CN109690312A - 生物标记特征和其用途 - Google Patents

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CN109690312A CN201780035793.2A CN201780035793A CN109690312A CN 109690312 A CN109690312 A CN 109690312A CN 201780035793 A CN201780035793 A CN 201780035793A CN 109690312 A CN109690312 A CN 109690312A
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帕扬·德尔法尼
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Abstract

本发明提供一种用于确定受试者中系统性红斑狼疮相关疾病状态的方法,所述方法包含以下步骤:(a)提供待测试样品;和(b)测量选自表A中所定义组的一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量,其中选自表A中所定义组的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量指示系统性狼疮相关疾病状态。本发明还提供适用于本发明的方法的阵列和试剂盒。

Description

生物标记特征和其用途
技术领域
本发明涉及用于确定系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标记,以及其特征和阵列和其使用方法。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是一种具有非均匀呈现的严重慢性系统性自身免疫性疾病(1,2)。疾病的特征在于以尚不可预测的方式突发和缓解的交替周期。SLE的治疗迄今为止限于治疗症状,基本上是试图减少并且最小化暴发的影响(3)。损伤的累积是随时间推移的疾病活动、治疗的副作用和/或共存病状的函数,并且与发病率和死亡率相关。因此,预测、检测并且监测暴发的发作、严重程度和尤其对肾活性水平的反应的新颖方式是治疗方案选择和治疗修改以及预后所必需的(2-4)。目前,使用指数,如基于在9个器官中24个描述符(历经10或30天研究)的SLEDAI-2K评估疾病活动性(5)。SLE的肾脏受累的监测通常取决于尿显微镜评估,其已被证明与较大方法缺点相关联(6)。到目前为止,肾活检已成为评估疾病活动性和肾脏受累的最高准则,但对快速、微创方法(如基于血液的检查)的需求是显而易见的。
在历史上,已探索主要单血清生物标记,如C1q、C3、C4、IL-6、TNF-α和各种自身抗体用于检测和监测暴发,但性能不同并且一般是低的(4,7-11)。在最近几年,因此已经尝试破译生物标记组,更好地反映SLE与SLE疾病活动性(12-17)。如实例,Li和同事使用30重抗原阵列以描绘试图区分具有更严重疾病活动性的狼疮患者的候选血清自身抗体簇(18)。此外,Bauer和同事使用常规抗体微阵列预先验证血清趋化因子(IP-10、MCP-1和MIP3B)的3重组以得到疾病活动性(16,17)。
最近,高性能重组抗体微米和纳米阵列设置已用于破译与SLE相关的多重血清和尿液生物标记(19,20)(等人,提交;Delfani等人,2016,狼疮(《Lupus》)26(4):373-387)。在这些项目中,通过靶向主要免疫调节蛋白,作者探索使用免疫系统作为在表示临床免疫蛋白质组的方法中的SLE的特异性和敏感的传感器(21)。结果显示,可以破译反映SLE、SLE表型和SLE疾病活动性的多重候选血清(和尿液)生物标记。
然而,仍然需要识别疾病活动性的生物标记和生物标记特征,以便快速识别主动(暴发)和被动(缓解/非暴发)疾病状态,以允许快速治疗暴发和在非暴发期间撤消治疗,尽量减少因未治疗活动性疾病和过度治疗(非活动性SLE期间施加治疗)造成的损害。
发明内容
本发明源于使用在暴发和缓解期间收集的SLE样品进行的血清蛋白表达谱的研究。应用再优化的重组抗体微阵列平台,其显示改进的性能并且靶向较大集合的免疫调节蛋白(19)(Delfani等人,2016,同上)。结果展示可以从粗血清样品中破译反映疾病活动性的浓缩、高性能血清生物标记特征。
因此,本发明第一方面提供一种用于确定受试者中系统性红斑狼疮相关疾病状态的方法,所述方法测量选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记的测试样品的存在和/或量,其中选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记的一种多种生物标记的存在和/或量指示系统性红斑狼疮相关疾病状态。
替代性地或另外,所述方法包含以下步骤或由以下步骤组成:
a)提供待测试样品;和
b)测量选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量;
其中选自表A中所定义的组的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量指示所述受试者中的所述系统性红斑狼疮相关疾病状态。
因此,本发明提供用于确定受试者中系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标记和生物标记特征。
术语“系统性红斑狼疮相关疾病状态”可以表示或包括(i)SLE的存在或不存在(例如,区分活动性SLE与非SLE,非活动性SLE与非SLE和/或高活性SLE)来自非SLE),以及(ii)SLE的活动(例如,区分活动SLE与非活动SLE,和/或区分高活性SLE与非活动SLE)。
因此,在一个实施例中,方法用于诊断受试者中的活动性SLE(例如SLE暴发)。
优选地,个体是人,但可以是任何哺乳动物,如驯养的哺乳动物(优选具有农业或商业意义的哺乳动物,包括马、猪、牛、绵羊、狗和猫)。
为避免疑义,可以在步骤(a)中提供来自多于一种疾病状态的测试样品,例如≥2、≥3、≥4、≥5、≥6或≥7种不同疾病状态。步骤(a)可以提供至少两个测试样品,例如≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10、≥15、≥20、≥25、≥50或≥100个测试样品。在提供多个测试样品的情况下,其可以具有相同类型(例如均为血清或尿液样品)或具有不同类型(例如血清和尿液样品)。
替代性地或另外,所述方法进一步包含以下步骤或由以下步骤组成:
c)向所述受试者提供来自具有不同系统性红斑狼疮相关疾病状态的个体的对照样品;和
d)测量步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述对照样品中的存在和/或量;
其中在步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量不同于在所述对照样品中的存在和/或量的情况下,识别所述系统性红斑狼疮相关疾病状态。
为避免疑义,可以在步骤(c)中提供来自多于一种疾病状态的对照样品,例如≥2、≥3、≥4、≥5、≥6或≥7种不同疾病状态。步骤(c)可以提供至少两个对照样品,例如≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10、≥15、≥20、≥25、≥50或≥100个对照样品。在提供多个对照样品的情况下,其可以具有相同类型(例如均为血清或尿液样品)或具有不同类型(例如血清和尿液样品)。优选地,测试样品类型与对照样品类型匹配/对应。
“不同于对照样品中的存在和/或量”意指或包括测试样品中一种或多种生物标记的存在和/或量不同于一个或多个对照样品中一种或多种生物标记的存在和/或量(或与预定的表示相同的存在和/或量的参考值不同)。优选地,测试样品中的存在和/或量与一个或多个对照样品中的存在或量(或对照样品的平均值)相差至少±5%,例如一个或多个对照样品(例如阴性对照样品)的至少±6%、±7%、±8%、±9%、±10%、±11%、±12%、±13%、±14%、±15%、±16%、±17%、±18%、±19%、±20%、±21%、±22%、±23%、±24%、±25%、±26%、±27%、±28%、±29%、±30%、±31%、±32%、±33%、±34%、±35%、±36%、±37%、±38%、±39%、±40%、±41%、±42%、±43%、±44%、±45%、±41%、±42%、±43%、±44%、±55%、±60%、±65%、±66%、±67%、±68%、±69%、±70%、±71%、±72%、±73%、±74%、±75%、±76%、±77%、±78%、±79%、±80%、±81%、±82%、±83%、±84%、±85%、±86%、±87%、±88%、±89%、±90%、±91%、±92%、±93%、±94%、±95%、±96%、±97%、±98%、±99%、±100%、±125%、±150%、±175%、±200%、±225%、±250%、±275%、±300%、±350%、±400%、±500%或至少±1000%。
替代性地或另外,测试样品中的存在或量不同于对照样品中的平均存在或量,与对照样品中的平均存在或量相差至少>1标准差,例如与对照样品中的平均存在或量相差≥1.5、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10、≥11、≥12、≥13、≥14或≥15标准差。可以使用任何合适的手段来确定标准差(例如直接、平方和、维尔福德(Welford)),然而,在一个实施例中,使用直接方法(即,[样品减去平均值的平方和,除以样品数]的平方根)确定标准偏差。
替代性地或另外,“不同于对照样品中的存在和/或量”意指或包括,测试样品中的存在或量以统计学上显著方式与对照样品中的量不相关。“以统计学上的显著方式与对照样本中的量不相关”意指或包括测试样本中的存在或量与对照样本中的存在或量相关,其中p值为>0.001,例如,>0.002、>0.003、>0.004、>0.005、>0.01、>0.02、>0.03、>0.04、>0.05、>0.06、>0.07、>0.08、>0.09或>0.1。可以使用任何合适的确定技术人员已知的p值的手段,包括z-检验、t-检验、学生t-检验、f-检验、曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney Utest)、威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)和皮尔森卡方检验(Pearson′s chi-squared test)。
替代性地或另外,所述方法进一步包含以下步骤或由以下步骤组成:
e)向所述受试者提供来自具有相同系统性红斑狼疮相关疾病状态的个体的对照样品;和
f)测量步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述对照样品中的存在和/或量;
其中在步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的表达对应于在步骤(f)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述对照样品中的表达的情况下,识别所述系统性红斑狼疮相关疾病状态。
为避免疑义,可以在步骤(e)中提供来自多于一种疾病状态的对照样品,例如≥2、≥3、≥4、≥5、≥6或≥7种不同疾病状态。步骤(e)可以提供至少两个对照样品,例如≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10、≥15、≥20、≥25、≥50或≥100个对照样品。在提供多个对照样品的情况下,其可以具有相同类型(例如均为血清或尿液样品)或具有不同类型(例如血清和尿液样品)。优选地,测试样品类型与对照样品类型匹配/对应。
“对应于对照样品中的存在和/或量”意指或包括存在和/或量与阳性对照样品的存在和/或量一致;或更接近于一个或多个阳性对照样品的存在和/或量而不是一个或多个阴性对照样品的存在和/或量(或接近于表示相同存在和/或量的预定参考值)。优选地,存在和/或量在一个或多个对照样品的存在和/或量(或对照样品的平均值)的±40%内,例如,在一个或多个对照样品(例如阳性对照样品)的±39%、±38%、±37%、±36%、±35%、±34%、±33%、±32%、±31%、±30%、±29%、±28%、±27%、±26%、±25%、±24%、±23%、±22%、±21%、±20%、±19%、±18%、±17%、±16%、±15%、±14%、±13%、±12%、±11%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.05%或0%内。
替代性地或另外,测试样品中的存在或量与对照样品中的严均存在或量相差≤5标准差,例如与对照样品中的平均存在或量相差≤4.5、≤4、≤3.5、≤3、≤2.5、≤2、≤1.5、≤1.4、≤1.3、≤1.2、≤1.1、≤1、≤0.9、≤0.8、≤0.7、≤0.6、≤0.5、≤0.4、≤0.3、≤0.2、≤0.1或0标准差,条件是不同和对应的生物标记表达的标准差范围不重叠(例如邻接但不重叠)。
替代性地或另外,“对应于对照样品中的存在和/或量”意指或包括测试样品中的存在或量以统计学上显著方式与对照样品中的量相关。“以统计学上的显著方式与对照样本中的量相关”意指或包括测试样本中的存在或量与对照样本中的存在或量相关,其中p值≤0.05,例如,≤0.04、≤0.03、≤0.02、≤0.01、≤0.005、≤0.004、≤0.003、≤0.002、≤0.001、≤0.0005或≤0.0001。
可以通过技术人员已知的任何合适的手段来确定生物标记的差异表达(上调或下调)或其缺乏。差异表达确定为至少小于0.05的p值(p=<0.05),例如至少<0.04、<0.03、<0.02、<0.01、<0.009、<0.005、<0.001、<0.0001、<0.00001或至少<0.000001。替代性地或另外,使用支持向量机(support vector machine;SVM)确定差异表达。替代性地或另外,SVM是如下所述的SVM。
本领域技术人员应了解,差异表达可以涉及单个生物标记或视为组合的多个生物标记(即作为生物标记特征)。因此,p值可以与单个生物标记或一组生物标记相关。实际上,当单独考虑时,具有大于0.05的差异表达p值的蛋白质在其表达水平视为与一种或多种其他生物标记组合时仍可以用作本发明的生物标记。
如所附实例中举例说明的,组织、血液、血清或血浆测试样品中某些生物标记的表达可以指示个体中的SLE相关疾病状态。举例来说,单个测试样品中某些血清蛋白的相对表达可以指示个体中SLE的活动性。
在替代或额外实施例中,将步骤(b)中所测量的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量与代表步骤(d)和/或(f)中的测量值的预定义参考值进行比较。
替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表A中所定义的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量,例如表A中所定义的生物标记中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69种。
