CN109680105B - 一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法 - Google Patents

一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，采用Bio‑Gel P10fine或Bio‑Gel P6fine凝胶渗透色谱法对降解的寡糖混合物进行分离纯化，得到10个寡糖组分；运用薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）对不同组分进行分析，制备聚合度为1‑10的甘露糖醛酸寡糖单体。本发明的方法可以制备聚合度为1‑10的甘露糖醛酸寡糖单体，且纯度均达95％以上，同时该方法以硫酸作为降解条件，降解后加入无水碳酸钙，搅拌过滤后可直接除去硫酸根离子，避免纯化时二次除盐，该方法耗时短，简单易操作，且可大量分离纯化，重复性好。

Description

一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法
技术领域
本发明涉及一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，属于海藻寡糖提取技术领域。
背景技术
褐藻胶是一种由海洋褐藻中提取分离获得的胞间多糖，是由β-D-甘露糖醛酸（Mannuronicacid，M）和α-L古罗糖醛酸（Guluronicacid，G）通过1，4糖苷键连接组成的嵌段化合物。褐藻胶分子中主要存在3种结构片段：β-D-(1，4)-连接的聚甘露糖醛酸（Polmannuronate，PM）；α-L-（1，4）-连接的聚古罗糖醛酸（Poiyguluronate，PG）；G与M交替共聚的片段PMG。近年来， PM 的生物活性研究取得了重要进展，特别是在抗肿瘤、促进生长及抗老年痴呆等研究方面取得了显著进展。但其相对分子质量(Mr)较大，这使其应用受到限制。通过各种降解方法制备的甘露糖醛酸寡糖， 在糖化学、糖生物学、糖工程以及糖类药物研究等领域具有重要的研究价值。
聚甘露糖醛酸（PM）经降解可制备一系列的甘露糖醛酸寡糖，常见的甘露糖醛酸寡糖制备方法主要包括化学降解法和生物酶解法。酶解法反应条件温和，裂解酶具有较的底物特异性，但酶解法制备的寡糖，非还原端形成双键，破坏了其天然结构，且后处理过程需除酶、除盐，较为繁琐。用酸降解法制备的寡糖， 保持了甘露糖醛酸的结构特点。化学法操作简单，现常用盐酸来降解，但采用盐酸在降解后引入氯离子往往需要脱盐才能除去氯离子，而使用浓硫酸降解，降解后加入无水碳酸钙，碳酸钙和浓硫酸反应生成二氧化碳和水及硫酸钙沉淀，只需过滤即可除去硫酸根。操作简单且节省时间，同时避免引入无机盐后脱盐过程中对原料的浪费。
专利“CN201310028146.2 一种利用微波辐射制备海藻酸寡糖单体的方法”公开了一种微波降解聚甘露糖醛酸的方法，但该方法中仅制备出聚合度1-9的甘露糖醛酸寡糖单体，且微波消解仪并非常用实验设备，价格昂贵。目前关于一次性制备聚合度1-10的甘露糖醛酸寡糖单体尚处于空白状态。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，实现一次性制备聚合度1-9的甘露糖醛酸寡糖单体，并提高甘露糖醛酸寡糖单体的纯度；尤其是可制备纯度达95％以上的M10糖单体。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，具体包括以下步骤：
（1）聚甘露糖醛酸降解
