CN109673857B - 一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂，其组成为：丁酸盐6～13重量份、牛膝多糖1～3重量份、甜菜碱5～10重量份、钠基蒙脱石30～60重量份。与饲料中单独添加丁酸盐、牛膝多糖、甜菜碱与钠基蒙脱石相比，本发明可显著降低肝脏、肠道线粒体活性氧产量和过氧化产物丙二醛的含量，促进氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I的表达，显著提高猪肝脏、肠道线粒体DNA的含量与线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性。而且，钠基蒙脱石对丁酸盐、牛膝多糖、甜菜碱有控释作用，使之易于与饲料混合，形成均匀分散系，使用方便。本发明通过各成分的协同效应，显著提高猪线粒体自噬水平，保护线粒体功能，进而显著缓解猪氧化应激。

Description

一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂
技术领域
本发明涉及一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂。
背景技术
养猪生产中，许多因素会导致猪体内产生大量自由基，如饲料霉菌毒素污染、高温、病毒感染、断奶等；当过量自由基在体内得不到及时清除而大量蓄积时，体内氧化-抗氧化防御系统平衡被打破，引发机体氧化应激。氧化应激会导致动物免疫力降低，生产性能下降，产品品质变差，甚至出现死亡，带来严重的经济损失。
畜禽在养殖过程中发生的氧化应激，往往导致畜禽饲料转化率降低、生产性能下降、长途运输和候宰期间掉膘严重，幼畜或雏禽则表现为成活率低、发育不良、生长停滞等。氧化应激对畜禽造成的不良反应中对生产性能、肠道健康及肉品质的影响尤为严重。在氧化应激状态下，细胞内产生大量的自由基，而自由基的大量会产生破坏生物膜，影响细胞的正常生理功能，从而极易导致机体损伤，使消化道腺体分泌异常、肝脏损伤，导致肠源性感染和机体免疫系统功能异常，从而表现出动物采食量下降和养分的消化利用率降低，生产性能降低。为清除机体因氧化应激而产生的大量自由基，机体将消耗大量具有抗氧化能力的维生素和微量元素，最终影响到免疫系统的正常发育，造成畜禽抗病能力下降、疾病多发甚至死亡。
目前广泛运用于畜牧生产上的抗氧化剂如壳寡糖、茶多酚等，其抗氧化作用都是通过调控抗氧化酶活性来清除过多的ROS，然而单纯依靠直接清除ROS并不能从根本上修复氧化损伤，也不能持久地发挥缓解氧化应激引起的病理状态的作用。最新研究发现猪氧化应激后会导致线粒体功能损伤，并观察到线粒体自噬水平升高的现象，而氧化应激引起的代偿性的线粒体自噬不足以修复氧化应激造成的机体损伤，至今还未见通过调控线粒体自噬来缓解猪氧化应激的报道。然而，线粒体自噬也是把双刃剑，过度或者紊乱的线粒体自噬会导致细胞内线粒体过度降解，引起细胞能量代谢障碍，甚至细胞死亡。因此开发一种精准调控线粒体自噬来缓解猪氧化应激的添加剂对养猪生产具有现实的应用价值和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂。
一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂组成为：丁酸盐6～13重量份、牛膝多糖1～3重量份、甜菜碱5～10重量份、钠基蒙脱石30～60重量份。
在本发明中，丁酸盐、牛膝多糖和甜菜碱通过市购的方式获得。
所述的丁酸盐为丁酸钠或三丁酸甘油酯。丁酸盐可市场采购，如济南安姆生物技术有限公司，上海美农生物科技股份有限公司等。
所述的牛膝多糖为多年生草本苋科植物牛膝AchyranthesbidentataBlume根的提取粉。牛膝多糖可市场采购，如西安天瑞生物技术有限公司，宁夏香草生物技术有限公司等。
所述的钠基蒙脱石的制备方法：将蒙脱石矿物，连同相当于矿物重量5％～15％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为10％～20％的悬浮液矿浆，室温钠化10～15小时，水洗5～7次，过滤或离心脱水；将所得的滤饼烘干、粉碎过筛，得到质量纯度≥90％，吸蓝量≥40.0g/100g，粒径(D50)≤10.0um的粉末状钠基蒙脱石。
本发明还可以提供一种含有上述线粒体自噬调控剂的饲料。该饲料中线粒体自噬调控剂的添加量为0.03wt.％～0.15wt.％。
本发明的缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂具有以下特点：
(1)与饲料中单独添加丁酸盐、牛膝多糖、甜菜碱和钠基蒙脱石相比，本发明缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂可显著降低肝脏、肠道线粒体活性氧产量和过氧化产物丙二醛的含量，促进氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I的表达，显著提高猪肝脏、肠道线粒体DNA的含量与线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性。
(2)丁酸盐、牛膝多糖、甜菜碱与钠基蒙脱石在缓解肝脏、肠道氧化应激，提高肝脏、肠道中线粒体自噬水平上存在显著交互作用，有正的协同组合效应。
(3)钠基蒙脱石对丁酸盐、牛膝多糖、甜菜碱有控释作用，使之易于与饲料混合，形成均匀分散系，使用方便。
(4)本发明的缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂通过各成分的协同效应，显著提高猪线粒体自噬水平，进而显著缓解猪氧化应激。
具体实施方式
本发明结合以下实例作进一步的说明。
下述各实施例中的试剂、材料均可以采用市售产品或者通过现有技术报道的方法制备，不做限定。