替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量CHX10(3)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量LUM的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量胱抑素C的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量ATP5B(2)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量β-半乳糖苷酶的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量DUSP9的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-1α的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包括,由或不包括测量IL-1β的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(13)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(14)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(3)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(4)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(5)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(7)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量基序(8)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量MYOM2(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量PSA的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量Soxlla的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量表面Ag X的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量TBC1D9(2)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量血管动蛋白(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量APOA1(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量BTK(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量C1酯酶抑制因子(3)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量C1q的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量C1s的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量C3的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量C4的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量C5(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量CD40的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量CD40配体的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量嗜酸细胞活化趋化因子(3)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量因子B的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量GLP-1的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量GM-CSF的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量HLA-DR/DP的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量ICAM-1的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IFN-γ(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IgM的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-10(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-11(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-12(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-13(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-16(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-18的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-1ra的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-2(2)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-3的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-4的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-5的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-6的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-7的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-8的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量IL-9的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量整合素α-10的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包括,包括或排除测量JAK3的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量LDL(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量瘦素的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量Lewis x(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量MCP-1的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量MCP-3(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量MCP-4(2)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量组织蛋白酶W酶原的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量RANTES的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量Sialle x的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量TGF-β1的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量TNF-α(1)的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量TNF-β的存在和/或量;替代性地或另外,步骤(b)包含以下、由以下组成或不包括以下:测量VEGF(1)的存在和/或量。
在一个实施例中,生物标记mRNA和/或氨基酸序列对应于GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上可获得的那些和其天然变体。在另一实施例中,生物标记mRNA和/或氨基酸序列对应于2016年6月7日在GenBank数据库上可获得的那些。
替代性地或另外,方法不包括使用未在表A和/或本发明实例部分中列出的生物标记。
替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表A(I)和/或(II)中所定义的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量,例如表A(I)和/或(II)中所定义的生物标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种。
替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表A(III)中所定义的一种或多种生物标记,例如表A(III)中所定义的生物标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、98、29、30、21、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49种在测试样品中的存在和/或量。
替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:
a)测量表B(I)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量,例如,表B(I)中定义的2或3种生物标志物;
b)测量表B(II)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量,例如表B(II)中定义的2或3种生物标志物;
c)测量表B(III)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量,例如,表B(III)中定义的2种生物标志物;
d)测量表B(IV)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量,例如,表B(IV)中定义的2种生物标志物;
e)测量表B(V)中所定义的一种或多种生物标记,例如表B(V)中所定义的生物标记中的2、3或4种在测试样品中的存在和/或量;
f)测量表B(VI)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量,例如,表BV(VI)中定义的2种生物标志物;
g)测量表B(VII)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量;
h)测量表B(VIII)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量;
i)测量表B(IX)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量;
j)测量表B(X)中所定义的一种或多种生物标记,例如表B(X)中所定义的生物标记中的2、3、4、5、6或7种在测试样品中的存在和/或量;
k)测量表B(XI)中所定义的一种或多种生物标记,例如在表B(XI)中所定义的生物标记的2、3、4、5、6、7或8种在测试样品中的存在和/或量;
l)测量表B(XII)中所定义的一种或多种生物标记,例如表B(XII)中所定义的生物标记中的2或3种在测试样品中的存在和/或量;
m)测量表B(XIII)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量,例如表B(XIII)中定义的2种生物标志物;
n)测量表B(XIV)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量;
o)测量表B(XV)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量;
p)测量表B(XVI)中所定义的一种或多种生物标记,例如在表B(XVI)中所定义的生物标记中的2、3、4、5、6、7或8种在测试样品中的存在和/或量:
q)测量表B(XVII)中所定义的一种或多种生物标记,例如表B(XVII)中所定义的生物标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17在测试样品中的存在和/或量;
r)测量表B(XVIII)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量;和/或
s)测量表B(XIX)中所定义的生物标记在测试样品中的存在和/或量。
替代性地或另外,方法包含以下、由以下组成或用于以下:确定SLE相关疾病状态是活动性SLE还是非SLE。或者或另外,步骤(b)包括或由测量表B(I),(II),(III),(IV)中定义的一种或多种生物标志物的测试样品中的存在和/或量组成,(V),(VI),(VIII),(IX),(X),(XI),(XIV)和/或(XVI)。
替代性地或另外,方法包含以下、由以下组成或用于以下:确定SLE相关疾病状态是非活动性SLE还是非SLE。替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、(II)、(III)、(V)、(VII)、(IX)、(X)、(XII)、和/或(XV)中所定义的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量。
替代性地或另外,方法包含以下、由以下组成或用于以下:确定SLE相关疾病状态是高度活动性SLE还是非SLE。替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、(II)、(IV)、(VI)、(XII)、(XIII)、(XIV)和/或(XVIII)中所定义的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量。
