄酮0.1-1份，甜橙黄酮0.1-1份，川陈皮素5-10份，橘皮素2-4份；咖啡碱40-70份，没食子酸2-6份。

4.如权利要求3所述的提取物，其特征在于：该提取物按重量份包含：表没食子儿茶素EGC 12-16份，没食子儿茶素C 3-5份，表儿茶素EC 6-8份，表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG2-4份，没食子儿茶素没食子酸酯GCG 2-4份，表儿茶素没食子酸酯ECG 8-11份，儿茶素没食子酸酯CG 2-5；3,5,6,7,8,3,4-七多甲氧基黄酮0.1-1份，5-去甲川陈皮素0.1-1份，异甜橙黄酮0.1-1份，甜橙黄酮0.1-1份，川陈皮素6-10份，橘皮素2-4份；咖啡碱55-70份，没食子酸4-6份。

5.如权利要求1-4任一项所述的柑红茶提取物的用途，其特征在于用于制备抗氧化的产品。

6.如权利要求1-4任一项所述的柑红茶提取物的用途，其特征在于用于制备PI3K信号通路抑制剂或MMPs信号通路抑制剂。

7.如权利要求6中所述的用途，其特征在于MMPs为MMP-2和/或MMP-9。

8.如权利要求6所述的用途，其中所述的抑制剂为试剂。

9.如权利要求6中所述的用途，其特征在于试剂为检测试剂或体外诊断试剂。

10.如权利要求1或2所述的柑红茶提取物的用途，其特征在于用于制备预防或治疗肝癌或肝癌转移的药物。