其中，下述各实施例中的钠基蒙脱石的制备方法：将蒙脱石矿物，连同相当于矿物重量5％～15％的氯化钠，加水搅拌均匀，制成浓度为10％～20％的悬浮液矿浆，室温钠化10～15小时，水洗5～7次，过滤或离心脱水；将所得的滤饼烘干、粉碎过筛，得到质量纯度≥90％，吸蓝量≥40.0g/100g，粒径(D50)≤10.0um的粉末状钠基蒙脱石。钠基蒙脱石的的理化参数可通过调节各组分比例和制备工艺参数实现。当然，在其他实施例中，钠基蒙脱石也可以采用市售产品，也具有类似效果。
实施例l
制得的钠基蒙脱石为质量纯度为95％，吸蓝量为50g/100g，粒径(D50)为5um的钠基蒙脱石。
取丁酸钠6公斤、牛膝多糖3公斤、甜菜碱5公斤、钠基蒙脱石30公斤混合拌匀，即得一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂(Mitophagy regulator relieving oxidativestress in piglets，MROSP)。在猪饲料中的添加量为0.03wt.％。
试验将42头平均体重为9kg的35日龄“杜×长×大”断奶猪随机分为7个处理组，分别为：对照组、氧化应激组、丁酸钠组(氧化应激+丁酸钠)、牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)、甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)、钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)、MROSP组(氧化应激+MROSP)，每个处理组6头猪。其中：对照组的断奶猪喂食常规的猪饲料；氧化应激组对断奶猪用Diquat处理，其剂量为10mg/kg体重，然后喂食常规的猪饲料；丁酸钠组(氧化应激+丁酸钠)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为10mg/kg体重，然后喂食添加了丁酸钠的猪饲料；牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为10mg/kg体重，然后喂食添加了牛膝多糖的猪饲料；甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为10mg/kg体重，然后喂食添加了甜菜碱的猪饲料；钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为10mg/kg体重，然后喂食添加了钠基蒙脱石的猪饲料；MROSP组(氧化应激+MROSP)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为10mg/kg体重，然后喂食添加了0.03wt.％MROSP的猪饲料。丁酸钠组(氧化应激+丁酸钠)、牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)、甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)、钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)中所添加组分在饲料中的含量与MROSP组(氧化应激+MROSP)的饲料中对应组分含量一致。饲养试验持续10d。
与丁酸钠组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP有效地缓解了猪氧化应激，表现为猪肝脏、空肠MDA含量和线粒体ROS产量显著下降(P<0.05)。且丁酸钠、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石，在缓解猪氧化应激，即肝脏、空肠MDA含量和线粒体ROS产量上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP能明显缓解猪肝脏、肠道氧化应激。
与丁酸钠组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP组肝脏、空肠中线粒体自噬水平显著升高，表现为肝脏、空肠中线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I的显著表达提高(P<0.05)。丁酸钠、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石在提高猪氧化应激后线粒体自噬水平，即线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I表达上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著提高了氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体自噬水平。
与丁酸钠组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP组肝脏、空肠中线粒体功能显著提高，表现为猪肝脏、空肠线粒体DNA含量、线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性显著增加(P<0.05)。丁酸钠、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石在改善肝脏、空肠中线粒体功能，即线粒体DNA含量和线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性表达上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著改善了氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体功能。