替代性地或另外,方法包含以下、由以下组成或用于以下:确定SLE相关疾病状态是活动性SLE还是非活动性SLE。替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VII)、(VIII)、(XI)、(XV)和/或(XVII)中所定义的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量。
替代性地或另外,方法包含以下、由以下组成或用于以下:确定SLE相关疾病状态是高度活动性SLE还是非活动性SLE。替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、(II)、(IV)、(VI)、(XII)、(XIII)、(XIV)和/或(XVIII)中所定义的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量。
替代性地或另外,方法包含以下或由以下组成:测量表A和表B中列出的所有生物标记。
替代性地或另外,步骤(c)或步骤(e)的对照样品由以下提供:
a)健康个体(非SLE);
b)患有非活动性SLE(非暴发SLE)的个体;
c)患有活动性SLE(暴发SLE)的个体;或
d)患有高度活动性的SLE(强烈暴发SLE)的个体。
健康个体可以没有SLE、自身免疫疾病和/或肾病。健康个体可以没有任何形式的疾病。
“非活动性”意指或包括SLEDAI 2000小于五的SLE。“活动性”意指或包括SLEDAI2000为五到十五(即五与十五之间)的SLE。“高活动性”或“高度活动性”SLE意指或包括SLEDAI 2000为十六或更高的SLE。
SLE疾病严重程度和进展通常通过临床评估并且使用以下(SLEDAI-2000)标准评分来确定(参见Gladman等人,2002;《风湿病学杂志(J.Rheumatol)》,29(2):288-91):
如果在访视时或在之后10到30天中存在描述词,则应用相应的分值/权重。然后总计分值。技术人员将了解,被动(缓解)SLE和活动性(暴发)SLE的SLEDAI边界可以根据被评估的患者组而变化。
替代性地或另外,被动(缓解)SLE的下限范围可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任何一个;被动(缓解)SLE的上限范围可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45;活动性或高活动性(暴发)SLE的下限范围可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任何一个;中等严重程度SLE的上限范围可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85;活动性或高活动性(暴发)SLE的上限范围可以是15、16、17、18、1920、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、105或105;条件是特定严重级别的下限范围必须低于其上限范围的分值,并且每个严重性级别的范围可能不重叠。
替代性地或另外,SLEDAI评分从先前评估中增加>3表明轻度或中度暴发。SLEDAI评分从先前评估中增加>12表明严重暴发。SLEDAI评分从先前评估中降低>3表明轻度或中度缓解。SLEDAI评分从先前评估中降低>12表明高级缓解。SLEDAI评分增加或减少≤3表明稳定(既不暴发也不是非暴发)SLE。
替代性地或另外,步骤(a)的测试样品和/或步骤(c)或步骤(e)的对照样品分别地由以下提供:
a)具有SLE亚型1(SLE1)的个体;
b)具有SLE亚型2(SLE2)的个体;或
c)具有SLE亚型3(SLE3)的个体。
SLE1包括皮肤和肌肉骨骼受累但缺乏浆膜炎,系统性血管炎和肾脏受累。SLE2包括皮肤和肌肉骨骼受累,浆膜炎和系统性血管炎,但缺乏肾脏受累。SLE3包含皮肤和肌肉骨骼受累、浆膜炎、系统性血管炎和SLE肾小球肾炎。SLE1、SLE2和SLE3分别代表轻度/不存在、中度和重度SLE疾病状态(例如参见Sturfelt G,AG.《系统性红斑狼疮的补体成分、补体激活和急性期反应(Complement components,complement activation,and acutephase response in systemic lupus erythematosus)》,Int Arch Allergy ApplImmunol 1984;75:75-83,其通过引用并入本文)。
替代性地或另外,存在SLE相关疾病状态的身体症状,例如存在用于区分活动性和高度活动性SLE的用于将个体分类为根据SLEDAI 2000“活动性”或“高度活动性”的描述词。换句话说,本发明的方法可以诊断SLE相关疾病状态。
“诊断”意指确定受试者是否罹患SLE。诊断SLE的常规方法在所属领域中是众所周知的。
美国风湿病学会(American College of Rheumatology)于1982年制定了十一项标准(参见Tan等人,1982,《系统性红斑狼疮分类1982年修订标准(The 1982 revisedcriteria for the classification of systemic lupus erythematosus)》,《关节炎和风湿病学(Arthritis.Rheum.)》,25:1271-7),其在1997年进行了修订作为实施在临床试验中SLE定义的分类指导(参见Hochberg,1997,《更新美国风湿病学会系统性红斑狼疮分类的修订标准(Updating the American College of Rheumatology revised criteria for theclassification of systemic lupus erythematosus)》,《关节炎和风湿病学》,40:1725)。处于识别临床研究的患者的目的,如果11个症状中的任何4个同时或两个独立时机连续出现,则患者被认为患有SLE。
有些人,特别是那些患有抗磷脂综合征的人,可能没有上述四项标准的SLE,而且SLE可能具有除标准中列出的特征以外的特征(参见Asherson等,2003,Catastrophicantiphospholipid syndrome:international consensus statement on分类标准和治疗指南,Lupus,12(7):530-4;Sangle等,2005,Livedo reticularis和妊娠发病率在抗磷脂抗体阴性的患者,Ann。风湿性派息。,64(1):147-8;和Hughes和Khamashta,2003,Seronegative antiphospholipid syndrome,Ann。风湿性疾病年鉴》,62(12):1127)。
递归分区已被用于识别更简约的标准(参见Edworthy等,1988,分析1982年ARA狼疮标准数据集通过递归分区方法:对个体标准的相对价值的新见解,J。Rheumatol。,15(10):1493-8)。此分析提出两个诊断分类树:
最简单分类树:如果一个人患有免疫病症(抗DNA抗体、抗史密斯抗体(anti-Smithantibody)、假阳性梅毒测试或LE细胞)或蝶形皮疹,则诊断出SLE。
完全分类树:使用6个标准。
替代性地或另外,SLE的诊断是根据Fries和Holman在以下中概述的原理进行的:Smith LH Jr编在:Smith LH Jr编《内科学中的主要问题(major Problems in InternalMedicine)》第VI卷,1976,其以引用的方式并入本文中。
建议采用其他一套替代标准,即1998年的圣托马斯医院(St.Thomas′Hospital)“替代”标准(参见Hughes,1998,《它是狼疮吗?临床上的圣托马斯医院“替代”标准(Is itlupus?The St.Thomas′Hospital"alternative″criteria)》,《临床和实验风湿病学(Clin.进出口。类风湿性关节炎杂志,16(3):250-2)。
但是,并不打算将这些标准用于诊断个体。它们耗时、主观,需要高度经验才能有效使用,并且排除实际SLE患者的频率很高(即,将SLE患者诊断为非SLE患者)。本发明解决这些问题,提供客观的SLE诊断。
替代性地或另外,在SLE相关疾病状态的身体症状出现之前确定SLE相关疾病状态,例如用于区分活动性和高活动性SLE,用于将个体分类为根据SLEDAI 2000的“活动性”或“高度活动性”的描述词尚未出现。因此,可以通过本发明的方法将个体归类为属于第一疾病状态,但根据SLEDAI 2000将其归类为第二疾病状态。换句话说,本发明的方法可以预测SLE相关疾病状态。
可选地或另外地,可以在出现SLE相关疾病状态的身体症状之前至少1天确定SLE相关疾病状态,例如,至少2天,3天,4天,5天,6天,1周,2周,3周,4周,5周,6周,7周,8周,9周,10周,11周,12周,4个月,5个月或6个月,7个月,7个月月,8个月,9个月,10个月,11个月,12个月,13个月,14个月,15个月,16个月,17个月,18个月,19个月,20个月,21个月,22个月,23个月在出现SLE相关疾病状态的身体症状之前数月或24个月。
“表达”包括如mRNA或蛋白质的基因产物的水平或量。
通过′Motif#′(其中′#′代表数字),我们包括含有表B中所示选择基序的蛋白质。或者或另外,我们包括由具有表B中定义的CDR的抗体特异性结合的蛋白质。有问题的主题。替代性地或另外,抗体具有如Olsson等人,2012,“重组抗体的表位特异性展现混杂的肽结合特性(Epitope-specificity of recombinant antibodies reveals promiscuouspeptide-binding properties)”中所定义的框架区。《蛋白质科学(Protein Sci.)》,21(12):1897-910。
一般来说,受试者中的系统性红斑狼疮相关疾病状态以ROC AUC为至少0.55确定,例如ROC AUC为至少0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98或ROCAUC为至少0.99。优选地,个体中的系统性红斑狼疮相关疾病状态以ROC AUC为至少0.85确定。
通常,使用支持向量机(SVM),如可从http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html获得的那些(例如e10711.5-24)确定受试者中的系统性红斑狼疮相关疾病状态。然而,也可使用任何其他合适的手段。
支持向量机(SVM)是一组用于分类和回归的相关监督学习方法。给定一组训练实例,每个实例标记为属于两个类别之一,SVM训练算法构建模型,所述模型预测新实例是否落入一个类别或另一个类别之中。直观地,SVM模型将实例表示为空间中的点,其映射成使得单独类别的实例除以尽可能宽的明显间隔。然后将新实例映射到同一空间,并且基于落入间隔的哪一侧预测所述新实例属于一个类别。
更正式地,支持向量机在高维或无限维空间中构造超平面或超平面集,其可以用于分类、回归或其他任务。直观地,通过与最接近的任何类型训练数据点具有最大距离(所谓的功能容限)的超平面来实现良好分离,因为通常容限越大,分类器的泛化误差越低。有关SVM的更多信息,参阅例如Burges,1998,《数据挖掘和知识发现(Data Mining andKnowledge Discovery)》,2:121-167。
在本发明的一个实施例中,在使用来自分配给已知患者组(即,存在系统性红斑狼疮相关疾病状态的那些患者与不存在系统性红斑狼疮相关疾病状态的那些患者)的受试者的蛋白质组样品进行本发明方法之前“训练”SVM。通过运行此类训练样本,SVM能够了解何种生物标记谱与系统性红斑狼疮相关疾病状态相关。一旦训练过程完成,SVM随后就能够判断所测试的蛋白质组样品是否来自系统性红斑狼疮相关疾病状态的受试者。
但是,可以通过利用必要的训练参数对SVM进行预编程来绕过这种训练程序。举例来说,基于表A中列出的一些或所有生物标记的测量值,可以使用表B中详述的SVM参数确定受试者中的系统性红斑狼疮相关疾病状态。
技术人员将了解,可以通过利用适合的数据(即来自患有已知患者组的生物标记测量值)选择训练SVM机,来确定针对表A中所列出的生物标记的任何组合的适合的SVM参数。
替代性地,本发明图和表中提供的数据可以用于根据本领域已知的任何其他合适的统计方法,例如主成分分析(PCA)正交PCA(OPLS)和其他多变量统计分析(例如后向逐步逻辑回归模型)确定特定SLE相关疾病状态。关于多变量统计分析的综述,参见例如Schervish,Mark J.(1987年11月)。“多变量分析综述(A Review of MultivariateAnalysis)”.《统计科学(Statistical Science)》2(4):396-413,其以引用的方式并入本文中。
优选地,本发明的方法的准确度为至少51%,例如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%准确度。
优选地,本发明的方法的灵敏度为至少51%,例如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%灵敏度。
优选地,本发明的方法的特异性为至少51%,例如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%特异性。
“准确度”意指方法的正确结果的比例,“敏感性”是指正确分类为阳性的所有阳性化学物质的比例,“特异性”是指正确分类为阴性的所有阴性化学物质的比例。
替代性地或另外,使用能够与一种或多种生物标记结合的结合剂进行步骤(b)和/或步骤(d)。可以基于结合剂结合给定基序的能力,从文库中选择结合剂(也称作结合分子和结合部分),如下所论述。
“生物标记”意指天然存在的生物分子或其组分或片段,其测量可以提供对胰腺癌的预后有用的信息。举例来说,生物标记可以是天然存在的蛋白质、mRNA或碳水化合物部分,或其抗原组分或片段。
在替代性或另外实施例中,步骤(b)包含测量一种或多种生物标记的蛋白质或多肽的表达。
检测和/或测量蛋白质和/或核酸浓度的方法是所属领域的技术人员众所周知的,参见例如Sambrook和Russell,2001,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)。
用于检测和/或测量蛋白质的优选方法包括西方印迹法(Western blot)、北方-西方印迹法(North-Western blot)、免疫吸附分析(ELISA)、抗体微阵列、组织微阵列(TMA)、免疫沉淀、原位杂交和其它免疫组织化学技术、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶分析(IEMA),包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心分析。例示性夹心分析由David等人在美国专利第4,376,110号和第4,486,530号中所描述,所述专利以引用的方式并入本文中。载玻片上细胞的抗体染色可以用于细胞学实验室诊断测试中众所周知的方法中,这是所属领域的技术人员众所周知的。
通常,ELISA涉及通常在固相分析中使用产生有色反应产物的酶。已经广泛使用如辣根过氧化物酶和磷酸酶的酶。扩增磷酸酶反应的方法是使用NADP作为底物产生NAD,其现在充当第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供良好共轭物,因为酶不存在于组织中、稳定并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于酶(如荧光素酶)的化学发光系统。