称取3-20g聚甘露糖醛酸钠于三口瓶中，加入200-400mL浓度为1-5mol/L硫酸溶液配制成15-50g/L的聚甘露糖醛酸硫酸降解体系，然后50-100℃水浴中搅拌1-6h；反应结束后加入无水碳酸钙粉末除去溶液中的硫酸根，过滤，滤液调PH至中性，浓缩得到寡糖混合物；浓缩得到的寡糖混合物冷冻干燥；
（2）寡糖混合物溶液及流动相配制
a、寡糖溶液的配制: 称取该寡溏混合物，用0.05-0.5mo1/L 挥发性盐溶液配成100-400mg/mL的溶液，过滤膜；
b、流动相的配制: 0.05-0.5mo1/L挥发性盐溶液过滤膜，超声脱气；
所述挥发性盐溶液是指碳酸氢铵、氯化铵和醋酸盐溶液中的一种；
（3）单体分离：
a、取配置好的寡糖溶液进Bio-Gel P10fine或Bio-Gel P6fine凝胶柱，用挥发性盐溶液以同一流速洗脱一个柱体积；
b、将洗脱液进行TLC检测，确定甘露糖醛酸寡糖单体的分布范围，然后分别合管，水浴旋蒸去除挥发性盐，浓缩，冷冻干燥，即得不同聚合度的甘露糖醛酸单体。
上述聚甘露糖醛酸钠是大分子褐藻胶经部分酸水解，在pH=2.60—2.90分级纯化，获得的聚甘露糖醛酸，平均分子量约1—6kD。
上述硫酸溶液是由98％浓硫酸在冰水浴条件下配制而成。
本发明提供一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本发明通过控制浓硫酸浓度及降解时间，可一次性获得聚合度为1-10的甘露糖醛酸单体，而且可以制备纯度达95％以上的甘露糖醛酸十糖；
（2）本方法使用浓硫酸为降解条件，降解后加入无水碳酸钙反应生成二氧化碳和水及硫酸钙沉淀，只需过滤即可除去硫酸根，避免了引入无机盐，节省脱盐过程；
（3）本方法保持了甘露糖醛酸的结构特点，且降解产率高，易于分离纯化；
（4）该方法耗时短，简单易操作，且可量大分离纯化，重复性好；
（5）本发明方法降解条件及操作简单且不需要昂贵的降解设备作为支撑，一般条件实验室均可实现操作，实用性更高，更经济。
附图说明
图1为洗脱液TLC检测图；
图2a为甘露糖醛酸单糖(M1)的柱前衍生HPLC色谱图；
图2b为甘露糖醛酸单糖(M1)的ESI-MS质谱图；
图3a为甘露糖醛酸二糖(M2)的柱前衍生HPLC色谱图；
图3b为甘露糖醛酸二糖(M2)的ESI-MS质谱图；
图4a为甘露糖醛酸三糖(M3)的柱前衍生HPLC色谱图；
图4b为甘露糖醛酸三糖(M3)的ESI-MS质谱图；
图5a为甘露糖醛酸四糖(M4)的柱前衍生HPLC色谱图；
图5b为甘露糖醛酸四糖(M4)的ESI-MS质谱图；
图6a为甘露糖醛酸五糖(M5)的柱前衍生HPLC色谱图；
图6b为甘露糖醛酸五糖(M5)的ESI-MS质谱图；
图7a为甘露糖醛酸六糖(M6)的柱前衍生HPLC色谱图；
图7b为甘露糖醛酸六糖(M6)的ESI-MS质谱图；
图8a为甘露糖醛酸七糖(M7)的柱前衍生HPLC色谱图；
图8b为甘露糖醛酸七糖(M7)的ESI-MS质谱图；
图9a为甘露糖醛酸八糖(M8)的柱前衍生HPLC色谱图；
图9b为甘露糖醛酸八糖(M8)的ESI-MS质谱图；
图10a为甘露糖醛酸九糖(M9)的柱前衍生HPLC色谱图；
图10b为甘露糖醛酸九糖(M9)的ESI-MS质谱图；
图11a为甘露糖醛酸十糖(M10)的柱前衍生HPLC色谱图；
图11b为甘露糖醛酸十糖(M10)的ESI-MS质谱图。
具体实施方式
实施例1
一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，包括以下步骤：
（1）聚甘露糖醛酸降解