由上述结果可知，猪饲粮中添加缓解氧化应激的线粒体自噬调控剂，可显著提高猪线粒体自噬水平，保护线粒体功能，进而显著缓解猪氧化应激。
实施例2
制得的钠基蒙脱石为质量纯度为93％，吸蓝量为48g/100g，粒径(D50)为8um的钠基蒙脱石。
取三丁酸甘油酯9公斤、牛膝多糖1公斤、甜菜碱10公斤、钠基蒙脱石60公斤混合拌匀，即得一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂(Mitophagy regulator relievingoxidative stress in piglets，MROSP)。在猪饲料中的添加量为0.15wt.％。
试验将42头平均体重为9kg的35日龄“杜×长×大”断奶猪随机分为7个处理组，分别为：对照组、氧化应激组、三丁酸甘油酯组(氧化应激+三丁酸甘油酯)、牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)、甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)、钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)、MROSP组(氧化应激+MROSP)，每个处理组6头猪。其中：对照组的断奶猪喂食常规的猪饲料；氧化应激组对断奶猪用H2O2处理，其剂量为10％H2O2(1mL/kg)体重，然后喂食常规的猪饲料；三丁酸甘油酯组(氧化应激+三丁酸甘油酯)对断奶猪用H2O2处理，其剂量为10％H2O2(1mL/kg)体重，然后喂食添加了三丁酸甘油酯的猪饲料；牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)对断奶猪用H2O2处理，其剂量为10％H2O2(1mL/kg)体重，然后喂食添加了牛膝多糖的猪饲料；甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)对断奶猪用H2O2处理，其剂量为10％H2O2(1mL/kg)体重，然后喂食添加了甜菜碱的猪饲料；钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)对断奶猪用H2O2处理，其剂量为10％H2O2(1mL/kg)体重，然后喂食添加了钠基蒙脱石的猪饲料；MROSP组(氧化应激+MROSP)对断奶猪用H2O2处理，其剂量为10％H2O2(1mL/kg)体重，然后喂食添加了0.15wt.％MROSP的猪饲料。三丁酸甘油酯组(氧化应激+三丁酸甘油酯)、牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)、甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)、钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)中所添加组分在饲料中的含量与MROSP组(氧化应激+MROSP)的饲料中对应组分含量一致。饲养试验持续7d。
与三丁酸甘油酯组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP有效地缓解了猪氧化应激，表现为猪肝脏、空肠MDA含量和线粒体ROS产量显著下降(P<0.05)。MROSP组能明显缓解猪肝脏、肠道氧化应激(P<0.05)。且三丁酸甘油酯、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石，在缓解猪氧化应激，即肝脏、空肠MDA含量和线粒体ROS产量上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著缓解了猪肝脏、肠道氧化应激。
与三丁酸甘油酯组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP组肝脏、空肠中线粒体自噬水平显著升高，表现为肝脏、空肠中线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I的显著表达提高(P<0.05)。三丁酸甘油酯、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石在提高猪氧化应激后线粒体自噬水平，即线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I表达上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著提高了氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体自噬水平。
与三丁酸甘油酯组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP组肝脏、空肠中线粒体功能显著提高，表现为猪肝脏、空肠线粒体DNA含量、线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性显著增加(P<0.05)。三丁酸甘油酯、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石在改善肝脏、空肠中线粒体功能，即线粒体DNA含量和线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性表达上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著改善了氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体功能。
由上述结果可知，猪饲粮中添加缓解氧化应激的线粒体自噬调控剂，可显著提高猪线粒体自噬水平，保护线粒体功能，进而显著缓解猪氧化应激。
实施例3
制得的钠基蒙脱石为质量纯度为94％，吸蓝量为45g/100g，粒径(D50)为7um的钠基蒙脱石。