经常使用与维生素生物素的轭合,因为这可以通过其与酶连接的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的反应容易地检测到,其以极大特异性和亲和力与它们结合。
替代性地或另外,结合剂是抗体或其片段。
因此,片段可含有可变重(VH)或可变轻(VL)区中的一个或多个。例如,术语抗体片段包括Fab样分子(Better等人(1988)《科学(Science)》240,1041);Fv分子(Skerra等人(1988)《科学》240,1038);其中VH和VL配对区通过柔性寡肽连接的单链Fv(ScFv)分子(Bird等人(1988)《科学》242,423;Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85,5879)和包含分离的V域的单结构域抗体(dAb)(Ward等人(1989)《自然(Nature)》341,544)。
术语“抗体变体”包括任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交物,如但不限于:通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变区域和/或恒定区域的噬菌体呈现产生的单链抗体分子,或所属领域技术人员已知的能够以免疫测定形式与抗原结合的其他免疫交互式分子。
涉及保留特异性结合位点的抗体片段的合成技术的一般性综述可以见于Winter和Milstein(1991)《自然》349,293-299中。
另外或替代性地,结合分子的至少一种类型,更通常所有类型是适体。
可以以分子文库,如抗体文库(Clackson等人,1991,《自然》,352,624-628;Marks等人,1991,《分子生物学杂志(J Mol Biol)》,222(3):581-97)、肽文库(Smith,1985,《科学》,228(4705):1315-7)、表达的cDNA文库(Santi等人,(2000)《分子生物学杂志》296(2):497-508)、除抗体框架以外的其它支架,如亲和抗体的文库(Gunneriusson等人,1999,《应用环境微生物学(Appl Environ Microbiol)》65(9):4134-40),或基于适体的文库(Kenan等人,1999,《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》118,217-31),作为来源从其中选择对既定基序具有特异性的结合分子以用于本发明的方法。
分子文库可以在原核细胞(Clackson等人,1991,前面所引用的;Marks等人,1991,前面所引用的)或真核细胞(Kieke等人,1999,《美国国家科学院院刊》,96(10):5651-6)中体内表达,或可以在不涉及细胞的情况下体外表达(Hanes和Pluckthun,1997,《美国国家科学院院刊》94(10):4937-42;He和Taussig,1997,《核酸研究(Nucleic Acids Res)》25(24):5132-4;Nemoto等人,1997,《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett)》,414(2):405-8)。
在使用基于蛋白质的文库的情况下,编码潜在结合分子的文库的基因常常被包裹在病毒中,并且所述潜在结合分子呈现在病毒表面(Clackson等人,1991,前面所引用的;Marks等人,1991,前面所引用的;Smith,1985,前面所引用的)。
最常用的此类系统是在其表面呈现抗体片段的丝状噬菌体,所述抗体片段表达为噬菌体的次要外壳蛋白的融合体(Clackson等人,1991,前面所引用的;Marks等人,1991,前面所引用的)。然而,已使用用于呈现的其他系统,其使用其他病毒(EP 39578)、细菌(Gunneriusson等人,1999,前面所引用的;Daugherty等人,1998,《蛋白质工程(ProteinEng)》11(9):825-32;Daugherty等人,1999,《蛋白质工程》12(7):613-21)和酵母(Shusta等人,1999,《分子生物学杂志》292(5):949-56)。
此外,已展示利用在所谓的核糖体呈现系统中多肽产物与其编码mRNA的连接(Hanes和Pluckthun,1997,前面所引用的;He和Taussig,1997,前面所引用的;Nemoto等人,1997,前面所引用的)或替代地多肽产物与编码DNA的连接(参见美国专利第5,856,090号和WO 98/37186)的呈现系统。
当潜在的结合分子选自文库时,通常采用一种或数种具有规定基序的选择肽。提供结构、降低肽或实现与结合分子相互作用的带电、极性或疏水性侧链的柔性的氨基酸残基可以用于选择肽的基序的设计。举例来说:
(i)脯氨酸可以使肽结构稳定,因为其侧链与α碳和氮结合;
(ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香族侧链并且具有高度疏水性,而亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪族侧链并且也是疏水性的;
(iii)赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链并且在中性pH值下带正电荷,而天冬氨酸和谷氨酸具有酸性侧链并且在中性pH值下带负电荷;
(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性pH下是中性的,但含有可能参与氢键的酰胺基团;
(v)丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链含有可能参与氢键的羟基。
通常,结合分子的选择可以涉及使用阵列技术和系统以分析与对应于结合分子类型的点的结合。
在一个实施例中,抗体或其片段是重组抗体或其片段(如scFv)。
“scFv分子”意指其中VH和VL配对域通过柔性寡肽连接的分子。
使用抗体片段而非全抗体的优点是多方面的。较小尺寸的片段可以引起改善的药理学特性,如更好的实体组织渗透。去除全抗体的效应子功能,如补体结合。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段都可以在大肠杆菌(E.coli)中表达和分泌,由此允许容易地产生大量的所述片段。
全抗体和F(ab′)2片段是“二价”的。“二价”意指所述抗体和F(ab′)2片段具有两个抗原组合位点。相反,Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的,仅具有一个抗原组合位点。
抗体可以是单克隆或多克隆的。合适的单克隆抗体可以通过已知技术制备,例如“单克隆抗体:技术手册(Monoclonal Antibodies:A manual of techniques)”,H Zola(CRC Press,1988)和“单克隆融合瘤抗体:技术和应用(Monoclonal HybridomaAntibodies:Techniques and applications)”,JGR Hurrell(CRC Press,1982)中所公开的技术,其皆以引用的方式并入本文。
替代性地或另外,抗体或其片段选自以下组成的组:scFv;Fab;免疫球蛋白分子的结合结构域。
可选地或另外地,抗体或抗原结合片段能够与以下竞争以与表A中所指定的生物标志物结合:表8中所定义的所述生物标志物的抗体。
与如本文中所定义的抗体分子(或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合体或衍生物,或其所述变体或衍生物的融合体,其保留对所需生物标记的结合特异性)“能够竞争”与表A中所指定的生物标记结合,意指或包括所测试的抗体或抗原结合片段能够至少部分地抑制或以其他方式干扰如本文中所定义的抗体分子的结合。
举例来说,抗体或抗原结合片段可能能够抑制本文中所定义的抗体分子的至少10%结合,例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、35%或甚至100%。
可以通过所述领域技术人员熟知的方法确定竞争性结合,如ELISA(如本文中所述)和/或SPR(如所附实例中所述)。
替代性地或另外,抗体或抗原结合片段是表C中所定义的抗体或其抗原结合片段或其变体。
替代性地或另外,抗体抗体或抗原结合片段包含表C中所指定的VH和VL域,或其变体。
本发明的抗体或抗原结合片段的“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和取代。特别地,包括抗体或抗原结合片段的序列的变体,其中此类变化形式基本上不改变抗体或抗原结合片段的活性。特别地,包括抗体或抗原结合片段的变体,其中此类变化基本上不改变表C中所指定的各生物标记的结合特异性。
多肽变体可具有氨基酸序列,其与本文中所定义的本发明的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的一个或多个具有至少70%同一性-例如,与本文中所定义的本发明的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的一个或多个具有至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
可以使用合适的计算机程序例如威斯康星大学遗传计算组(University ofWisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序确定两个多肽之间的序列同一性百分比,并且应了解,相对于序列已最佳比对的多肽计算同一性百分比。
替代性地,可以使用Clustal W程序进行比对(如Thompson等人,1994,《核酸研究》22:4673-4680中所述,其以引用的方式并入本文中)。
所用参数可以如下:
-快速成对比对参数:K元组(字)大小;1,窗口大小;5,空隙罚分(gap penalty);3,顶部对角线数量;5。评分方法:x百分比。
-多重比对参数:空隙开口罚分;10,空隙扩展罚分;0.05。
-评分矩阵:BLOSUM。
替代性地,BESTFIT程序可以用于测定局部序列比对。
抗体可以与表C中所定义的抗体中的一种或多种共享CDR(例如1、2、3、4、5或6)CDR。
可以使用所属领域已知的任何合适方法来定义CDR。常用的方法包括Paratome(Kunik、Ashkenazi和Ofran,2012,《Paratome:一种基于序列或结构用于系统识别抗体中抗原结合区的在线工具(Paratome:an online tool for systematic identification ofantigen-binding regions in antibodies based on sequence or structure)《核酸研究》,40:W521-W524;http://www.offanlab.org/paratome/)、Kabat(Wu和Kabat,1970,《本琼氏蛋白和骨髓瘤轻链可变区域的序列分析和其对抗体互补性的意义(An analysis ofthe sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myelomalight chains and their implications for antibody complementarity)》。《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,132:211-250;Chothia(Chothia和Lesk,1987《免疫球蛋白高变区的典型结构(Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins)》《分子生物学杂志》,196:901-917;Chothia等人,1989《免疫球蛋白高变区的构象(Conformation of immunoglobulin hypervariable regions)》《自然》,342:877-883)和IMGT(Lefranc等人,2003《用于免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域及Ig超家族V样域的IMGT独特编号(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor variable domains and Ig superfamily V-like domains)》《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27:55-77;Lefranc等人,2005《用于免疫球蛋白和T细胞受体恒定区及Ig超家族C样区的IMGT独特编号(IMGT unique numbering for immunoglobulin andT cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains)》《发育与比较免疫学》,29:185-203;http://www.imgt.org)。举例来说,所用方法可以是IMGT方法。
替代性地或另外,第一结合剂固定在表面上(例如在多孔板或阵列上)。
替代性地或另外,用可检测部分标记测试样品中的一种或多种生物标记。
替代性地或另外,用可检测部分(其可以与用于标记测试样品的可检测部分相同或不同)标记对照样品中的一种或多种生物标记。
“可检测部分”包括以下含义:部分是可以被检测的部分,并且可以确定所述部分的相对量和/或位置(例如在阵列上的位置)。
可检测部分是所属领域中众所周知的。
可检测部分可以是荧光和/或发光和/或化学发光部分,其在暴露于特定条件时可以被检测。举例来说,荧光部分可能需要暴露于特定波长和强度的辐射(即光)以引起荧光部分的激发,从而使所述荧光部分能够以可以检测的特定波长发射可检测荧光。
替代性地,可检测部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化成可以可视化和/或检测的可检测产物的酶。合适的酶的实例在下文中关于例如ELISA分析更详细地讨论。
替代性地,可检测部分可以是放射性原子,其适用于成像。合适的放射性原子包括用于闪烁扫描研究的99mTc和123I。其他易于检测的部分包括例如,用于磁共振成像(MRI)的自旋标记,如再次的123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然,待检测的试剂(如例如本文所述的测试样品和/或对照样品中的一种或多种蛋白质和/或用于检测所选蛋白质的抗体分子)必须具有足够的合适的原子同位素以使可检测部分易于检测。
可以按已知的方式将放射性标记或其他标记并入本发明的试剂(即本发明的方法的样品中存在的蛋白质和/或本发明的结合剂)中。举例来说,如果结合部分是多肽,则其可以是生物合成的,或可以是使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成而合成的,所述氨基酸前体涉及例如氟-19代替氢。举例来说,如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的标记可以通过结合部分中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978),《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》80,49-57)可以用于并入123I。参考文献(“免疫闪烁成像中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy)”,J-F Chatal,CRC Press,1989)详细描述其它方法。用于使其它可检测部分(如酶促、荧光、发光、化学发光或放射性部分)与蛋白质轭合的方法是所属领域中众所周知的。