称取6g聚甘露糖醛酸钠于三口瓶中，加入300mL浓度为2mol/L硫酸溶液配制成20g/L的聚甘露糖醛酸硫酸降解体系，置于常温下搅拌使聚甘露糖醛酸充分溶解；然后80℃水浴中搅拌4h；反应结束后加入无水碳酸钙粉末除去硫酸根，过滤，滤液用NaOH溶液调PH中性，浓缩得到寡糖混合物；浓缩得到的寡糖混合物冷冻干燥；
（2）寡糖混合物溶液及流动相配制
a、寡糖溶液的配制:称取该寡溏混合物，用0.5mo1/L NH4HCO3溶液配成100mg/mL的溶液，过0.45um滤膜；
b、流动相的配制: 0.5mo1/L NH4HCO3溶液过0.45um的滤膜，超声脱气；
（3）单体分离：
a、100mg/mL的寡糖溶液10mL进Bio-Gel P10fine或Bio-Gel P6fine凝胶柱，柱体积为2000mL；用0.5mo1/L的NH4HCO3溶液以同一流速线性洗脱一个柱体积，流速控制为2mL/min；
b、将洗脱液进行TLC检测，确定甘露糖醛酸寡糖单体的分布范围，其中TLC展开体系为: 甲酸:正丁醇:水=4:6:3，然后分别合管，45℃水浴旋蒸浓缩去除NH4HCO3，浓缩后冷冻干燥，即得不同聚合度的甘露糖醛酸单体；
本方法可一次性获得聚合度为1-10的甘露糖醛酸单体，而且可以制备纯度达95％以上的甘露糖醛酸十糖；TLC检测图如图1所示。
实施例2 纯度测定
冻干后得到的不同聚合度的甘露糖醛酸单体HPLC及MS检测,测定其纯度。
（1）柱前衍生高效液相色谱(HPLC)分析
检测仪器：美国戴安Dionex UltiMate 3000液相色谱仪；色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液/乙腈(83:17，V/V)；
（2）电喷雾质谱（ESI-MS）分析
检测仪器：美国Micromass Q-TOF Ultima Global四极杆飞行时间串联质谱仪；质谱检测条件：负离子检测模式；
试验结果如图2-11所示。质谱图谱与液相图谱均呈现单峰,且峰型对称，计算得岀甘露糖醛酸M1-M10纯度均达95％以上。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）聚甘露糖醛酸降解
称取3-20g聚甘露糖醛酸钠于三口瓶中，加入200-400mL浓度为1-5mol/L硫酸溶液配制成15-50g/L的聚甘露糖醛酸硫酸降解体系，然后50-100℃水浴中搅拌1-6h；反应结束后加入无水碳酸钙粉末除去溶液中的硫酸根，过滤，滤液调PH至中性，浓缩得到寡糖混合物；浓缩得到的寡糖混合物冷冻干燥；所述聚甘露糖醛酸钠是大分子褐藻胶经部分酸水解，在pH=2.60—2.90分级纯化，获得的聚甘露糖醛酸，平均分子量1—6kD；
（2）寡糖混合物溶液及流动相配制
a、寡糖溶液的配制: 称取该寡溏混合物，用0.05-0.5mo1/L 挥发性盐溶液配成100-400mg/mL的溶液，过滤膜；
b、流动相的配制: 0.05-0.5mo1/L挥发性盐溶液过滤膜，超声脱气；
所述挥发性盐溶液是指碳酸氢铵、氯化铵和醋酸盐溶液中的一种；
（3）单体分离：
a、取配置好的寡糖溶液进Bio-Gel P10fine或Bio-Gel P6fine凝胶柱，用挥发性盐溶液以同一流速洗脱一个柱体积；
b、将洗脱液进行TLC检测，确定甘露糖醛酸寡糖单体的分布范围，然后分别合管，水浴旋蒸去除挥发性盐，浓缩，冷冻干燥，即得不同聚合度的甘露糖醛酸单体。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸降解聚甘露糖醛酸制备甘露糖醛酸单体的方法，其特征在于所述硫酸溶液是由98％浓硫酸在冰水浴条件下配制而成。
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