取丁酸钠13公斤、牛膝多糖2公斤、甜菜碱7公斤、钠基蒙脱石50公斤混合拌匀，即得一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂(Mitophagy regulator relievingoxidative stress in piglets，MROSP)。在猪饲料中的添加量为0.1wt.％。
试验将42头平均体重为9kg的35日龄“杜×长×大”断奶猪随机分为7个处理组，分别为：对照组、氧化应激组、丁酸钠组(氧化应激+丁酸钠)、牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)、甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)、钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)、MROSP组(氧化应激+MROSP)，每个处理组6头猪。其中：对照组的断奶猪喂食常规的猪饲料；氧化应激组对断奶猪用Diquat处理，其剂量为12mg/kg体重，然后喂食常规的猪饲料；丁酸钠组(氧化应激+丁酸钠)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为12mg/kg体重，然后喂食添加了丁酸钠的猪饲料；牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为12mg/kg体重，然后喂食添加了牛膝多糖的猪饲料；甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为12mg/kg体重，然后喂食添加了甜菜碱的猪饲料；钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为12mg/kg体重，然后喂食添加了钠基蒙脱石的猪饲料；MROSP组(氧化应激+MROSP)对断奶猪用Diquat处理，其剂量为12mg/kg体重，然后喂食添加了0.1wt.％MROSP的猪饲料。丁酸钠组(氧化应激+丁酸钠)、牛膝多糖组(氧化应激+牛膝多糖)、甜菜碱组(氧化应激+甜菜碱)、钠基蒙脱石组(氧化应激+钠基蒙脱石)中所添加组分在饲料中的含量与MROSP组(氧化应激+MROSP)的饲料中对应组分含量一致。饲养试验持续14d。
与丁酸钠组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP有效地缓解了猪氧化应激，表现为猪肝脏、空肠MDA含量和线粒体ROS产量显著下降(P<0.05)。且丁酸钠、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石，在缓解猪氧化应激，即肝脏、空肠MDA含量和线粒体ROS产量上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP能明显缓解猪肝脏、肠道氧化应激。
与丁酸钠组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP组肝脏、空肠中线粒体自噬水平显著升高，表现为肝脏、空肠中线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I的显著表达提高(P<0.05)。丁酸钠、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石在提高猪氧化应激后线粒体自噬水平，即线粒体自噬标志蛋白PINK1、Parkin、LC3II/LC3I表达上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著提高了氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体自噬水平。
与丁酸钠组、牛膝多糖组、甜菜碱组、钠基蒙脱石组相比，MROSP组肝脏、空肠中线粒体功能显著提高，表现为猪肝脏、空肠线粒体DNA含量、线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性显著增加(P<0.05)。丁酸钠、牛膝多糖、甜菜碱、钠基蒙脱石在改善肝脏、空肠中线粒体功能，即线粒体DNA含量和线粒体氧化呼吸链复合物IV的活性表达上存在显著交互作用(P<0.05)。上述结果表明，MROSP显著改善了氧化应激后猪肝脏、肠道线粒体功能。
由上述结果可知，猪饲粮中添加缓解氧化应激的线粒体自噬调控剂，可显著提高猪线粒体自噬水平，保护线粒体功能，进而显著缓解猪氧化应激。

Claims (6)

1.一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂，其特征在于其组成为：丁酸盐或三丁酸甘油酯6～13重量份、牛膝多糖1～3重量份、甜菜碱5～10重量份、钠基蒙脱石30~60重量份。
2.根据权利要求1所述的一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂，其特征在于，所述的丁酸盐为丁酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂，其特征在于，所述的牛膝多糖为多年生草本苋科植物牛膝AchyranthesbidentataBlume根的提取粉。
4.根据权利要求1所述的一种缓解猪氧化应激的线粒体自噬调控剂，其特征在于，所述的钠基蒙脱石为质量纯度≥90％，吸蓝量≥40.0g/100g，粒径D50≤10.0um的粉末状钠基蒙脱石。
5.一种含有如权利要求1~4任一所述线粒体自噬调控剂的饲料。
6. 如权利要求5所述的饲料，其特征在于，饲料中线粒体自噬调控剂的添加量为0.03wt.%~0.15wt.%。
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