优选地,可检测部分选自以下组成的组:荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶部分。
替代性或另外实施例中,步骤(b)、(d)和/或(f)包含测量编码一种或多种生物标记的核酸分子的表达。
核酸分子可以是cDNA分子或mRNA分子。优选地,核酸分子是mRNA分子。还优选地,核酸分子是cDNA分子。
因此,可以使用选自以下组成的组的方法进行步骤(b)中一种或多种生物标记的表达的测量:南方杂交(Southern hybridisation)、北方杂交(Northern hybridisation)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction;PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、自动射线照相术和原位杂交。优选地,使用DNA微阵列确定步骤(b)中一种或多种生物标记的表达的测量。因此,方法可以包含以下或由以下组成:使用一个或多个结合部分测量步骤(b)中的一种或多种生物标记的表达,每个结合部分能够选择性地结合编码表A中标识的生物标记中的一种的核酸分子。
在替代性或另外实施例中,一个或多个结合部分各自包含以下或由以下组成:DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO(优选DNA)。优选地,一个或多个结合部分的长度是5到100个核苷酸。更优选地,一个或多个核酸分子的长度是15到35个核苷酸。结合部分可以包含可检测部分。
可以基于其结合既定核酸、蛋白质或氨基酸基序的能力从文库中选择或筛选合适的结合剂(也称为结合分子)。
在替代性或另外实施例中,使用一个或多个结合部分进行步骤(b)、(d)和/或(f)中所述一种或多种生物标记的表达的测量,所述结合部分能够各自分别地选择性地与编码表A中所标识的生物标记中的一种的核酸分子结合。
在替代性或另外实施例中,核酸结合部分包含如上定义的可检测部分。
替代性地或另外,步骤(b)、(d)和/或步骤(f)在存在时使用阵列进行。阵列可以是基于珠粒的阵列或基于表面的阵列。阵列可以选自以下组成的组:宏阵列;微阵列;纳米阵列。
阵列本身在所属领域中是众所周知的。通常,其由线性或二维结构形成,所述线性或二维结构具有间隔开的(即离散的)区域(“点”),每个区域具有有限面积,形成在固体支持物的表面上。阵列也可以是珠粒结构,其中每个珠粒可以通过分子代码或颜色代码识别或在连续流中识别。还可以依序进行分析,其中样品通过一系列点,每个点从溶液中吸附一类分子。固体支持物通常是玻璃或聚合物,最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以呈以下形式:管状物、珠粒、盘状物、硅片、微量培养板、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、其它多孔膜、无孔膜(尤其例如塑料、聚合物、有机玻璃、硅)、多个聚合针或多个微量滴定孔,或适用于固定蛋白质、多核苷酸和其它合适分子和/或进行免疫分析的任何其它表面。结合过程是所属领域中熟知的,并且一般由交联共价结合或物理吸附蛋白质分子、多核苷酸等到固体支持物组成。通过使用熟知技术,如接触或非接触印刷、掩模或光刻,可以定义每个点的位置。关于综述参见Jenkins,R.E.,Pennington,S.R.(2001,《蛋白质组学(Proteomics)》,2,13-29)和Lal等人(2002,《当代药物研究(Drug Discov Today)》15;7(增刊18):S143-9)。
通常,阵列是微阵列。“微阵列”包括具有至少约100/cm2,并且优选至少约1000/cm2的离散区密度的区阵列的含义。微阵列中的区具有典型尺寸,例如直径在约10-250μm之间的范围内,并且以大约相同的距离与阵列中的其他区分隔。阵列也可以是宏阵列或纳米阵列。
一旦鉴定并且分离合适的结合分子(如上所述),技术人员可以使用分子生物学领域中众所周知的方法制造阵列。
替代性地或另外,步骤(b)、(d)和/或步骤(f)在存在时使用包含能够与一种或多种蛋白质结合的第二结合剂的测定进行,所述第二结合剂具有可检测部分。
替代性地或另外,则步骤(b),步骤(d)和/或步骤(f)在存在时使用ELISA(酶联免疫吸附分析)进行。
通常,分析是ELISA(酶联免疫吸附分析),其通常涉及通常在固相分析中使用产生有色反应产物的酶。已经广泛使用如辣根过氧化物酶和磷酸酶的酶。扩增磷酸酶反应的方法是使用NADP作为底物产生NAD,其现在充当第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供良好共轭物,因为酶不存在于组织中、稳定并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于酶(如荧光素酶)的化学发光系统。
也使用与维生素生物素的轭合,因为这可以通过其与酶连接的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的反应容易地检测到,其以极大特异性和亲和力与它们结合。
所属领域技术人员应了解,本发明的特征的生物标记组合物中存在一定程度的流动性。因此,生物标记的不同组合可以同样适用于SLE的诊断、预后和/或特征化。通过这种方式,每种生物标记(单独或与一种或多种其他生物标记组合)对特征做出贡献。
替代性地或另外,步骤(b)包含以下或由以下组成:测量图1(E)、图2(D)、图2(H)、图3(D)、图3(E)、图3(F)、图4(A)、图5(A)、图5(B)、图8(A)、图8(B)、图8(C)和/或图8(D)中列出的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量。
在替代或另外的实施例中,方法包含在物理或电子数据载体(即,物理或电子文件)上记录诊断、预后或特征化。
在替代或另外的实施例中,方法包含以下步骤:
(g)基于选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记在测试样品中的存在和/或量来确定受试者中的系统性红斑狼疮相关疾病状态。
在替代或另外的实施例中,在所述个体诊断患有SLE的情况下,方法包含以下步骤:
(h)为个人提供适当的SLE治疗。
在个体未诊断患有SLE的情况下,可以对其进行进一步的SLE监测(例如使用本发明的方法)。
在替代或另外的实施例中,如果个体被特征化或预后为患有SLE暴发(即,活动性或高度活动性SLE),则方法包含以下步骤:
(h)为个人提供适当的SLE耀斑疗法。
在治疗SLE暴发的个体中,可以撤回、减少或以其他方式修改治疗,其中发现个体没有或不再经历暴发。因此,为患者提供适合其SLE相关疾病状态的治疗。在替代或另外的实施例中,可以为更具侵袭性的SLE类型(例如SLE3)或在SLE暴发期间提供更积极的治疗。合适的治疗方法可以由技术人员根据当时的主流指导来确定,例如,美国风湿病学会筛查,治疗和管理狼疮性肾炎的指南(Hahn等人,2012,Arthritis Care&Research,64(6):797-808),其通过引用并入本文。
如上所提及,在个体未被诊断出患有SLE暴发的情况下,可以对其进行进一步的SLE暴发监测(例如使用本发明的方法)。
重复监测可以至少每5天重复一次,例如至少每10天、至少每15天、至少每20天、至少每25天、至少每30天、至少每2个月、至少每3个月、至少每4个月、至少每5个月、至少每6个月、至少每7个月、至少每8个月、至少每9个月、至少每10个月、至少每11个月、至少每12个月、至少每18个月或至少每24个月重复一次。
无论是否发现个体患有SLE或SLE暴发,监测也可以以重复方式继续进行。
在替代或另外的实施例中,SLE疗法选自以下组成的组:系统性炎症导向治疗(抗疟药的基团(羟氯喹)、皮质类固醇、脉冲(或微型脉冲)环磷酰胺(CTX)(具有或不具有皮质类固醇共施用)、霉酚酸吗啉乙酯(MMF)、硫唑嘌呤(AZA)、甲氨蝶呤(MTX));免疫细胞靶向疗法(抗CD20抗体(利妥昔单抗(rituximab)、阿图姆单抗(atumumab)、奥克雷珠单抗(ocrelizumab)和维图珠单抗(veltuzumumab))、抗CD22(依帕珠单抗(Epratuzumab))、阿贝莫司(abetimus)(LJP-394)、贝利单抗(belimumab)、阿塞西普(atacicept))、共刺激信号通路靶向(抗ICOS(诱导型共刺激分子)抗体、抗ICOS-L(诱导型共刺激分子配体)抗体、抗B7RP1抗体(AMG557));抗细胞因子疗法(抗TNF疗法、抗IL-10、抗IL-1、抗IL-18、抗IL-6、抗IL-15、美金刚、抗干扰素-α(IFN-α)、血浆取出法(或血浆交换)、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、DNA接种、他汀类药物、抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CYST))、抗IgE抗体和抗FcεRIα抗体、Syk(脾酪氨酸激酶)抑制和Jak(Janus激酶)抑制);肾切除;肾移植。
因此,本发明包含用于治疗SLE的抗SLE剂,其中基于本发明的第一方面的方法的结果确定剂量方案。
本发明包含抗SLE剂在治疗SLE中的用途,其中基于本发明的第一方面的方法的结果确定剂量方案。
本发明的第二方面提供用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的阵列,其包含一种或多种如本发明的第一方面中所定义的结合剂。
替代性地或另外,阵列用于根据本发明的第一方面的方法中。替代性地或另外,阵列是如本发明的第一方面中所定义的阵列。替代性地或另外,阵列能够与表A中所定义的所有蛋白质结合。
本发明的第三方面提供选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记作为确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标记的用途。替代性地或另外,表A中所定义的所有生物标记用作确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标记。
本发明的第四方面提供选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记在制造用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的药剂(例如诊断剂)中的用途。
本发明的第五方面提供选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记,用于确定个体中的系统性红斑狼疮相关疾病状态。
本发明的第六方面提供如本发明的第一方面中所定义的一种或多种结合剂用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的用途。替代性地或另外,表A中所定义的所有生物标记用于确定个体中的系统性红斑狼疮相关疾病状态。在一个实施例中,结合剂是抗体或其抗原结合片段。
本发明的第七方面提供了如本发明的第一方面中所定义的一种或多种结合剂在制造用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的药剂(例如诊断剂)中的用途。在一个实施例中,结合剂是抗体或其抗原结合片段。
本发明的第八方面提供一种或多种如本发明的第一方面中所定义的结合剂,用于确定个体中的系统性红斑狼疮相关疾病状态。在一个实施例中,结合剂是抗体或其抗原结合片段。
本发明的第九方面提供了用于确定个体的系统性红斑狼疮相关疾病状态的试剂盒,其包含:
i)一种或多种粘合剂或如本发明的第一方面所定义的或本发明第一或第二方面所定义的阵列,和
ii)(任选)用于进行如本发明的第一方面中所定义的方法的说明书。
本发明的第十方面提供一种治疗个体中系统性红斑狼疮的方法,其包含以下步骤:
(a)根据在本发明的第一方面中所定义的方法确定个体中系统性红斑狼疮相关的疾病状态;和
(b)为个体提供系统性红斑狼疮疗法。
“系统性红斑狼疮疗法”包括治疗系统性红斑狼疮(SLE)的症状,最明显的是疲劳、关节疼痛/肿胀和/或皮疹。
SLE的其他症状可以包括:
-发烧(高温)
-淋巴腺肿大(遍布全身的小腺体,包括颈部、腋窝和腹股沟)
-复发口腔溃疡
-脱发(秃发)
-高血压(高血压)
-头痛和偏头痛
-胃(腹部)疼痛
-胸痛
-抑郁
-干眼症
-记忆力丧失
-癫痫发作(拟合)
-清晰思考存在问题,并且难以分辨现实与想象(精神病)
-呼吸急促
-雷诺现象-一种在寒冷时限制手脚血液供应的条件
-踝肿胀和液体潴留(水肿)
通常,SLE的治疗可以包括以下中的一种或多种(也参见上文):
(a)限制暴露在阳光下;
(b)维生素D补充剂;
(c)非类固醇抗炎药(NSAID),如布洛芬;
(d)抗疟剂,如羟氯喹;
(e)皮质类固醇;
(f)免疫抑制剂;
(g)利妥昔单抗;和
(h)贝利单抗。
本发明的第十一方面提供用于操作本发明方法的计算机程序,例如,用于解释步骤(c)的表达数据(和随后的表达测量步骤),并且从而诊断或确定胰腺癌相关疾病状态。计算机程序可以是编程SVM。计算机程序可以记录在所属领域的技术人员已知的合适的计算机可读载体上。合适的计算机可读载体可以包括压缩盘(包括CD-ROM、DVD、蓝光等)、软盘、闪存驱动器、ROM或硬盘驱动器。计算机程序可以安装在适合于进行计算机程序的计算机上。
现在将参考以下表格和图示描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实例:
图1.鉴别活动性SLE与正常的血清生物标记组。A)训练集的后向消除分析,得到25种抗体(用箭头标记)的压缩组,提供最佳分类。B)基于冷冻SVM模型和25重抗体特征的测试集的AUC ROC曲线。C)训练集的主成分分析(PCA)图,然后将测试集映射到其上。D)仅测试集的PCA图,其中从图中移除训练集,以更清楚地观察测试集中样品的分离。E)测试集的热图,基于25-plex抗体特征(红色-上调,绿色-下调,后-不变)。
图2.血清生物标记组对非活动性SLE与正常(A-D)和活动性SLE与非活动性SLE(E-H)进行分类。A和E)测试集的AUC ROC曲线,其基于冷冻的SVM模型和每个相应比较的25重抗体特征。B和F)训练集的主成分分析(PCA)图,然后相对于相应的比较将测试集映射到其上。C和G)测试集的PCA图,其中仅从图中移除训练集,以便更清楚地观察测试集中样品的分离。D和H)测试集的热图,基于25-plex抗体特征(红色上调,绿色下调,后向不变)。
图3.数据集对活动性SLE与正常(A和D)、非活动性SLE与正常(B和E)以及活动性SLE与非活动性SLE(C和F)分类的稳健性。A-C)基于冷冻SVM模型和25重抗体特征的测试集,迭代十次,即对于每个相应的比较使用十对不同的训练和测试集的AUC ROC值的盒形图。D-F)每个相应比较中十个25重抗体标记中每个生物标记发生的频率(>50%)如表格表示。
图4.A)基于31种非冗余抗原蛋白(包括前25种统计学差异表达的分析物和6种显着差异表达的分析物)的比较,活性SLE与正常,非活性SLE与正常,以及活性SLE与非活性SLE的热图。受调节的蛋白质(基于倍数变化的差异)与(红色-上调,绿色-下调,后-不变)。B)三个选择的关键生物标记的蛋白质表达谱显示为盒形图。指示中值(粗线),并且铰链分别代表第25百分点和第75百分点。展示两种补体蛋白(C1q和C4)和胱抑素C的蛋白质表达水平。C)当参照阵列数据相关和通过ELISA测量获得的临床数据比较非活动性SLE与活动性SLE时,补体因子C1q的蛋白质表达水平显示为盒形图。
图5.血清生物标记组区分高活动性SLE与正常和高活动性SLE与非活动性SLE。A)高活性SLE与正常,由ROC AUC曲线和热图(20个顶部差异表达的生物标志物;红色-上调,绿色-下调,后-未改变)说明。正常的颜色为(蓝色),高活动性SLE为(绿色)。B)高活动性SLE与非活动性SLE,由ROC AUC曲线和热图(前20种顶部差异表达的生物标记)说明。SLE子集的颜色为:高活动性SLE(绿色)和非活动性SLE(棕色)。
图6.当相对于阵列数据和通过ELISA测量获得的临床数据比较高活动性SLE与非活动性SLE时,补体因子C4和C1q的蛋白质表达水平显示为方框图。
图7.使用SVM留一法交叉验证程序对根据疾病严重程度(即SLE1-SLE3)分组的SLE患者进行分类。A)当比较活动性SLE与正常时,对SLE1样品进行分类。B)当比较活动性SLE与正常/非活动性SLE和非活动性SLE与正常时,对SLE2样品进行分类。C)当比较活动性SLE与正常/非活动性SLE和非活动性SLE与正常时,对SLE3样品进行分类。
图8.在随访期间的四个不同时间点收集SLE样品的纵向分析(每位患者四个样品(n=4;表示为A-D))。A-D)使用多组比较鉴定前(≤20)去调节的表达血清蛋白,并且使用与热图组合的监督层次聚类显示样品。在0时开始样品的疾病活动状态并且记录样品采集时间(≤3.3年)。
实例
引言
目的.为了定义反映系统性红斑狼疮(SLE)疾病活动性的多重血清生物标记组,采取针对基于血清检测暴发的下一步骤。
方法.使用由主要靶向免疫调节蛋白的195重重组抗体微阵列表示的亲和蛋白质组学,进行未分级的生物素标记血清样品的蛋白质表达谱。使用目前先进技术的生物信息学以定义反映SLE疾病活动性的生物标记和压缩多重特征。
结果.结果展示,单滴血液中含有大量呈免疫调节蛋白(例如C1q、C3、C4、B因子、MCP-1、CD40L,IL-1ra、IL-5、IL-12、IL-16和IFN-γ)形式的生物信息,反映可以使用亲和蛋白质组学收集SLE暴发。对以高判别力检测活动性SLE(分类)的第一压缩(n≤25)多重血清生物标记组进行破译。此外,指出随时间推移对暴发进行血清学监测的方法的可能性。
结论.我们的研究表明,免疫系统可以作为SLE暴发的独特传感器。识别与SLE疾病活动性相关的高性能血清生物标记组,允许并且监测和预测疾病暴发。
材料和方法
临床样品
在斯科讷大学医院(University Hospital)(瑞典隆德(Lund,Sweden))的风湿病科收集总共197份血清样品,包括SLE患者(n=86)和正常对照(N)(n=50)(表I)。SLE患者具有临床SLE诊断(22)并且显示四个或更多的美国风湿病学会分类标准(23,24)。在随访期间随时间收集SLE样品,并且患者呈现暴发或缓解,即对于一些患者,在不同时间点收集至多四个样品。SLE患者(样品)根据疾病表型标记(25);1)皮肤和肌肉骨骼受累(SLE1,n=30);2)浆膜炎、系统性血管炎但无肾脏受累(SLE2,n=30);3)存在SLE肾小球肾炎(SLE3,n=87)。临床疾病活动性定义为SLE疾病活动性指数2000(SLEDAI-2K)评分(5)。根据SLEDAI-2K评分,将SLE样品分为三组;<5=非活动性(n=63),>5=活动性(n=83),>16=高活动性(n=28)。将所有样品等分并储存在-80℃下直到分析。这项回顾性研究得到了瑞典隆德地区伦理审查委员会的批准。使用火箭免疫电泳(C1q)和比浊法(C4)测定C1q和C4的血清水平。相同的样品已用于平行但独立的研究,旨在定义用于SLE诊断的血清生物标记(Delfani等人,2016,同上)。
血清样品的标记
使用血清蛋白质组的先前优化标记方案将血清样品用EZ链磺基-NHS-LC-生物素标记(Pierce,美国伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL,USA)(26-28)。简单来说,将样品在PBS中稀释1∶45(约2mg蛋白质/ml),并且以15∶1的生物素:蛋白质的摩尔比生物素标记。通过在4℃下对PBS(pH 7.4)进行大量透析72小时来去除未反应的生物素。将样品等分并且储存在-20℃下直到进一步使用。
抗体的生产和纯化
总共195种人重组单链片段可变(scFv)抗体,包括180种靶向73种预计反映SLE中发生的事件的主要免疫调节分析物的抗体,和靶向15种短氨基酸基序(4到6个氨基酸长)的15种scFv抗体(29)选自大型噬菌体展示库中(补充表I)(30)(等人,提交)。scFv抗体的特异性、亲和力和片上功能此前已经过验证(详见补充附录1)。
所有scFv抗体在大肠杆菌中产生,并且使用经验证的Ni2+-NTA琼脂糖(德国希尔登凯杰(Qiagen,Hilden,Germany))上的亲和性层析法从表达上清液中纯化(详见补充附录1)。
抗体微阵列的生产和分析
使用先前优化和验证的设置(19)(Delfani等人,2016,同上)生产并且处理scFv微阵列(详见补充附录1)。简单来说,使用非接触式打印机(SciFlexarrayer S11,德国柏林(Berlin,Germany)Scienion)在每个黑色聚合物MaxiSorp微阵列载玻片(丹麦罗斯基勒(Roskilde,Denmark)NUNC A/S)上印刷14个相同的25×28子阵列。添加生物素标记样品,并且使用Alexa 647标记的抗生蛋白链菌素(SA647)(英杰(Invitrogen))使任何结合蛋白抗原可视化。最后,用共聚焦微阵列扫描仪(ScanArray Express,PerkinElmer Life&Analytical Sciences)扫描载玻片。
数据预处理
ScanArray Express软件v4.0(PerkinElmer Life&Analytical Sciences)用于量化点信号强度。具有局部背景减除的信号强度用于数据分析。每个数据点代表所有三个技术重复点的平均值,除非任何重复CV超过15%,在这种情况下消除表现最差的重复,并且使用两个剩余重复的平均值代替。信号强度的Log10值用于后续分析。微阵列数据使用半全面标准化方法(19,31,32)和“减去通过组平均值”方法在两个步骤中标准化(详见补充附录1)。
数据分析
在适用的情况下,将样品组随机分为训练集(2/3的样品)和测试集(1/3样品),确保SLE与对照和/或活动性与非活动性疾病样品的分布在两集合之间相似。应注意,对于那些手边有一个以上样品的SLE患者,每个比较随机选择样品,并且每个患者只有一个样品被包括在每个子集比较中以避免偏差(即某些患者的过表达)。
支持向量机(SVM)是我们用来将样品分类的R监督学习方法(33-35)(详见补充附录1)。对于高活动性SLE与正常、高活动性SLE与非活动性SLE的分类,使用留一法交叉验证程序(31)训练SVM,并且通过构建接收器操作特性(ROC)曲线并且计算曲线下面积(AUC)评估分类器的预测性能。
在活动性SLE与正常、非活动性SLE与正常和活动性SLE与非活动性SLE的情况下,将样品随机分成训练集和测试集,并且将与留一法交叉验证程序组合的后向排除算法(36)应用于训练集以确定显示最高组合判别能力的抗体的压缩组。然后在分类器冻结并且在测试集上评估之后,使用压缩抗体组在训练集上校准单个SVM模型。此过程在九个不同的随机生成的训练集和测试集对中再迭代九次,随后生成ROC AUC曲线。最后,基于所有十次运行计算中值AUC值,并且用作测试中生物标记特征的准确度的量度。
为了研究表型是否是活动性SLE与正常和非活动性SLE与正常的分类的干扰因素,也将SLE样品根据表型(SLE1、SLE2和SLE3)分组,并且重新进行以上分析。
当进行两组比较时,基于t检验鉴定显著差异表达的分析物(p<0.05)。使用多组比较进行SLE样品的纵向分析。使用Qlucore Omics Explorer 2.2.(瑞典隆德Qlucore AB)由主成分分析(PCA)得到样品的热图和可视化。
补充材料和方法
抗体的生产和纯化
总共195种人重组scFv抗体,包括180种靶向73种预计反映SLE中发生的事件的主要免疫调节分析物的抗体,和靶向15种短氨基酸基序(4到6个氨基酸长)的15种scFv抗体(1)选自大型噬菌体展示库中(补充表I)(2)(等人,未公布的数据)。通过使用以下确保这些来源于噬菌体展示的scFv抗体的特异性、亲和力(通常在nM范围)和片上功能:i)严格噬菌体展示选择和筛选方案(2),ii)每个目标多个克隆(1-9),和iii)适于微阵列应用的分子设计(3)。此外,先前还使用以下验证几种抗体的特异性:经过充分表征的标准化血清样品(具有已知目标分析物的分析物)和正交方法,如质谱(亲和力下拉实验)、ELISA、MesoScaleDiscovery(MSD)测定、细胞计数珠测定和MS,以及使用刺穿和阻断(补充表I)(4-12)。值得注意的是,一些抗体的反应性可能会损失,因为用于标记样品以进行检测的标记(生物素)可能阻断与抗体的亲和结合(表位掩蔽)。但是,我们通过频繁包括对同一蛋白但针对不同的表位的多于一个抗体克隆解决这个潜在问题(3)。
所有scFv抗体在100ml大肠杆菌中产生,并且使用Ni2+-NTA琼脂糖(德国希尔登凯杰)上的亲和性层析法从表达上清液中纯化。ScFv使用250mM咪唑洗脱,对PBS(pH 7.4)充分透析,并且在4℃下储存直到使用。通过测量280nm下的吸光度(平均340μg/ml,范围30-1500μg/ml)测定蛋白质浓度。通过10%SDS-PAGE(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA,USA)英杰)评估scFv抗体的纯度和完整性程度。
抗体微阵列的生产和分析
使用先前优化和验证的设置(9)(Delfani等人,未公开数据)生产scFv微阵列。简单来说,通过使用非接触式打印机(SciFlexarrayer S11,德国柏林Scienion)在每个位置点一滴(约330μL),将抗体印刷在黑色聚合物MaxiSorp微阵列载玻片(丹麦罗斯基勒NUNCA/S)上。将由195种scFv抗体、一个阴性对照(PBS)和一个阳性对照(生物素标记的BSA,b-BSA)组成的每个微阵列分成14个25×28个点的子阵列。此外,每个子阵列被分成三个段,其中在每个区段的开始和结束处印刷由25个重复点组成的一行b-BSA。每个scFv抗体分三次重复分配,每个段一个,以确保足够的可再现性。
为了处理阵列,我们使用最近优化的方案(Delfani等人,未公开数据)。简单来说,使印刷的微阵列在室温下干燥2小时,然后将其安装到多孔培育室(IC-16)(德国耶拿肖特(Schott,Jena,Germany))中。接下来,在室温下用PBS中的1%(v/v)Tween-20(默克密理博(Merck Millipore))和1%(w/v)无脂奶粉(瑞典松德比贝里(Sundbyberg,Sweden)Semper)(MT-PBS溶液)阻断载玻片2小时。随后,用PBS中的150μl0.05%(v/v)Tween-20(T-PBS溶液)洗涤载玻片四次,并且随后用100μl在MT-PBS溶液中1∶10稀释(对应于1∶450的总血清稀释度)的生物素标记的血清样品在室温下培育,在使用定轨振荡器的温和搅拌下进行2小时。在另一次洗涤后,将载玻片用100μl 1μg/ml Alexa 647标记的抗生蛋白链菌素(SA647)(英杰)在MT-PBS中在室温下在搅拌下培育1小时。最后,将载玻片在T-PBS中洗涤,并且在氮气流下干燥,并且使用60%PMT增益和90%激光功率的固定扫描仪设置立即用共聚焦微阵列扫描仪(ScanArray Express,PerkinElmer Life&Analytical Sciences)以10μm分辨率扫描。
数据预处理
使用固定圆法用ScanArray Express软件v4.0(PerkinElmer Life&AnalyticalSciences)定量点信号强度。具有局部背景减除的信号强度用于数据分析。每个数据点代表所有三个重复点的平均值,除非任何重复CV超过15%,在这种情况下消除表现最差的重复,并且使用两个剩余重复的平均值代替。信号强度的Log10值用于后续分析。
为了评估标准化策略和初始方差分析,在Qluecore Omics Explorer(瑞典隆德Qlucore AB)中使用主成分分析(PCA)和层次聚类使数据可视化。随后,在两个步骤中进行数据标准化程序。首先,使用半全面标准化方法对阵列到阵列变化的微阵列数据进行标准化,其中20%的分析物在所有样品上显示最低CV值,并且用于计算比例因子,如前所述(9,13,14)。其次,使用“减去组平均值”方法将数据标准化为日常变化。在此方法中,分析的每一天中计算每个分析物(i)的平均值并且从相应个别值(xi)中减去,由此零定心的数据最后,计算每种抗体的全局平均信号并且将其添加到每个相应的数据点,以避免数据集中的负值。
数据分析
支持向量机(SVM)是用来将样品分类的R监督学习方法(15-17)。使用线性内核进行监督分类,并且将约束的成本设置为1,这是R函数SVM中的默认值,并且没有尝试对其进行调整。选择缺少参数调节以避免过度拟合。在训练SVM之前没有对数据进行过滤,即在微阵列上使用的所有抗体都被包括在分析中。此外,计算使用SVM判定值和曲线下面积(AUC)构建的接收器操作特性(ROC)曲线。
首先将样品随机分成训练集(数据的2/3)和测试集(数据的1/3),同时保持来自每组的样品的相同比率。应注意,对于那些手边有一个以上样品的SLE患者,每个比较随机选择样品,并且每个患者只有一个样品被包括在每个子集比较中以避免偏差。将与留一法交叉验证程序组合的后向消除算法(18)随后应用于训练集以建立显示最高组合判别能力的抗体的压缩组。然后使用压缩抗体组在训练集上训练单个SVM模型。然后将训练的SVM模型冻结并且应用于测试集,并且计算ROC AUC并且将其用于评估SVM分类器的性能。为了证明数据集的稳健性,产生9个额外的训练和测试集,并且重复以上数据分析过程。最后,评估每种抗体包括在所有10种不同定义的抗体组中的频率。
使用如前所述留一法交叉验证程序(13)训练SVM。通过迭代所有样本,使用判定值构建ROC曲线并且确定相应的AUC值,并且将其用于评估分类器的预测性能。
基于t检验鉴定显著差异表达的分析物(p<0.05)。使用Qlucore Omics Explorer通过主成分分析(PCA)得到样品的热图和可视化。
结果
在此研究中,我们使用用于反映SLE中的疾病活动性的针定点血清生物标记组的重组scFv抗体微阵列。使用195重抗体微阵列分析总共197个生物素标记的血清样品(SLE n=147,正常对照n=50)的概况,其代表136个患者(86个SLE和50个对照)(表I),主要靶向免疫调节分析物。将产生的微阵列图像转化为蛋白质表达谱或蛋白质图谱,并且破译SLE相关的血清生物标记。
活动性SLE的概况分析
为了解码反映活动性SLE的血清生物标记,我们首先研究是否可以区分患有活动性疾病(表示为活动性SLE)的SLE患者与正常对照。为此,将数据集随机分成训练集(所有样品的2/3)和测试集(所有样品的1/3)。然后将逐步后向消除程序应用于训练集,以便鉴定区分活动性SLE与正常对照所需的最小抗体组,即生物标记。结果展示,根据最小误差评估的10种抗体的组合提供最佳分类(图1A)。但为了在特征中允许一些灵活性,选择前25种抗体代表压缩生物标记组(图1A)。
为了评估此25重生物标记特征的分类能力,将组首先用于在训练集上训练表示为冻结SVM的单个SVM模型。接下来,将冻结SVM模型应用于独立测试集。结果展示,获得的ROCAUC值为0.96(图1B),表明可以以高判别力对活动性SLE与正常对照进行区分。使用基于主成分分析(PCA)的方法使数据可视化,观察到类似的明显鉴别(图1C和1D)。基于25重特征的测试集的热图在图1E中所展示。发现生物标记组由上调蛋白(例如IL-6、IL-8、MCP-1和TNF-α)和下调蛋白(例如C3)构成,尽管前者占优势。应注意,我们没有区分观察到的蛋白质的上调和下调水平因生产增加/减少还是消耗增加/减少所致。因此,结果展示可以从粗血清中破译反映活动性SLE的多重判别性生物标记组。
非活动性SLE的概况分析
接下来,我们关注缓解的SLE患者(表示为非活动性SLE)。如上,将样品随机分成训练集和测试集,然后定义区分非活动性SLE与正常对照的压缩25重生物标记特征并且将其用于训练冻结SVM模型(训练集)。随后,使用独立测试集评估模型。结果展示,获得0.89的ROC AUC值(图2A),表明可以区分非活动性SLE与正常对照。基于PCA的分析展示获得类似的明显区别(图2B和2C)。基于25重特征的测试集的热图在图2D中所展示。发现组由上调蛋白(例如IL-6、IL-18和TNF-α)和下调蛋白(例如C3和C4)构成,但前者占优势。因此,数据表明,可以从粗血清中定义反映非活动性SLE的多重判别性生物标记组。
非活动性SLE和活动性SLE的概况分析
接下来,我们比较非活动性SLE(SLEDAI-2K:平均值2,范围0-5)与活动性SLE(SLEDAI-2K:平均值13,范围6-32)的血清蛋白表达谱。使用与以上相同的严格生物信息学方法,破译区分非活动性SLE与活动性SLE的压缩25重血清生物标记特征,其中ROCAUC值为0.83(图2E)。使用基于PCA的分析观察到类似的明显区别(图2F和2G)。发现显示为图2H中的热图的组由细胞因子(例如IL-16和IFN-γ)、补体蛋白(例如C4和因子B)、可溶性表面蛋白(例如CD40和CD40L)以及其他蛋白(例如IgM)构成。总之,结果由此展示可以描绘区分非活动性SLE与活动性SLE,即反映疾病活动性的血清生物标记的多重组。
分类的稳健性
为了测试数据集相对于以上分类的稳健性,我们将整个数据集随机分成另外9对训练集和测试集,并且重新运行以上所有三个比较。结果展示,所有10次比较得出活动性SLE与对照组的中值ROC AUC值为0.94(范围0.83-0.98)(图3A),非活动性SLE与对照组的中位ROC AUC值为0.77(0.65-0.98)(图3B)并且活动性SLE与非活动性SLE为0.72(0.59-0.88)(图3C)。因此,数据表明分类的能力和稳健性有所不同,并且按照活动性SLE与正常(高)>非活动性SLE与正常(中到高)和活动性SLE与非活动性SLE(低到中)的顺序降低。除了说明数据的稳健性之外,其还概述了在随后的数据分析中如何划分样本的重要性。
此外,对于存在六次或更多次的所有标志物,在图3D到3F中展示在这十个25重特征中发生每种生物标记的频率。数据展示前标记的同一性如可以预期的那样变化,但活动性SLE与正常和非活动性SLE与正常之间的8个生物标记的核心是恒定的(存在于10个特征中的至少8个)并且高度重叠(胱抑素C、Sialle x、C3、CD40、TGF-β1和MCP-1)。相比之下,活动性SLE与非活动性SLE仅查明三种核心生物标记(因子B、胱抑素C和C1q)。值得注意的是,后一种分类也产生最低的中值ROC AUC值(cfs.图3A到图3C)。这可能表明生物异质性在特别是活动性的SLE患者中对定义反映疾病活动性的血清生物标记的方法具有更明显的影响。更详细地说,如何在训练集和测试集之间划分样本将更有可能在这个特定生物标记识别过程中发挥关键作用,因为SLE患者可以在SLEDAI-2K方面显示类似的疾病活动性,但基于非常不同的生物学(临床)特征。
反映疾病活动性生物学的生物标记
由于疾病活动性的生物学不仅会被鉴定为最适合基于后向消除的分类的生物标记反映(见上文),我们还解决基于信号强度和/或倍数变化鉴定为显著差异表达的生物标记(p<0.05)。为此,图4A中展示活动性SLE与正常、非活动性SLE与正常以及活动性SLE与非活动性SLE的组合的非冗余的前31个差异表达的生物标记列表。引起关注地,发现各种生物标记去调节,如可溶性细胞因子受体(例如IL-1ra)、细胞因子(IL-16和IFN-γ)、可溶性表面蛋白(例如CD40)、补体蛋白(例如C1q、C3和C4)以及其他几种蛋白质(例如胱抑素C和IgM)。突出显示C1q、C4和胱抑素C的去调节图案(图4B)。因此,结果显示可以破译反映SLE疾病活动性的去调节生物标记的多重组。
接下来,选择C1q以试图使用正交方法验证阵列发现。为此,将使用我们的重组抗体阵列测定的C1q水平与使用临床实施方法(火箭免疫电泳)获得的水平进行比较(图4C)。结果展示,对于活动性SLE与非活动性SLE,观察到去调节C1q水平的类似图案。因此,使用正交方法验证C1q的观察阵列数据。
反映高疾病活动性的细化生物标记
为了找到反映疾病活动性的更好的生物标记,选择显示高活动性(依照SLEDAI-2K)的SLE患者(表示为高活动性SLE)(SLEDAI-2k≥16),并且将他们的血清蛋白概况与正常对照和非活动性SLE的概况再次比较。分类采用留一法交叉验证进行,当样本组太小而无法证明待分成训练集和测试集的样本时,可以采用最严格的方法。
结果展示ROC AUC值为0.98(图5A),表明可以以高判别力区分高活动性SLE与正常对照。前20个显著差异表达(P<0.05)蛋白展示为热图(图4A)。生物标记列表含有各种去调节蛋白,如可溶性细胞因子受体(例如IL-1ra)、细胞因子(IL-2、IL-8、IL-18和MCP-1)、补体蛋白(例如C1酯酶抑制性)和其他几种蛋白质(例如胱抑素C、Sialle x和IgM)。值得注意的是,针对相同蛋白质但靶向不同表位的几种抗体给出类似结果,进一步支持了观察结果。
相比之下,高活动性SLE与非活动性SLE显示ROC AUC值为0.87,也表明了高判别力(图5B)。与高活动性SLE与正常对照相比,发现前20个显著差异表达的(p<0.05)蛋白质如可以预期显示出不太明显的热图(cfs.图5A和图5B)。在去调节的生物标记中,观察到一系列蛋白质,如可溶性细胞因子受体(例如IL-1ra)、细胞因子(IL-2、IL-5、IL-12和MCP-1)、补体蛋白(例如C4和C1q)以及其他几种蛋白质(例如胱抑素C和Sialle x)。同样,观察结果得到了以下事实的支持:针对相同蛋白质的几种抗体给出类似概况。为了进一步支持这些数据,选择两种蛋白质(C4和C1q),并且将它们的表达谱与使用正交方法(火箭免疫电泳(C1q)和比浊法(C4))测定的那些进行比较。数据展示,使用抗体微阵列获得的蛋白质表达谱可以在两种情况下都得到验证(图6)。
表型的重要性
在定义反映SLE疾病活动性的血清生物标记时,疾病表型可能是几种潜在的干扰因素中的一种。为了解决这个问题,还根据表型(SLE1、SLE2和SLE3)对样品进行分组,并且重新进行部分分类(对于仍然获得足够数量样品的那些组)。采用留一法交叉验证进行分类。
结果展示,可以以独立于表型的高ROCAUC值(SLE1-0.95;SLE2-0.95;SLE3-0.98)区分活动性SLE与正常对照(图7)。类似地,无关于表型,也可以区分非活动性SLE与正常对照(SLE2-0.090;SLE3-0.78)(图7B和图7C)。最后,无关于疾病表型,也可以对活动性SLE与非活动性SLE进行分类,尽管ROC AUC值较低(SLE2-0.79;SLE3-0.69)。因此,数据表明表型不是识别反映疾病活动性的多重血清生物标记的关键干扰因素。
随时间推移的疾病活动性的监测
最后,在第一次尝试探索是否可以随时间监测SLE疾病活动性时,对一组有限的纵向样本进行了概况分析。为此,选择了4位患者作为展示,并且随时间推移(在≤3.3年内)在暴发和缓解时收集每位患者的4份血清样本(3活动性与1非活动性、2活动性与2非活动性或1活动性与3非活动性)。对于每位患者,使用多组比较鉴定前≤20个去调节蛋白质,并且使用与热图组合的监督层次聚类使样品可视化(图8)。指示各种去调节蛋白质,包括细胞因子(例如IL-10、IL-12、IL-18、IFN-γ和MCP-1)、补体蛋白(例如C3、C4和C5)、可溶性表面蛋白(例如CD40)以及其他蛋白质(例如IgM和Sialle x)。如前所述,这些试验性观察得到了针对相同蛋白质但靶向不同表位的几种抗体的支持,给出相似概况。对于所有4位患者,样本聚集为两组,活动性组与非活动性组,意指收集到的暴发纵向样品彼此之间比与在缓解时收集的样品更相似,并且反之亦然。这进一步支持了这样的观点,即粗血清含有反映可以使用亲和蛋白质组学收集的疾病活动性的信息(生物标记),表明随时间监测疾病活动性的可能性。
讨论
可用于检测、监测和/或甚至预测SLE暴发的生物标记将是极有价值的临床工具(9,11)。尽管作出很大努力,显而易见优先基于血液测试探索这样的高性能标记仍处于早期阶段(37)。由于我们只能管理我们可以测量的内容,因此粗临床样品的蛋白质表达谱的其他和/或细化方法将是必不可少的。在这里,我们已经扩展了先前的成果(19,20)(等人,提交;Delfan等人,2016,同上),并且进一步展示,使用重组抗体微阵列,单滴血液以相关生物学生物标记的形式携带可以收集的大量的SLE相关信息。
定义了反映SLE疾病活动性(和SLE)的生物标记的25重组,包括蛋白质组,如补体蛋白(例如C1q、C1酯酶抑制因子、C3、C4、C5和B因子)、细胞因子(例如IL-1ra、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16、IL-18、IFN-γ、MCP-1、TGF-β1和TNF-α)、细胞因子受体(细胞因子(例如IL1ra))、可溶性表面蛋白(例如CD40和CD40L)和其他蛋白质(例如胱抑素C、Sialle x和IgM)。这些生物标记组可以用于对活动性SLE进行分类,尽管根据手边的精确比较,分类能力从高(ROC AUC为0.98)到低(AUC为0.69)不等。一致地,这些标记中的一些在先前的工作中也被发现与SLE暴发(和/或SLE本身)相关,参见例如(4,7-11,38,39)。但是,标记主要以单个生物标记和/或低重组形式探索,显示出不同的(低)性能。
当比较活动性SLE与正常和非活动性SLE与正常的8个最稳健(频繁出现)标记的核心时,发现8个生物标记中的6个重叠(胱抑素C、Sialle x、CD40、TGF-β1、C3和MCP-1)。血清半胱氨酸蛋白酶抑制因子C是已被发现与在SLE肾损伤相关联,并且由此在SLE中去调节的生物标记(40,41)。已提出T辅助细胞亚组(TH1、TH2和THl7)和调节性T细胞的不平衡促成SLE的发病(42)。在这样的背景下,sialle x或唾液酸路易斯x(sialyl lewis x),已展示鉴别参与暴发的高度分化的和最抑制FXP3调节性T细胞(43)。已在SLE中观察到CD40的去调节水平,并且自体反应性B细胞和其异常CD40信号在SLE的发病机理起重要作用(44)。值得注意的,也频繁观察到结合到CD40的CD40L的去调节水平,并且其与SLE疾病活动性相关(45)。实际上,当比较活动性SLE与非活动性SLE时,CD40L有差异地表达。此外,已展示TGF-β1的去调节血清水平与尤其具有高疾病活动性的患者中的SLE的肾损伤相关(46)。几个补体蛋白,包括C3的改变的水平,经常用作疾病活动性的标记(47)。MCP-1是已与肾损伤、不良预后和疾病活动性相关的白细胞趋化性因子(48)。因此,发现此核心重叠的生物标记是生物学相关的标记。
相反,聚焦于鉴别活动性SLE与非活动性SLE的血清特征,3个最稳健(频繁出现)的核心包括因子B、C1q和胱抑素C。因子B通常用作互补系统的替代路径激活的指示物。值得注意的是,先前工作已展示在SLE中因子B活化产物是严重疾病活动性的标记(49)。此外,经常发现在患有严重疾病和高疾病活动性的患者中传统补体路径成分,如C1q的水平改变(47).。在审查反映疾病活动性的其余七个最稳健(频繁出现)的生物标记时,至少有五个(MCP-1、IL-9、IL-5、IL-1β和CD40)已展示与SLE相关并且反映疾病活动性(44,48,50-52)。虽然已展示RANTES与SLE相关联,与疾病活动性的相关度尚未证实(53)。在我们的研究中,核心特征中指定的RANTES反映10次暴发中的7次。检测到几种反映暴发的血清生物标记,概括了方法的潜力。值得注意的是,当患有活动性疾病的SLE患者的组减少到只有患有高活动性的患者时,描绘先验已知与SLE疾病活动性相关联的另外的生物标记(例如IL1-RA、IL-2和IL-12)(11,39,54)。虽然IL-11在SLE中的确切作用尚不清楚,但考虑到它与IL-6的相似性,它可能导致狼疮暴发。
虽然本研究展示暴发可以被检测,但它受限于这样一个事实,即仅研究终点、缓解与“完全暴发”。作为有限的展示,我们分析了4位患者,其中随时间推移对每位患者在暴发和/或缓解时收集4个样本。虽然样本集太小而无法得出明确结论,但其表明使用随时间监测暴发的方法的可能性。然而,其需要对更大的独立样品组进行分析,所述样品组由多个充分表征的患者构成,所述患者各自具有随着时间推移在频繁的暴发和/或缓解时间点收集的大量样品,以证明并且建立基于血清学的测试用于监测并且甚至潜在地以严格的方式预测暴发。然而,此类潜在测试的临床影响是显著的。
总之,在本研究中,我们已展示可以描绘检测并且监测SLE暴发的血清生物标记的压缩(n≤25)多重组。
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表格
表A-用于确定系统性红斑狼疮相关疾病状态的核心,优选和任选的生物标志物
表B-用于确定系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标志物
表1.研究中包括SLE患者和正常对照的人口统计学数据。
*在随访期间随时间收集样品,并且患者呈现暴发或缓解,即对于一些患者,在不同时间点收集至多四个样本。
**一个SLE3样品缺乏关于疾病活动性状态的临床信息。
表2. 3个主要比较的30种最常见标记
补充表1.靶向抗体微阵列a)的抗原
a)通过使用以下确保所有这些噬菌体展示衍生的scFv抗体的特异性,亲和力(通常在nM范围内)和片上功能性:i)严格的噬菌体展示选择和筛选方案(使用在纯蛋白质和纯蛋白质混合物到粗样品范围内的不同样品格式)(16),ii)每种蛋白多个克隆(1到9),和iii)适于微阵列应用的分子设计,(1-3)(等人未公开的观察结果)。此外,使用以下进一步验证了几种选定抗体(标有*)的特异性:纯蛋白质、纯蛋白质的混合物以及经过充分表征的标准化血清样品(具有已知水平的目标分析物,外加已知水平的特定蛋白质和/或耗尽的特定蛋白质)和/或正交方法,如质谱(亲和力下拉实验)、ELISA、MesoScaleDiscovery测定和细胞计数珠测定,以及使用阻断实验(4-12)。
表8-实例中使用的scFv抗体的氨基酸序列
*scFv抗体的结构描述于等人,2000,《用于产生多种单框架抗体文库的来源于重组种系的CDR序列》《自然-生物技术》,18(8):852-6,其以全文引用的方式并入本文中。

Claims (46)

1.一种用于确定受试者体内系统性红斑狼疮相关疾病状态的方法,其包含以下步骤:
a)提供待测试样品;和
b)测量选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;
其中选自表A中所定义的组的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量指示所述受试者体内所述系统性红斑狼疮相关疾病状态。
2.根据权利要求1所述的方法,其进一步包含以下步骤:
c)向所述受试者提供来自具有不同系统性红斑狼疮相关疾病状态的个体的对照样品;和
d)测量步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述对照样品中的存在和/或量;
其中在步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的存在和/或量不同于在所述对照样品中的存在和/或量的情况下,识别所述系统性红斑狼疮相关疾病状态。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其进一步包含以下步骤或由以下步骤组成:
e)向所述受试者提供来自具有相同系统性红斑狼疮相关疾病状态的个体的对照样品;和
f)测量步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述对照样品中的存在和/或量;
其中在步骤(b)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述测试样品中的表达对应于在步骤(f)中所测量的所述一种或多种生物标记在所述对照样品中的表达的情况下,识别所述系统性红斑狼疮相关疾病状态。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表A中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表A中所定义的所述生物标记中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69种在所述测试样品中的存在和/或量。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表A(I)和/或表A(II)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表A(I)和/或表A(II)中所定义的所述生物标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种在所述测试样品中的存在和/或量。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法,其中步骤(c)包含以下或由以下组成:测量表A(III)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表A(III)中所定义的所述生物标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、21、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49种在所述测试样品中的存在和/或量。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:
a)测量表B(I)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(I)中所定义的所述生物标记中的2种或3种在所述测试样品中的存在和/或量;
b)测量表B(II)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(II)中所定义的所述生物标记中的2种或3种在所述测试样品中的存在和/或量;
c)测量表B(III)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(III)中所定义的所述生物标记中的2种在所述测试样品中的存在和/或量;
d)测量表B(IV)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(IV)中所定义的所述生物标记中的2种在所述测试样品中的存在和/或量;
e)测量表B(V)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(V)中所定义的所述生物标记中的2种、3种或4种在所述测试样品中的存在和/或量;
f)测量表B(VI)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表BV(VI)中所定义的所述生物标记中的2种在所述测试样品中的存在和/或量;
g)测量表B(VII)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;
h)测量表B(VIII)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;
i)测量表B(IX)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;
j)测量表B(X)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(X)中所定义的所述生物标记中的2、3、4、5、6或7种在所述测试样品中的存在和/或量;
k)测量表B(XI)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(XI)中所定义的所述生物标记中的2、3、4、5、6、7或8种在所述测试样品中的存在和/或量;
l)测量表B(XII)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(XII)中所定义的所述生物标记中的2种或3种在所述测试样品中的存在和/或量;
m)测量表B(XIII)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(XIII)中所定义的所述生物标记中的2种在所述测试样品中的存在和/或量;
n)测量表B(XIV)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;
o)测量表B(XV)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;
p)测量表B(XVI)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(XVI)中所定义的所述生物标记中的2、3、4、5、6、7或8种在所述测试样品中的存在和/或量;
q)测量表B(XVII)中所定义的所述生物标记中的一种或多种,例如表B(XVII)中所定义的所述生物标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种在所述测试样品中的存在和/或量;
r)测量表B(XVIII)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量;和/或
s)测量表B(XIX)中所定义的所述生物标记在所述测试样品中的存在和/或量。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述方法包括,由或用于确定所述SLE相关疾病状态是活动性SLE还是非SLE。
9.根据权利要求8所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、表B(II)、表B(III)、表B(IV)、表B(V)、表B(VI)、表B(VIII)、表B(IX)、表B(X)、表B(XI)、表B(XIV)和/或表B(XVI)中所定义的所述生物标记中的一种或多种在所述测试样品中的存在和/或量。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述方法包括,由或用于确定所述SLE相关疾病状态是非活动性SLE还是非SLE。
11.根据权利要求10所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、表B(II)、表B(III)、表B(V)、表B(VII)、表B(IX)、表B(X)、表B(XII)和/或表B(XV)中所定义的所述生物标记中的一种或多种在所述测试样品中的存在和/或量。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述方法包括,由或用于确定所述SLE相关疾病状态是高度活跃的SLE还是非SLE。
13.根据权利要求12所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、表B(II)、表B(IV)、表B(VI)、表B(XII)、表B(XIII)、表B(XIV)和/或表B(XVIII)中所定义的所述生物标记中的一种或多种在所述测试样品中的存在和/或量。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述方法包括,由或用于确定所述SLE相关疾病状态是活动性SLE还是非活动性SLE。
15.根据权利要求14所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、表B(II)、表B(III)、表B(IV)、表B(V)、表B(VII)、表B(VIII)、表B(XI)、表B(XV)和/或表B(XVII)中所定义的所述生物标记中的一种或多种在所述测试样品中的存在和/或量。
16.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述方法包括,由或用于确定所述SLE相关疾病状态是高度活跃的SLE还是非活动性SLE。
17.根据权利要求16所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量表B(I)、表B(II)、表B(IV)、表B(VI)、表B(XII)、表B(XIII)、表B(XIV)和/或表B(XVIII)中所定义的所述生物标记中的一种或多种在所述测试样品中的存在和/或量。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包含以下或由以下组成:测量表A和表B中列出的所有生物标记。
19.根据权利要求2到18中任一项所述的方法,其中步骤(c)或步骤(e)的所述对照样品由以下提供:
a)健康个体(非SLE);
b)患有非活动性SLE的个体(非暴发SLE);
c)患有活动性SLE的个体(暴发SLE);或
d)患有高度活动性的SLE的个体(强烈暴发SLE)。
20.根据权利要求2到18或权利要求19(b)、(c)或(d)中任一项所述的方法,其中步骤(c)或步骤(e)的所述对照样品由以下提供:
e)患有SLE亚型1的个体(SLE1);
f)患有SLE亚型2的个体(SLE2);或
g)患有SLE亚型3的个体(SLE3)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中存在所述SLE相关疾病状态的身体症状。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法,其中在出现所述SLE相关疾病状态的身体症状之前确定所述SLE相关疾病状态。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述SLE相关疾病状态在SLE相关疾病状态的身体症状出现之前至少1天确定,例如,至少2天,3天,4天,5天,6天,1周,2周,3周,4周,5周,6周,7周,8周,9周,10周,11周,12周,4个月,5个月,6个月,7月,8个月,9个月,10个月,11个月,12个月,13个月,14个月,15个月,16个月,17个月,18个月,19个月,20个月,21个月,22个月,23个月在出现SLE相关疾病状态的身体症状之前数月或24个月。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(b)和/或步骤(d)使用能够与所述一种或多种生物标记结合的结合剂进行。
25.根据权利要求24所述的方法,其中第一结合剂是抗体或其片段。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述抗体或其片段是重组抗体或其片段。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中所述抗体或其片段选自以下组成的组:scFv;Fab;免疫球蛋白分子的结合结构域。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中用可检测部分标记所述测试样品中的所述一种或多种生物标记和/或一种或多种结合剂。
29.根据权利要求27或28所述的方法,其中所述可检测部分选自以下组成的组:荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶部分。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(b)、步骤(d)和/或步骤(f)在存在时使用阵列进行。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述阵列是基于珠粒的阵列。
32.根据权利要求30或31所述的方法,其中所述阵列是基于表面的阵列。
33.根据权利要求30、31或32所述的方法,其中所述阵列选自以下组成的组:宏阵列;微阵列;纳米阵列。
34.根据权利要求1到29中任一项所述的方法,其中步骤(b)、步骤(d)和/或步骤(f)在存在时使用ELISA(酶联免疫吸附分析)进行。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(b)包含以下或由以下组成:测量图1(E)、图2(D)、图2(H)、图3(D)、图3(E)、图3(F)、图4(A)、图5(A)、图5(B)、图8(A)、图8(B)、图8(C)和/或图8(D)中列出的所述生物标记中的一种或多种在所述测试样品中的存在和/或量。
36.一种用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的阵列,其包含一种或多种如权利要求24-29中任一项所定义的结合剂。
37.根据权利要求36所述的阵列,其中所述阵列用于根据权利要求1到35中任一项所述的方法。
38.根据权利要求36或37所述的阵列,其中所述阵列如权利要求30到33中任一项所定义。
39.根据权利要求36到38中任一项所述的阵列,其中所述一种或多种结合剂能够与表A中所定义的所有蛋白质结合。
40.一种选自表A中所定义的组的一种或多种生物标记的用途,其用作用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标记。
41.根据权利要求40所述的用途,其中表A中所定义的所有生物标记用作用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的生物标记。
42.如权利要求24-29中任一项所定义的一种或多种结合剂在确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态中的用途。
43.根据权利要求42所述的用途,其中表A中所定义的所有生物标记的结合剂用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态。
44.一种用于确定个体中系统性红斑狼疮相关疾病状态的试剂盒,所述试剂盒包含:
i)一种或多种如权利要求24到29中任一项所定义的结合剂或根据权利要求36到39所述的阵列;
ii)用于进行如权利要求1到35中任一项所定义的所述方法的说明书。
45.一种方法或用途,其基本上如本文中所描述。
46.一种阵列或试剂盒,其基本上如本文中所描述。
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